第46卷第5期
141年5月分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO I omal of Ewmmectal Analysis )Vol. 46 No. 5765〜711
doi : 10. 3969/j. issn. 1004 -4957. 2221. 05. 012
卢 瑶44 ，牛卫东5，徐 瑾4 ，李玉林4 ，王继创4
，李永伟5，张恒6 ，王云龙271 *
*收稿日期：2727 -08 -67；修回日期：2222 -26 -01
基金项目：郑州市新型冠状病毒防控应急科研项目(2627YJGG0067)；河南省新型冠状病毒防控应急科研攻关专项(271176517376)*通讯作者：王云龙，教授，研究方向：生物制药，E - mail : ************
(1.新乡医学院 医学检验学院，河南 新乡453000； 7.河南省生物技术研究中心，河南 郑州450000；3.郑州市疾病预防控制中心，河南郑州450000； 4.河南省疾病预防控制中心，河南郑州450000； 5.河南中医药大学 第二临床医学院，河南 郑州454000； 6.河南省职工医院，河南 郑州450000；
太阳能淋浴器
7.郑州职业技术学院，河南郑州450000)
摘 要：基于截短新型冠状病毒(Severe Acute Respirato/ Sykdromo Co/axvirus 7 , SARS - CoV -2)N 蛋白和全 长N 蛋白，采用荧光免疫层析技术，建立了一种高灵敏度快速评价新型冠状病毒肺炎患者体内SARS-CoV- 2抗体水平的方法。以荧光微球为标记物制备试纸条，进行阴性和阳性检测并选岀较优抗原配对组合。初步 评价了其精密度与稳定性，并与已上市的检测方法进行对比。根据阴性和阳性检测结果优选截短N 蛋白标 记，全长N 蛋白包被组合，所建立的方法可以在4 mm 内完成SARS - CoV-7抗体水平的检测，能够有效 区分阴阳性，批内精密度CV 为3. 43% - 10. 05% ，批间精密度CV 为4. 27% - 11. 73%。试纸条在37 C 条件 下能够稳定保存21 d s 与胶体金检测法一致性较好，总符合率为66. 11% ，阳性符合率为90.63%，阴性符合 率为67. 52%。该研究基于截短N 蛋白初步建立的荧光免疫层析检测方法能有效评价患者体内的SARS -CoV - 5抗体水平，具有良好的精密度和稳定性，便于在基层医疗单位推广，有较好的应用前景。 关键词：新型冠状病毒；新型冠状病毒肺炎；N 蛋白；荧光免疫层析；检测
中图分类号：0657.3 文献标识码：A 文章编号：1004 -4957(2071 )05 -0705 -07
App/caCoo of TrnncoteC SARS - CoV - 7 N Protein in Flnoresceccc
Immnnochmmatoomphy
LUY/O 42 , NIUW/Dog 5 , XU J/7 , LI Yu OU 2 , WANGJCchu/g 2 ,
LI Yong-Dei 5 , ZHANG Heng 2 , WANG Yun-Wng^71 *
(1. School of La/oratorg Mediciue , Xinxiang Medical University , Xioxiang 453000 , Chiux ； 7. He/ac Bioeugiuee/ng Research Ce/tor , Zhe/gzhoc 454000 , Chiux ； 3. Zhe/gzhoc Ce/tor Or Disease CoaWci and Preve/Ooa , Zhe/gzhoc 454000 , Chiux ； 4. He/ac Ce/tor for Disease CoaWci and Preve/Ooa , Zhe/gzhoc 454000 , Chiux ； 5. Secoad C/acxi Medical Colleyo , He/ac University of Chiueso Mediciue , Zhe/gzhoc 454004 , Chiux ； 6. He/ac Geuerai
Hospital, Zhe/gzhoc 454000 , China ； 7. Zhe/gzhoc Technical Colleyo , Zhe/gzhoc 454000 , China )Abstract : A OmxmsoWX immuia/uo/scxco chmmatoyra/ha was xOd/shX for the rapid and sensibvv of SARS - CoV - 7 antidoPa level in patients suffe/ng Co/cx Vims Disease 2719 , with / tmncateC severe acute respirato/ syud/mc co/cxvim- 2(SARS - CoV -7) N p/tein and / full-Wngth SARS - CoV -7 N p/tein. The test strip carbs were prepared with muo/scoct mi-c/suPercs as mar/ers , which were assembled for neyativa and positiva detection to pick out the supc- /or anOpec paiong combination. Meanwhile , the precision and sta/iCtp of the optimized test strip carb were further /aW/X Or preliminary peWopnanco , and comp/X with t
hose of the mar/eted SARS - CoV -7 antidoPa detection mcthoO on this basis. According to the n/COv and pos/iva U- Octioc results , prefera/la , the truncated N p/tein was la/eWd and the mil-Wngth N p/tein was coo- tX. This methoO cocId complete the detection of SARS - CoV - 7 —ti/opy Wvai within 17 minotes ,and could XXtOXy dis/nguish the neyativa and positOv results. The iamDssay precision CV was between 3. 45% and 17. 05% , and the Umwossay precision CV was between 7. 77% and 4. 73% .
7206分析测试学报第44卷
The st/ps could be s/dly stored at37°C for21days.The detection results bp this methoC were wW l correlated with those bp colloidal yolb assap；with a total coinPUwce ole of99.13%,a positive ce-iuPPwce oO of99.63%and a nepaUva coincibeace rale of97.56%,ospwhw-y.The muoos-ceace immugcVomTogopUic assap po/migOy w/P/shW based on toncated N poteix could2-fective-o evaluate the SARS一CoV一2antiUoCo level in patieals with yood precisOc and stabi/ty；
which was cocveaieal for poculadzaUoc in pdmao care units and had a yood app/catioc pospecb
Key words:Severe Acute Respiratory Syudome Coocavios2（SARS一CoV- 2-；Cooca Vios Disease2010（COVIN-4-；N poteix；muooscwce immugcVomTogopUo；detection
2210年K月以来，武汉市部分医院相继报告了多例无法解释的肺炎。由于春节期间人口流动性很高，2222年、月该肺炎迅速传播到整个中国［］，同时证实其是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2 ，以
前称为2019-nCoV）引起的急性呼吸道疾病［2］，并被命名为新型冠状病毒肺炎（COVID-10）o2222年、月30日，世界卫生组织（WHO）正式宣布COVIN-K已经成为国际关注的突发公共卫生事件［5］。到目前为止，这种疾病已经迅速传播到中国的其他地区和66个国家。在中国新病例数量有所减少的情况下，美国、意大利和西班牙在内的其他国家的新病例却呈指数增长⑷。传染源主要是SARS-CoV-2感染患者，包括无症状感染者。该疾病的传播途径主要为直接传播、气溶胶传播和接触传播2「4］。SARS_CoV-2感染患者通常表现为肺炎样症状（发热、干咳和呼吸困难等）和腹泻等胃肠道症状，其次为严重急性期呼吸道感染，部分病例会出现急性呼吸窘迫症合并严重呼吸道并发症，甚至导致死亡［「5］。至今已研发出多种针对COVIN-K的疫苗，但仍没有特定的药物方案出现，早期诊断并及时管控，是阻止疫情进一步散播的关键2］。因此，加强疫情监控，及时筛查并确诊SARS-CoV-6感染者是疫情防控的首要任务［4］。
目前对COVIN-10患者的检测主要采用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）法、化学发光法以及胶体金法。荧光定量PCR法检测人体内提取出的核酸时灵敏度较低，容易出现假阴性，同时由于此类方法的检测时间长，对于检测环境的要求高，不宜于基层医院普及［1］；化学发光法和胶体金法方便快速,
成本低，应用范围广，技术难度系数相对较低，但存在灵敏度较低等局限22］。近年来荧光层析免疫技术不断成熟，该技术操作简便、易自动化，可有效排除非特异荧光的干扰，分析灵敏度有了很大高［3］。
SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白是一种丰富的RNA结合蛋白，可在病毒的生命周期中发挥多种作用2/］。N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体即能产生抗N蛋白的高水平抗体。目前已在确认的COVIN-K患者稀释度不同的血清中检测到针对N蛋白的IgG和IgM抗体存在，该结果进一步证实可以利用N蛋白建立快速检测SARS-CoV-2的血清抗体方法［5］。但靶向保守的Nib和N2b结构域的患者抗体可能与相关冠状病毒如SARS-CoV的核衣壳发生交叉反应，特异性较低24］。河南省生物工程技术研究中心制备的截短N蛋白（NC蛋白）截取了SARS-CoV-2N蛋白C 末端301-210的K2个氨基酸对应片段，相较于N蛋白的全长片段（NF蛋白）具有较强的特异性。因此可基于这两种蛋白进行研究，根据配对检测结果选择较优组合。
本研究基于NC蛋白建立了SARS-CoV-2抗体荧光免疫层析检测方法，通过对其精密度和稳定性进行评价，配合相应的荧光分析仪，实现了人体内SARS-CoV-2抗体水平的评价。整套系统操作简便，成本低廉，能够在K mm内即时完成检测，大大降低了检测时间，可有效提升复工复学体的检测。
1实验部分
1.1试剂与仪器
荧光微球（FMs：美国Bangs Lab公司-,1氨3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-三基丁二酰亚胺（NHS）（中国AUddix公司-,2-（N-吗咻）乙磺酸一水合物（MES）缓冲液、样品稀释液、包被液、微球保护液、微球封闭液、羊抗鼠IgG、鼠IgG、NF蛋白、BLL1（DE3-/hET2K-NC菌株、SARS-CoV-2阴性样本和免疫NC抗原两周的兔血清（中国河南省生物工程技术研究中心）。
第3期卢瑶等：截短新型冠状病毒N蛋白在荧光层析法上的应用747
PVC板和吸水纸（匸成纸业），玻璃纤维素膜（中国JY Biotech公司）,XYZ三维点膜喷.和脑自动斩切机（生物科技公司），免疫层析4航科技
公司），高电流电泳仪（美国BU-Rad公司）。
1.2实验原理
本实验抗夹心法检测血清中SARS-CoV-7抗体的水平。将待测血清和样本稀释液按照一定合后样，的SARS-CoV-7抗体会和结合的记抗原结合形成抗-抗体复合物，细作用沿析方向移动，随后析作渐 素膜（NC膜）上移动，最后定在检测线（T线）上的抗原特异性地捕获，形成抗原-抗体-抗原复合物，而鼠EG继续移动与质（C线）上的羊抗鼠EG抗体结合。理如图、所示。当检测卡插检测仪后，仪器自
动读取检测卡上T C线的荧光信号强度，T/C值可表示待测血清中SARS-CoV-2抗体的水平[7]o
图1SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条原理图
Fig.1Tdo schematic diag/m of SARS-CoV-2muo/scect immunoch/matog/phic strip •FMs-j laXeleC actigen)丫FMs-j moose IgG)
Coated actigen▼Goat-ypti-mocso IgG▼SARS-CoV-2antibody FMs-(WUeWC actigen) -j SARS-CoV-2aa/ody)FMs-j laPeled active/)基SARS-CoV-2acti/ody)(coated actigen-
FMs-j moose IgG)-j coat-ypti-moose IgG)
1.3NC化
1:100接种菌株BL21（DE3）/pET21b-NC于42L Lu/e-Bertaut j LB）液体培养基中（含40 R C/mL氨h青霉素），37C条件下振荡培养至0D64n m~4.3〜1.2。温度降至4C后，加入异丙基硫半乳糖昔（ATG）至终浓度0.7mmoWL并诱导20h,8000r/mic离心10min收集菌体,20mmoWL T/s）pH8.0 ,300mmol/L NaCt）缓冲液重悬菌体，超声破碎（254W，超声3-，间隙3s）20min, 12000r/mic离心10min，收，滤纸后上样Ni2*亲和层析柱。
1.4荧光活化
取1%固含量的200an荧光微球3r L于45mL离心管中，加入1mL纯化水后在4000r/mic 条件下离心4m/o弃上清液后加入1mL20mmoWL MES（pH6.4）缓冲液振荡混匀，再加入4my/ mL EDC溶液34r L，振，继续加入20my/mL NHS溶液6r L，水声120s混匀。将其置于台式恒温振活化30min，然后在4000dmic条离心4min，后1mL20 mmoWL MES（pH6.0）缓冲液，超声混匀。
1.5荧光偶联物
在上述溶液中加入待标记抗原30Rg振荡混匀，避光条件下偶联1h，继续加入20Ry鼠UG，避光条件下偶联1ho偶联完成后，于4000r/mic条件下离心4min，弃上清液，加入封闭液1mL，超声条1h。成的荧光微球于4000r/mic条离心4min，球保护液1mL，超声混匀。
728分析测试学报第44卷
1.6试
将包被抗羊抗鼠CG喷素膜的T C线上，质量浓度均为0.5my/mL，间隔4mm，置于真空干燥箱中抽真空干燥2h。将制备的荧光微球偶联物稀释后用XYZ喷金划膜仪喷涂结合，置真空空5h。将样品垫、结合垫以及吸水纸按定顺PVC 板上，脑自动斩切机将的PVC板切成度为3.0mm的试纸条(试纸条结意图如图2所示)，将试纸条特定的塑料检测卡中，以压卡机压紧检测卡，置待用。
间戊二烯Sample pad I Conjugate pad Test line NC membrane Absorbent pad
Control line PVC plate
图2SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条结构示意图
Fig.2Stocturol diagom of SARS-CoV-2/nooscent immudochomatogophie strip
1.7试检测
在室温下将待测血清和样本稀释液按照一定比例混合，用移液器吸取6p L稀释后的血清，垂直悬空样品，K min后免疫层析检测，应的T、C值。：样品中是SARS-CoV-2抗体,C线都应条带，否则试纸条检测结果判定为无效。试纸条检测结意图如图3所示23］。
图3SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条检测结果示意图
Fig.3Schematic diagom of detectioc results by SARS-CoV-2/norescent immudochomatoyraphie strip
2结果与讨论
2.1NC蛋白的制备及纯化
电厂脱硫滤布>盲源分离本实验重组菌株BL2、(DE3)/pET01b-NC进行培养后，鎳亲析蛋白，以含40mmoUC咪卩坐的20mmoUC Tds(pH8.4,300mmoUC NaCl)缓冲液洗涤杂蛋白，含340mmol/C咪卩坐上述Tds的缓冲液洗脱目的蛋白。20mmoUC TdsgpH8.0)缓冲液透析目的蛋白除去咪卩坐和NaCl后，以十二烷-聚丙烯胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，结果见图4o后单一的目的条带，大小约K UDo
2.2抗原筛选
本实验选择NF蛋白以及NC蛋合，使用时间分辨免疫层析阴性和阳性评综合筛选出较优抗合。抗方式为，均选择NF蛋白作为抗原，o组使用NF标记,b组使用NC标记，按照“44”、“45”以及“42”中的方法制备试纸条。
阴性检测时将50份待检测阴性样本(Nl-N54)使用样本稀释液稀释4倍后检测，T值小于500，且T/C小于
0.05即为符合要求；计算T/C值的平均值(X)和标准差(SD)，步求变异(CV)。阴性样本为实验室前期收 ，他发热伴呼吸状病例33份。结果见
第3期卢瑶等：截短新型冠状病毒N蛋白在荧光层析法上的应用749无水洗手液
1,&组（NF包被,NF标记）阴性样本47份
为阴性，T/C值的CV大于15%,b组（NF,
NC标记）阴性样本54份判为阴性，T/C值的
CV在4%以内。由此可见，b组阴性检测结:
优。阳性检测生物技术股份有
公司生产的冠状病毒抗体检测试（胶体
）对稀释4倍的检测，检测结
为强阳性，因此该步检测。
将兔血清稀释4、20、3、6、44倍，并编
号为Pl、P2、P3、P4、P5，使用研制的试剂卡进
检测，T值大于1000，且T/C大于0.1即为符合
要求；同时设置平，此样本稀
真空海绵吸盘
释稀释，直至检测结果不符合阳性
检测标准，结果见表7o a组（NF包被，NF标记-
P3（血清稀释至44倍时）样品的T值仍大于1000 , T/C大于0.1,P4（血清稀释至6倍）样品的T 值小于1000，不符合阳性检测标准；b组（NF包NC标记）P4（血清稀释至80倍）样品的T值大于1000，且T/C大于0.1,P5（稀释至44倍）
图4NC蛋白的SDS-PAGE鉴定结果
Fig.4SDS-PAGE analysis of NC p/teic
M.protein molecular weigdt marbor； 1.BD(DE3-/pETd7-NC doc-inducteC； 2.BL21(DE3)/pET21b-NC CiducteC with I2TG Or overnight； 3.purified NC protein
样品的T值小于1000，不符合阳性检测标准。由此可见，b组的灵敏度优于a组。综合阴性和阳性检测结果，选择b组（NF包被,NC标记）抗原配对组合进行性能检测。
表1SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条阴性检测结果
Ta/lo1Neyative detection results of SARS-CoV-2muo/scect immuuoch/maOgmphic strip
G/cp Nexative coidciCe/co rate
T/C value
Mean Standarb deviation CoeXicie/t of va/atiox/%
a47/340.0270.005317.2 b50/540.02330.003010.6
表2SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条阳性检测结果
Ta/lo2Positive detection results of SARS-CoV-2muo/scect immuuoch/maOgmphic strip
Sam/lo
a b
C value T value T/C value C value T value T/C value
P1128374020.5761424142000.9964
P21207137210.3083102785440.5434
P3116417230.1446696527930.2303
P413448960.06801086313620.1250
P511365480.036841218120.0730
2.3精密度实验
本实验选择N2、N4、P1、P3以及P55份样本，分别对同批次试纸条进行批内精密度检测，再分3个不同的试纸条间精密度检测，待检样本重复检测4次。计算待检样本的CV值，间精密度考察，结果见表3o各样品T/C值的CV为3.43%-10.05%；批间各样品T/C值的CV为4.2%〜11.73%。以间的CV均小于4%，在允许
。
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