一、实验目的
1． 了解单细胞蛋白的开发优势及技术现状。
2． 掌握单细胞蛋白的液体深层培养法及工艺控制规律。
3． 了解发酵过程中菌体浓度及生物量的一般检测方法。 二、实验原理
所谓SCP（Single Cell Protein）就是指那些工厂化大规模培养、作为人类食品和动物饲料的蛋白质来源的酵母、细菌、放线菌、霉菌、藻类和高等真菌等微生物的干细胞。SCP工业，主要是饲料酵母工业。酵母是一种单细胞微生物，生长繁殖快，菌体营养丰富。饲料酵母是一种营养价值很高的蛋白饲料，成品呈微黄粉末状，具有酵母特殊香味。酵母蛋白质含量一般都在70%左右，比大豆高1倍。与肉蛋白、鸡蛋蛋白、大豆蛋白相比，单细胞蛋白所含的氨基酸组分齐全，有18-20种氨基酸，尤其是谷物中所缺乏赖氨酸含量较高。此 外，维生素含量也十分丰富。每千克酵母类单细胞可使奶牛的产奶量增加6-7㎏，用含有10%单细胞蛋白饲料养鸡，产蛋提高21%-35%。1吨单细胞蛋白可节约5-7吨饲料粮，可产1.5吨鸡肉或3万枚鸡蛋。我国单细胞蛋白（酵母）年产量近3万吨，多用于医药、面包生产和饲料。用于生产饲料酵母的原料来源广泛，有矿物资源（如石油、甲烷、泥炭等）、纤维资源（如秸杆、木屑等）、糖类资源（如糖蜜、红薯等）、石油二次制品、废弃资源（包括有机废水、废渣、动物粪便等）。从我国目前的情况出发，生产饲料酵母等单细胞蛋白值得优先开发的原料有废糖蜜、薯干、纸浆废液，豆制品厂、味精厂、淀粉加工厂的废液等，用这些原料生产饲料酵母，首先是产品无毒性，另外也有利于解决工厂和城市的污染问题。
酵母细胞的发酵特点：目前，最广泛用于生产作为蛋白资源的酵母是假丝酵母，该酵母生长繁殖速度快，每2-4小时可繁殖一代，培养10小时左右就能繁殖到种子菌体量的15倍。发酵过程中，要保证罐内的液体混合良好和较适当地提供氧气，还要控制好温度和pH。采用流加间歇发酵可以保证糖被具有良好活性的酵母呼吸消耗，以达到最适产量。底物浓度过高，即使在有氧条件下，酵母也会发酵产生碳水化合物。如果酵母生长速率过快，底物也会发酵。因此，在培养过程中，底物浓度应维持在一定较低的水平，并维持一定的通风
量。
酵母生物量的检测方法及分离：最普遍的检测方法是细胞干重法、显微镜记数法和光密度法。菌体的分离常采用过滤法和离心分离法。
三、实验仪器与材料
（一）仪器
10L发酵罐、恒温培养箱、三维打印超净工作台、显微镜、大容量冷冻离心机、高压灭
（二）材料
菌种：热带假丝酵母（Candida tropicalis）, 由中国科学院微生物研究所提供。
葡萄糖、蛋白胨、饴糖、牛肉膏、NaCl。
（三）培养基配方
斜面培养基：酵母膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，琼脂1.5%，pH6.0。
摇瓶培养基：葡萄糖3.0%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.3%，pH自然。
发酵培养基：饴糖2.0%，葡萄糖3.0%，蛋白胨1%，酵母浸汁1.0%，K2HPO3 0.3%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，pH自然。
四、实验步骤
（一）斜面种子的制备
于超净工作台面上，在火焰保护下，用无菌接种棒挑取酵母菌少许，于斜面培养基内，先划中线，后从下而上往两边划线均匀地铺开，塞好棉塞。扎好后，放25-30ºC恒温箱中培养（斜面朝下放），培养4-6天。
（二）摇瓶种子的置备
刮下斜面酵母少量，接种于摇瓶培养基内，置摇床上，于28ºC恒温摇床240rpm培养24h。
（三）发酵罐发酵培养
在10L发酵罐中装入配好的发酵培养基（配料体积6L，消后体积6L），用饱和蒸汽对发酵罐进行实罐消毒，冷却后接入摇瓶种子（接种量5%），在控制条件下进行发酵。
（四）罐上各传感器的标定及灭菌操作
（五）发酵罐工艺控制要点
1． 发酵全程罐温控制在28±1ºC，中后期温度可以适当降低些；
2． 周期为72-96h，罐压保持在0.03-0.04Mpa，搅拌速度控制在200rpm；
3． 空气流量控制在1.5VVM（VVM，即单位时间内（min）通过单位体积（m3）发酵液的空气体积（m3））左右；
4． 补料控制:发酵过程中可根据残糖量适当补入含饴糖及葡萄糖的料液1-2次；
（六）中间控制操作要求
1． 0～48h：每隔6h取样，测细胞数（采用血球记数板记数）、pH诺基亚cdma、总糖、氨基氮，并作
好记录。涂片镜检，观察菌体形态，并作好记录。观察发酵液外观、粘稠度、气味等，并作好记录；
2． 48h～放罐：每隔12h取样，观察发酵液外观、颜、粘稠度，测pH、总糖、氨基氮、生物量（1500rpm,10min，收集菌体，干燥，称重），并作好记录；
3． 取样的操作要求同实验22；
模具计数器4． 每0.5h观察并记录一次：罐温、罐压、搅拌转速。
（七）发酵液的处理
放罐后发酵液采用离心分离法收集菌体，离心机的分离因数为3000g（n=，n为每分钟转速，r为旋转轴到离心管中心距离），离心10分钟。将湿菌体放入已知重量的平皿或烧杯内，于105ºC烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称重，即得菌体干重。由于干燥后细胞具有吸湿性，可用自动天平迅速称量。
五、实验结果及分析
（一）测定方法
1. 总糖和还原糖含量测定：蒽酮比法
2. 氨基氮含量测定：甲醛氧化法
3. 发酵液中细胞量测定采用血球记数板记数
4. 生物量的统计采用细胞干重称量法
（二）分析
观察酵母细胞在整个发酵过程中，细胞增长规律及菌体形态变化情况。
六、注意事项
提前一周左右接斜面，斜面培养成熟后置冰箱保藏备用（4°C冰箱中保存）；提前一周左右，采购实验用相关材料，配制中间体检测用化学试剂。本实验预计学时数20学时。
实验二 工程菌发酵生产氨酸
一、实验目的
1．了解以细菌（大肠杆菌）为产生菌，获得初级代谢产物为目的的液体深层发酵方法。
2．学习细菌发酵生产氨基酸过程中的菌体生长的规律以及发酵产酸的规律。
3．了解发酵液中氨酸含量的检测方法。
二、实验原理
L－氨酸化学名称为L-氨基吲哚基丙酸，分子式：C11H12N2O2，分子量：204.23，它是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸。
氨酸的化学结构式
L-氨酸是人体和动物生命活动中八种必需氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。
L-氨酸的生产最早主要是依靠化学合成法和蛋白质水解法制造。随着氨酸市场的开拓，微生物法生产氨酸的方法现已走向实用并且处于主导地位。微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。直接发酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的氨酸产生菌来生产氨酸。由于氨酸合成的多重反馈抑制机制及弱化子调节机制，加上整个芳香族氨基酸代谢流在生物体内本来就较弱，使得该法在相当长的一段时间内达不到工业化生产的要求。随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，为优良的氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产氨酸成为一种廉价的工业化生产方法。微生物转化法是使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成氨酸所需的前体物（如、吲哚、L-丝氨酸等），利用微生物的氨酸合成酶系转化前体来合成氨酸。酶法是利用微生物中氨酸生物合成酶系的催化功能生产氨酸。这些酶包括氨酸酶、氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。酶法一般由酶源菌体的培养、菌体的分离洗涤、固定化和催化反应等几个阶段组成。酶法能够利用化工合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技术的优势，又具有产物浓度高、收率高、纯
度高、副产物少、精制操作容易的优点，是一种成本较低的工业化生产氨酸的方法。
氨基酸的直接发酵生产多以细菌发酵为主，本实验选用谷氨酸棒杆菌来发酵生产氨酸。
三、实验仪器与材料
（一）仪器
10L发酵罐、恒温摇床、超净工作台、显微镜、数字可调移液器、高压灭菌锅、721分光光度计、电炉、恒温培养箱、碱式滴定管、酸式滴定管、三角瓶（250ml）、试管（18×180mm）。
（二）材料
大肠杆菌(Escherichia coli) 实验室提供。
蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、硫酸镁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、生物素、硫胺素。
（三）试剂
1、菌种保藏斜面培养基： 0.3%NaCl，0.5% 酵母膏，0.7%牛肉膏，1% 蛋白胨，2% 琼脂，pH 7.0
2、平板活化培养基：0.3%NaCl，0.5% 酵母膏，0.7%牛肉膏，1% 蛋白胨，2% 琼脂，1%葡萄糖，pH 7.0
3、种子培养基（g/L)：每升含葡萄糖 20g钢框胶合板模板，酵母浸出粉5.0，KH2PO4 11.5g，MgSO4.7H2O 3.0g，(NH4)2SO4 6.0g， 硫酸亚铁66mg， 柠檬酸三钠二水物3.0，pH 7.0-7.2，115℃，15min
4、发酵培养基（g/L)：每升含葡萄糖 20g，酵母浸出粉1.0，硫酸铵4.0，柠檬酸三钠二水物2.0，硫酸镁3.0,磷酸二氢钾2.0，硫酸亚铁100mg，pH7.0-7.2,115℃,115min
5、0.2% 蒽酮试剂
准确称取0.2g 蒽酮溶于100 mL浓硫酸中，并于棕瓶冷暗处保存，现配现用。
6、0.5% 亚硝酸钠溶液
准确称取0.5 g亚硝酸钠溶于蒸馏水中，定容至100 mL，新鲜配制。
7、50% 硫酸储备液
将500 mL浓硫酸小心的加入到500 mL蒸馏水中，边加边搅拌，最终定容至1000 mL，配成9 mol/L的硫酸储备液。
8、3.0 g/L对二甲氨基苯甲醛储备液
准确称取1.5 g对二甲胺基苯甲醛溶于500 mL 50%的硫酸溶液中，移至500 mL容量瓶中，以50%的硫酸溶液定容至刻度。
四、实验步骤
（一）种子培养方法
1、种子活化培养：
于超净工作台面上，在火焰保护下，将斜面保藏的菌种接到活化斜面上置35℃ 培养箱中（斜面朝下放）培养1-2天 (LB固体培养基）。
2、摇瓶种子培养：
从生长良好的活化斜面接一环菌苔至装有20 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，置回转式摇床上，于240 r/min，35℃卷烟器振荡培养至对数生长中后期。
（二）发酵培养工艺：
10L发酵罐基础料配料体积5L，消后体积5L彩钢板安装工程，接种量200mL。培养12h以后补加2L发酵液（已灭菌），初始通气量4 L/min;搅拌转速200 r/min;培养温度35.5℃；以泡敌消泡；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH为7.0；当溶氧降至50%以下时，增加通气量到8 L/min；同时搅拌转速提升至250~300 r/min；当培养液中葡萄糖浓度下降 1%时，把80%（1600g葡萄糖+蒸馏水定容至2L）的葡萄糖溶液以一定的流加速度加至培养液中，以维持发酵时葡萄糖浓度在1%-2%之内。
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