浙江工业大学生物与环境工程学院
姓 名：
组 员：
学 号： 学 科： 食品科学与工程
所在院系：生物与环境工程学院
指导教师： 邱乐泉
2012 年12 月 1日填
摘要：
为了解酶的初步提取及纯化方法，并在此基础上掌握测定酶活力的原理和方法；用Folin-酚试剂、微量凯式定氮法测定蛋白质含量的原理和方法，SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量。除此之外，还要掌握高速离心机、Q-Sepharose柱层析法、紫外分光光度计、凯氏定氮仪、蒸馏装置、电泳等用法。
这一系列实验需要实验预制作——酵母的自溶，大约3天以后，酵母细胞壁破裂，胞液流出，经多次分别离心得到初提液A、热提液B和乙醇提取液C。利用Q-Sepharose柱层析法洗脱乙醇提取液C得到洗脱液D并在280nm处测D的吸光值，用葡萄糖测验试纸定性进行酶活力测试，发现洗穿透峰得到的第1、2管酶活力高，从第3管以后吸光值开始下降，且吸光值大的酶活力较大。得到4种酶提取液样品以后，便可以制作葡萄糖标准曲线，进行定量酶活力测定，葡萄糖标准曲线是一条直线，根据曲线回归方程计算4个样品的总活力单位数
和酶回收率，比较计算结果可以知道随着蔗糖酶的不断提纯酶的总活力单位数和酶回收率都减少。随后用Folin-酚试剂法测样品中蛋白质的含量，与用微量凯氏定氮法测定的结果进行比较，后者测出的总蛋白含量比前者大，并且知道随着酶的提纯，A、B、C、D4个样品的纯化系数升高，比活力升高，总酶活、总蛋白和蛋白回收率却在下降，其中A的蛋白质含量最高，D的纯化程度最高。最后用SDS-聚丙烯胺凝胶电泳法通过凝胶对样品的筛选分离、考马斯亮蓝的染、洗脱等步骤测量蛋白质分子和染料的迁移距离间接测定蔗糖酶的相对分子质量，得到2条蔗糖酶条带，计算的蔗糖酶相对分子质量。
关键词：蔗糖酶；提取纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮法；SDS-聚丙烯胺凝胶
Summary：
To understand the the enzymes preliminary extraction and purification methods, and on this basis to master the principles and methods of determination of enzyme activity; Folin-phenol reagent, trace Kay ceremony will be the principles and methods of nitrogen determination of the protein content, SDS-PAGE protein determination of therelative mole
cular mass. In addition, we must master the use of high-speed centrifuges, Q-Sepharose column chromatography, UV spectrophotometer, Kjeldahl instrument, distillation apparatus, electrophoresis.
This series of experiments requires experimental pre-production - yeast autolysis, about three days later, the yeast cell wall rupture, cytosolic outflow to the beginning of extracts A, after repeatedly respectively centrifugal heat extracts B and ethanol extract C. Using Q-Sepharose column chromatography to obtain an eluate D eluted ethanol extract C and the absorbance value of the 280nm measured at D, the enzyme activity test, and found to penetrate wash peak obtained with glucose tests strips qualitative 1,2 tube enzyme activity began to decrease from the absorbance values after 3 and suck the light value greater enzyme activity. Later to obtain four kinds of enzyme extraction fluid sample, it can produce a standard curve of glucose, quantitative enzyme activity assay, the glucose standard curve is a straight line, according to the regression equation to calculate the number of units and enzyme recovery of the total activity of the four samples, and comparing the calculated results You can know are reduced as the number of units of the
total activity of the purified enzyme sucrase continues and enzyme recoveries. Followed by the protein content in the measured samples of the Folin-phenol reagent method, micro Kjeldahl nitrogen method results were compared, which measured the total protein content than the former, and know with the purification of the enzyme, A, B, C, D4 samples purified coefficient increases, increased specific activity, the total enzyme activity, total protein and protein recovery is on the decline, wherein A is the highest protein content, D, the highest degree of purification. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel sample screening separation test brilliant blue staining, elution step measurement of protein molecules and dye migration distance Indirect determination of the relative molecular mass of sucrase get two the sucrase strip sucrase relative molecular mass, the calculated
Keywords: sucrase; extraction and purification; enzyme activity assay; Folin-phenol reagent; micro-Kjeldahl method; SDS-polyacrylamide gel
正文：
1、文献综述
腊肉烘干机
1.1
蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖[1]。随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度高的酶制剂。由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据你所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
2、实验原理、材料和方法
2.1 蔗糖酶的提取及初步提纯
2.1.1实验原理
酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。
2.1.2 试剂与器材
2.1.2.1试剂
①新鲜的啤酒酵母（冰冻在冰箱内，由实验室从啤酒厂买来）；
②醋酸钠（AR）；
③甲苯（AR）；
④4mol/L醋酸；
⑤95%乙醇（<-20℃）；
⑥0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml的蒸馏水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。
⑦0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液稀释10倍即得。
注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
2.1.2.2器材
①锥形瓶250ml（×1），50ml（×1）；
②量筒10ml（×1）25ml（×1）;
③烧杯100 ml（×1），1000 ml（×1）；
④具塞试管10 ml（×3）；
⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸；
⑥培养箱；
⑦恒温水浴箱；
⑧磁力搅拌器，搅拌子；
⑨高速冷冻离心机。
2.1.3操作方法
1． 酵母的自溶 ：培养60小时
2． 初提取液A
在培养箱中取出装有已自溶酵母的锥形瓶，经操作取上层液体记体积为VA=14.8ml。
3． 热提取液B： VBaveee=13.0ml。
4． 乙醇沉淀提取液C
2mc将热提取液B 倒入100ml小烧杯中，将烧杯放入冰浴中边搅拌边缓慢滴加98%的冰乙醇，30min后继续搅拌5min，离心，平衡（用50%的乙醇，对方加），用0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液溶解烧杯中的固体，与离心管中固体一起再次离心，得Vc=5.0ml。
2.1.4结果与分析
2.1.4.1结果
表2-1
提取液 | 颜状态 | 体积（ml） | 分析评价 |
A | 棕黄液体 | 25.62 | 过大 |
B | 橙黄液体d型管 | 24.00 | |
C | 淡黄液体 | 6.10 | 过小 |
| | | |
VA总=VA=25.62ml
VB总=VB·[V电能量采集终端A/(VA-3)]=24.0ml
VC总=Vc·[VA/(VA-3)] ·[VB/(VB-3)]=V一体化化粪池c·[VB总/(VB-3)]=6.1ml
2.1.4.2分析
在这次试验中，数据为初始数据，实验结果的真实可靠是以后实验的保障。我们的数据在A的时候偏大，C偏小，可能是因为我们离心过程的操作不是很正确，但是这不会影响到后续实验。
2.1.4.3结论
VA总=25.62ml ； VB总=24.0ml ； VC总=6.1ml。
2.1.5 注意事项
①第一次离心后取液体时要小心。重新离心后倒出液体留下固体。
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