南美白对虾六种流行病病原要点
文/叶红梅1 李慧2
天津市水产技术推广站在2017年～2019年3年间使用恒温荧光法快速试剂盒，对本市养殖南美白对虾9个区的养殖企业及养殖户送检与抽检的种虾、虾苗、养殖过程中不同阶段的虾，进行了6种流行病病原指标检测。恒温荧光法准确率高，可有效缩短检测时间，在病害防治中能起到关键作用，有效推动当地水产低温空调
技术交流
性手套。实验过程应在生物安全柜中进行，没有生物安全柜的可划定专门区域，保证该区域干净整洁无污染。实验产生的所有废弃物需进行无害化处理。
1.鲜活的虾样：将从池塘中打捞的虾放入干净的塑料袋中或塑料瓶中，放入一定的养殖水，有条件的可以在袋内充氧，保证运输到实验室的虾为活体。用多层纱布滤掉虾体水分后将其放入干净的塑料袋或离心管中，编号备检。大一点的虾用剪刀剪去眼柄后，取包含肝胰腺组织的虾头部分进行检测，不能马上检测的要放入低温冰箱中保存。
2.濒临死亡的病虾：对于在池塘中已有发病症状但不能马上拿到实验室检测的虾，养殖户可将其打捞后放到干净的矿泉水瓶或塑料袋中低温冷冻保存，做好标记，实验前将其解冻，剪去眼柄后虾头留待检测。
提取过程要在环境整洁、器皿洁净下进行。因使用试剂纯度较高，试验人员操作要准确。
1.水生动物病毒基因组（DNA/ RNA）的提取：将制备的虾样按照所购试剂公司试验操作规程进行提取。病毒基因组提取后的DNA/RNA如暂时不检测要放入低温冰箱中-80℃保存，一周内尽快检测。另外因为提取后的病毒基因组核酸溶液要做4项病毒检测，因此加入的DEPC水要取50μL以保证足够的提取量。
2.细菌基因（DNA）提取：按照说明书操作规程进行提取。不同于病毒基因提取的是其消化时间较长，经过碎化处理的虾样加入缓冲物（Buffei STE和 SDS）及蛋白酶K后，一般水浴3小时消化完全。提取的DNA保存于2℃～8℃，长期保存需低于-20℃。
（四）检测y型钢
以提取的DNA作为模板，加入核酸检测试剂盒中的反应液、聚合酶、密封液后，分别进行WSSV、IH
HNV、AHPND/EMS、EHP特异性PCR检测，并设置阳性对照、阴性对照。检测“对虾血细胞虹彩病毒”及“对虾偷死野田村病毒”2种病毒时需要在提取的DNA模板中加入逆转录酶得到cDNA后再进行上述操作。检测仪器采用恒温扩增荧光检测仪。
检测原理是采用恒温扩增技术，通过聚合酶及特异性引物在恒温条件下对病原核酸片段进行特异性扩增，扩增产物（DNA）与核酸染料结合后发出荧光信号，根据所产生的扩增曲线判断结果。
需要特别注意是太阳光不能直射检测机器，防止强光下仪器将阴性样品检测出假阳性。可拉上窗帘做遮光处理。
各病原指标上机检测所需体积及扩增温度、反应时间见表1。
除虾血细胞虹彩病毒（SHIV）和虾肝肠胞虫（EHP）反应时间为45分钟，其余4项指标反应时间为60分钟。
二、检测结果与讨论
笔者3年间共检测南美白对虾虾样401个，包括虾苗及养殖中不同阶段的虾。
（一）年度阳性样品检出率为：
2017年为IHHNV>AHPND/EMS>EHP>WSSV>CMNV，IHHNV阳性检出率最高；2018年为EHP>IHHNV>AHPND/EMS>CMNV>WSSV，EHP检出率最高；2019披肩按摩器
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河道生态护坡年为HP>AHPND/EMS>CMNV>IHHNV>WSSV，EHP检出率最高。2018年、2019年虾肝肠胞虫（EHP）检出率高，说明种虾本身携带EHP病原，孵化时垂直传播给虾苗或孵化池消毒不彻底水体中病毒水平传播给虾苗。
（二）3年间阳性样品检出率
爆震弹1.WSSV：17.8%（2017年）>16.3%（2019年）>15.1%（2018年），3年内都有检出，但变化不大；
2.IHHNV：49.5%（2017年）>25.6%（2018年）>18.3%（2019年），3年内呈逐年下降的趋势；
3.CMNV：15.0%（2017年）＜17.4%（2018年）＜25.5%（2019年），3年内呈逐年上升的趋势。
4.SHIV：2019才开始检测SHIV。因为只检测34个样品，显示阳性样品4个，检出率11.8%。出现的阳性样品是同一家单位且同一个池塘的2种虾样（小龙虾和南美白对虾），经过复检仍为阳性，说明此病毒出现几率少但可以水平传播；
5.AHPND/EMS：32.7%（2017年）>24.4%（2018年）>22.6%（2019年），3年内呈逐年下降的趋势；
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