相关仪器的信息:
透射电镜:JEOL(公司) JEM-1230(型号) TEM,产地:日本
超薄切片机:Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome,产地:奥地利
扫描电镜:Philips XL30 ESEM,产地:捷克
临界点干燥仪:Hitachi HCP-2 Critical point dryer,产地:日本
真空喷镀仪:Eiko IB5 ion coater,产地:日本
体育馆看台膜结构
包埋剂:SPI-CHEM Spurr resin,产地:USA 一、 取材:
1、动作迅速:组织离体后,应将其快速放入固定液中,使组织细胞尽可能保持原来的生活状态; 2、减少损伤:选择锋利切割器械,减少牵拉或挤压组织;
3、组织块大小:一般要小于1mm3。
二、固定:固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞
的过程,目的是尽可能保持细胞的原有生活状态,不发生位移,减少组织结构变化。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。
1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面,应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中 2、使用锇酸的注意事项
I 通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液,使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。
II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂,必须在通风橱中操作,废液必须收集在密闭容器中。第一次使用锇酸的同学,请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。
三、漂洗:应彻底漂洗干净,减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。
四、脱水:脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂,只有将生物组织中的游离水清除干净,包埋剂才能浸入组织。
脱水过程中应注意:
I 逐级脱水而不能急剧脱水;
II更换溶液时动作要快,特别是不要让组织离开溶液,否则会在组织内外产生气泡;
III脱水过程中若要长时间停留或过夜,应放在70%脱水剂中,并在
4℃保存。
五、渗透:渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂,使细胞内外
空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。
包埋剂配制及使用过程中的注意事项:
I 所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的;
II配制过程中应搅拌均匀,使用过程中应避免异物,特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂;
III配制好的包埋剂应密封保存,避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中,延长其使用期。
表1 戊二醛溶液的配制
终浓度 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 3.0 | 4.0 | 5.0 |
0.2M PBS/ml | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
25%戊二醛水溶液/ml | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 16 | 20 |
重蒸水加至/ml | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
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表2 0.2M磷酸缓冲液(PBS)的配制
A液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 | B液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液 |
Na2HPO4 28.4g 或Na2HPO4.H2O 31.61g 或Na2HPO4.2H2O 35.6g 或Na2HPO4.7H2O 53.63g 或Na2HPO4.12H2O 71.64g 加双蒸水至1000mL | NaH2PO4 24.0g 或NaH2PO4.H2O 27.6g 或NaH2PO4.2H2O 31.21g 加双蒸水至1000mL |
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按下表比例混合A、B液后,配成0.2mol/L的母液,其中pH7.0为常用配方
pH值 | 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 |
A液 | 8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7 |
B液 | 92.0 87.7 81.6 73.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.50 5.30 |
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在缓冲液中加入葡萄糖,蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。
表3 多聚甲醛-戊二醛固定液的配制
溶液名称 | 剂量 |
10%多聚甲醛溶液 | 20ml |
0.2MPBS或二砷酸盐缓冲液 | 50ml |
25%戊二醛水溶液 | 10ml |
重蒸水 | 20ml |
| 溶剂回收 |
表4 2%锇酸溶液的配制
表5 Spurr包埋剂配方
药品名称 | 硬配方 | 软配方 | 我们现用的配方 |
VCD树脂 | 10g | 10g | 10g |
DER736 | 6g | 7g 涤纶编织物浸水性能试验 | 锚杆测力计 8g |
NSA | 26g | 26g | 26g |
DMAE | 快门式3d0.4g | 0.4g | 0.4g |
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注:通过改变DER736的用量可以调节包埋剂的硬度。DMAE的用量则调节聚
合反应的速度。
透射电镜样品制备程序:
No.1 包埋切片样品的制作过程
样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜,然后按下列步骤处理样品: ✧ 倒掉固定液,用0.1M,pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min;
✧ 用1%的锇酸溶液固定样品1-2h;
✧ 倒掉固定液,用0.1M,pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min;
✧ 用梯度浓度(包括50%,70%,80%,90%和95%五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理,每种浓度处理15min,再用100%的乙醇处理一次,每次20min;最后过度到纯
丙酮处理20min。
✧ 用包埋剂与丙酮的混合液(V/V=1/1)处理样品1h;
✧ 用包埋剂与丙酮的混合液(V/V=3/1)处理样品3h;
✧ 纯包埋剂处理样品过夜;
将经过渗透处理的样品包埋起来,70℃加热过夜,即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片,获得70-90nm的切片,该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染15min,即可在日本JEOL公司的JEM-1230型透射电镜中观察。
1).Double fixation: The specimen was first fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three times in the phosphate buffer, once for 15min; then postfixed with 1% OsO4 in phosphate buffer (pH7.0) for 1hour and washed three times in the phosphate buffer.
2).Dehydration: The specimen was first dehydrated by a graded series of ethanol (5
0%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%) for about 15 to 20 minutes at each step, transferred to absolute acetone for 20 minutes.
3). Infiltration: The specimen was placed in 1:1 mixture of absolute acetone and the final Spurr resin mixture for 1hour at room temperature, then transferred to 1:3 mixture of absolute acetone and the final resin mixture for 3hours and to final Spurr resin mixture for overnight.
4).Embedding and ultrathin sectioning: Specimen was placed in capsules contained embedding medium and heated at 70℃ for about 9hours. The specimen sections were stained by uranyl acetate and alkaline lead citrate for 15 minutes respectively and observed in TEM of Model JEM-1230.
No.2 负染样品的制作(以细菌为例)
Negative staining of bacterium
The bacterium suspension was stained by 1 to 2%solution of phosphotungstic acid (PTA,
磷钨酸) in a pH range of 6.5 to 7.0 for 15 to 30 seconds. Then, the bacterium was observed in TEM of Model JEM1230.
SEM需前处理样品制备过程中的注意事项
I 取材:1cm3左右即可,不需要象TEM样品那么小;
II脱水:样品较大,脱水时间可适当延长;
III临界点干燥:一般采用液体二氧化碳为置换液,二氧化碳与乙醇或丙酮互溶性较差,而与醋酸异戊酯互溶液性较好。因此,样品脱水后需逐渐过渡到醋酸异戊酯溶液中浸泡,以便置换存留于组织中的脱水剂。
注意:醋酸异戊酯挥发性较强,应在通风橱中操作,废液用密闭容器装好后丢弃。
IV 金属喷镀:新鲜样品自身就可导电,而经过干燥的生物样品不能导电。这种不导电的样品在SEM中观察时,会产生电荷积累而影响观察稳定性。使样品导电的方法通常是在样品
表面喷一层厚度约100埃的金膜。
No.1直接观察的扫描电镜样品
I 样品粘附在样品台上,在Eiko IB5型离子溅射仪中喷镀4-5min。
II样品在荷兰Philips公司的XL30型ESEM(环境扫描电镜)中观察。
The specimen was coated with gold-palladium in Eiko Model IB5 ion coater for 4-5min and then observed in Philips Model XL30 ESEM.
No.2需前处理的SEM样品制备程序
样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜,然后按下列步骤处理样品:
✧ 倒掉固定液,用0.1M,dcdc电路pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min;
✧ 用1%的锇酸溶液固定样品1-2h;