陈凤霞，曹军，刘玉梅*
地沟油提炼生物柴油（新疆大学化学学院，煤炭清洁转化与化工过程自治区重点实验室，新疆乌鲁木齐 830046）
摘 要：为抑制食品中有害微生物的生长繁殖，同时延缓食品品质变化、延长食品货架期，对储存食品进行适当包装尤为重要。本实验制备了含有啤酒花浸膏的壳聚糖/聚乙烯（polyethylene，PE）双层抑菌膜，研究了啤酒花浸膏添加量对抑菌膜表面结构、物理性能和抑菌活性的影响，以及在不同温度（4、25、35 ℃）和不同食品模拟体系（体积分数10%、50%、95%乙醇）中的释放行为。结果表明：啤酒花浸膏的加入使双层抑菌膜的耐水性增强，且对紫外光具有更高的屏障活性，同时赋予薄膜良好的抗氧化及抑菌活性，且含0.2 g/100 mL啤酒花浸膏的双层抑菌膜性能最佳。在相同条件下，啤酒花浸膏添加量越高，释放率也越高，且释放量随着温度和食品模拟液中乙醇体积分数的升高而增加，表明含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层膜抑菌膜可用于高脂类食品的包装。因此，含有啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜既可弥补可食性单层膜阻水性差的不足，又能赋予聚乙烯包装膜所不具备的抑菌功能。 关键词：酒花浸膏；壳聚糖；聚乙烯；释放；双层膜
Effect of Hops Extract on the Properties and Release Behavior of Chitosan/Polyethylene Bilayer Film
CHEN Fengxia, CAO Jun, LIU Yumei*
(Key Laboratory of Coal Cleaning Conversion and Chemical Engineering Process, College of Chemistry, Xinjiang University,
Ürümqi 830046, China)
Abstract: Proper packaging of foods is of particular importance for inhibiting the growth and reproduction of harmful microorganisms in foods during storage, delaying the quality deterioration and extending the shelf life. Chitosan-coated antimicrobial polyethylene (PE) bilayer films incorporated with hops extract were prepared in this study to investigate the effects of different concentrations of hops extract on the surface structure, physical properties and antibacterial activity of the films. Furthermore, the release behavior of hops extract from the films was investigated in simulated food systems (ethanol solutions at 10%, 50%, and 95%, V/V) at different temperatures (4, 25 and 35 ℃). The results showed that the addition of hops extract especially at 0.2 g/100 mL increased the water resistance and UV barrier capacity of the film and imparted good antioxidant and antimicrobial activity to it. Under the same conditions, the release percentage of hops extract inc
reased with increasing its concentration, and the release amount similarly increased with increasing temperature and ethanol concentration, which indicates that the chitosan-coated antibacterial PE bilayer films could be used for the packaging of high-fat foods. Moreover, the antibacterial films not only overcome the poor water resistance of single-layer edible films, but also had antibacterial effects while PE packaging films do not have.
还春Keywords: hops extract; chitosan; polyethylene; release; bilayer film
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200221-229
墨水生产中图分类号：TS206.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2021）03-0219-08引文格式：
陈凤霞, 曹军, 刘玉梅. 啤酒花浸膏对壳聚糖/聚乙烯双层膜的性能影响及释放行为[J]. 食品科学, 2021, 42(3): 219-226.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200221-229. www.spkx
收稿日期：2020-02-21
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31660490）
第一作者简介：陈凤霞（1994—）（ORCID: 0000-0002-2795-0263），女，硕士研究生，研究方向为分析化学。
E-mail:*****************
*通信作者简介：刘玉梅（1965—）（ORCID: 0000-0001-7022-2467），女，教授级高级工程师，博士，研究方向为天然产物功能因子及检测。E-mail:***************
CHEN Fengxia, CAO Jun, LIU Yumei. Effect of hops extract on the properties and release behavior of chitosan/polyethylene bilayer film[J]. Food Science, 2021, 42(3): 219-226. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200221-229. www.spkx
活性包装是一种创新型包装，由于其与包装材料、食品和环境的相互作用，可有效延长食品的货架寿命，更好地保护口味，在降低防腐剂等食品添加剂用量的同时，又能保持产品的品质，因而备受人们的关注[1]。这种延长保质期的方法是通过在包装材料的内部或表面添加抗菌剂或抗氧化剂等活性物质，进而通过材料持续扩散释放到食品表面以抑制微生物生长，减缓微生物生长速度或者减少其成活数量，同时阻隔外部环境对食品的不良作用，从而起到保持产品品质和延长保质期的作用[2]。
添加到包装材料内的抗菌成分主要为合成抗菌剂（包括无机抗菌剂、有机化学抗菌剂）和天然生物抗
菌剂[3]。由于合成抗菌剂的毒性和潜在的致癌作用，在食品包装中添加天然抗菌剂已成为一种趋势[4-7]。啤酒花浸膏是啤酒花通过二氧化碳经超临界萃取得到的天然活性物质，主要包含啤酒花苦味树脂和精油等化学成分，通常用于啤酒酿造，提供啤酒所需的苦味以及防腐作用[8]。作为食品添加剂和食品包装材料时同样具有良好的抗氧化及抑菌效果[9]。
聚乙烯（polyethylene，PE）薄膜由于无毒、无味、无臭、符合食品包装卫生标准且价格低廉，常用作食品保鲜。作为食品包装材料，PE具有机械性能良好、低润湿性和高防潮性等优势[10]，但是缺乏活性功能。研究者们常直接将精油、迷迭香、儿茶素、没食子酸等天然活性物质加入PE中制备活性包装[11-12]。然而活性物质释放不理想，因为在处理PE时通常处于高温条件，会导致活性物质的降解。此外，如将活性物质接枝于PE表面，由于它们之间强烈的化学键合会导致活性物质难以释放到食品表面[13]。因此，可将这些化合物依附另一个载体，然后进一步层压在PE表面上产生双层膜。壳聚糖是一种从甲壳素中提取的生物高分子材料，以其独特的高分子结构、生物相容性、生物降解性等内在功能特性引起了科学界和工业界的广泛关注。壳聚糖及其衍生物常用于食品工业、农业、制药、医药、美容、纺织和造纸工业以及化学等领域[14-16]。在食品包装方面，因其价格低廉、安全无毒、良好的成模性和较强的抗菌防腐能力，常与各种天然抗氧化剂和抑菌剂结合用于延长食品货架期[17-19]，但壳聚糖具有较高的水蒸气透过性，易导致食品失水。因而有学者将壳聚糖与PE膜结合添加活性成分制备双层膜用于食品的保鲜研究[20]，但对膜的基本理化性能及活性物质的释放行为研究较少。
本研究将壳聚糖作为载体添加啤酒花浸膏铺覆于PE表面，目的是开发一种基于啤酒花浸膏的壳聚糖/PE 双层抑菌膜的活性包装。并通过研究薄膜的微观结构、物理特性、抗菌性能以及啤酒花浸膏在抑菌膜中的释放规律，为食品包装的开发提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 菌种、材料与试剂
大肠杆菌、肺炎杆菌、金黄葡萄球菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌均保存于新疆维吾尔自治区食品药品检验所。
LB培养基北京奥博星生物技术有限公司；壳聚糖（脱乙酰度＞90%）上海蓝极科技发展有限公司；超临界C O2萃取的啤酒花浸膏（α-酸50.82%、β-酸12.87%）新疆三宝乐农业科技有限公司；P E膜浙江清清美家居用品有限公司；甘油（质量分数≥98%）、乙酸、无水乙醇天津致远化学试剂有限公司；其他常用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
BS210S型电子天平德国赛多利斯公司；DF-II集热式磁力加热搅拌金坛市医疗仪器厂；DPH-420型电热恒培养箱北京市永光明仪器有限公司；HP-200 精密差仪东莞市国产精密差仪厂；UV-5300PC
型紫外-可见分光光度计上海元析仪器有限公司；SU8000场发射扫描电子显微镜（scanning electron micrroscope，SEM） 日本Hitachi公司；自制成膜器（17 cm×7.5 cm）。
1.3 方法
1.3.1 壳聚糖/PE双层抑菌膜的制备
参考前期研究[21]，取2 g壳聚糖溶于90 mL体积分数2%乙酸溶液，70 ℃持续搅拌至完全溶解，冷却至30 ℃，将1 g甘油溶于5 mL蒸馏水中，缓慢加入壳聚糖溶液，搅拌1 h，再分别加入0、0.1、0.2、0.3 g的啤酒花浸膏（5 mL无水乙醇溶解），使啤酒花浸膏终质量浓度分别为0（对照）、0.1、0.2、0.3 g/100 mL，搅拌1 h，静置脱气约12 h，再超声脱气2 h，制得的成膜液用延流法铺于贴有PE膜的自制成膜器中，在37 ℃恒温培养箱中干燥20 h，制备得到壳聚糖/PE双层抑菌膜。
1.3.2 膜厚度的测定
每个薄膜随机选取10 个点用游标卡尺测量，测量精度为±0.001 mm。
1.3.3 泽、透光率和不透明度的测定
薄膜泽的测定根据Dou Lixue等[22]的方法，将差仪
用标准的黑白板校准后对每个薄膜样品至少测定3 次，薄膜的泽分别用L*值（亮度）、a*值（红/绿）和b*值（黄/蓝）表示。利用紫外-可见分光光度计记录薄膜200～800 nm波长处在空气中的透光率。薄膜的不透明度按式（1）计算。
н䘿 /mmˉ1˙A
600 nm
d （1）
式中：d表示膜的厚度/mm。
1.3.4 水分质量分数和溶解度的测定
将膜裁成1 cm×1 cm的膜片，用分析天平准确称质量，记为m0/g，放置在表面皿中，在105 ℃烘箱中烘干至恒质量，用分析天平准确称质量，记为m1/g。将完全烘干后的膜片放入50 mL蒸馏水中，在室温下浸泡24 h，再放置在烘箱中105 ℃烘干至恒质量，用分析天平准确称质量，记为m2/g。水分质量分数和溶解度分别按公式（2）、（3）计算。
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e通话
ˉm
1
m
h100（2）
ⓦ䀓 /%˙m
1
ˉm
2
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1
h100（3）
1.3.5 微观结构的观察
利用SEM观察薄膜的表面微观结构。在观察之前，按照仪器说明对样品进行前处理并粘附于导电胶上喷金处理。
1.3.6 抑菌活性的测定
根据琼脂扩散实验法[2]评价双层抑菌膜的抑菌活性，通过固体培养基上的抑菌区确定薄膜抗微生物的效果。测试菌包括单增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌和肺炎杆菌。取上述5 种菌株加入到无菌的营养琼脂中，37 ℃下活化24 h，挑取活化后的菌落于质量分数0.85%生理盐水中，调节浊度至0.50麦氏浊度单位，使菌的浓度为1.5×108 CFU/mL。取0.1 mL菌悬液于100 mL LB培养基中混匀，倒入直径为9 cm无菌培养皿，将膜片裁成直径为6 mm的圆片，贴附于培养基表面，37 ℃下培养24 h，测量抑菌圈直径。
1.3.7 膜中啤酒花浸膏的释放行为测定
依据欧盟委员会指令（EU 10/2011）[23]，定义食品模拟物如下：水，模拟物水性食品；3%（体积分数，下同）乙酸，模拟酸性（pH值＜4.5）食品；10%乙醇，模拟酒精类食品；95%乙醇和异辛烷，模拟高脂肪食品；50%乙醇，模拟高脂肪食品含酒精的产品、牛奶和一些乳制品。本研究中因啤酒花浸膏具有疏水性，既选择在10%、50%、95%的乙醇模拟体系下进行释放。
取膜片（3 cm×5 cm）置于100 mL具塞式锥形瓶中，分别加入体积分数为10%、50%、95%的乙醇溶液50 mL，放入恒温水浴锅中，以4、25、35 ℃作为迁移温度，释放一定时间，取1 mL释放液按一定比例稀释，测定其在326 nm波长处的吸光度，根据啤酒花浸膏的标准曲线，计算模拟液中啤酒花浸膏的质量，即为膜片中的释放量。按公式（4）、（5）分别计算膜片中啤酒花浸膏释放量及释放率。
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h100（5）1.4 数据统计分析
所有数据均至少平行测定3 次。使用SPSS 20.0软件进行数据分析，结果以平均值±标准偏差表示，
利用单因素方差分析中的邓肯氏法进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著，采用Origin 8.6软件作图。
2 结果与分析
2.1 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的物理特性
表 1 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的物理性能Table 1 Physical properties of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films 酒花浸膏添加量/
（g/100 mL）
厚度/mm
水分质量
分数/%
溶解度/%
00.049±0.003a30.17±0.30c22.12±1.20b
0.10.054±0.005a28.90±0.90b19.57±1.75b
0.20.054±0.004a27.93±1.23ab18.41±1.25ab
0.30.064±0.004b26.63±0.80a15.38±1.88a 注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
薄膜的厚度是至关重要的参数，因其会影响食品包装的其他性能，如水蒸气和气体的渗透性、活性化合物的扩散，以及对昆虫和微生物攻击的防护。由表1可知，随着啤酒花浸膏添加量在0～0.2 g/100 mL范围内的增加，膜的厚度变化不显著；添加量增至0.3 g/100 mL 后，厚度显著增加，这主要是因为啤酒花浸膏添加量较大导致薄膜表面粗糙程度增加，从而使厚度增加。这与Atef等[24]的结果相似。
啤酒花浸膏的加入改变了壳聚糖/PE膜水亲和能力，随着啤酒花浸膏添加量的增加，溶解度和水分质量分数逐渐降低，与Wang Liyan等[25]将淡竹叶提取物添加到壳聚糖中的结果一致。水亲和能力的改变是由于啤酒花浸膏中含有大量的α-酸和β-酸，它们的羟基与壳聚糖的氨基之间存在很强的相互作用，使水分子与壳聚糖链上的氨基链接受阻。
2.2 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE双层抑菌膜的泽
薄膜的泽影响包装外观和消费者接受度。如表2所示，与对照组相比，添加啤酒花浸膏显著降低了
膜的L*值，同时显著提高了a*值和b*值，与壳聚糖中添加苹果
多酚后泽的变化趋势[26]相同。然而酒花浸膏添加量从0.1 g /100 mL 增加到0.2 g /100 mL 时，L *、a *值没有显著改变（P ＞0.05），但增加到0.3 g /100 mL 时两者均显著降低。此现象是由于啤酒花浸膏含量较高时在膜液中发生聚集，导致明亮度急剧下降。根据所测的泽及观察结果可知，含啤酒花浸膏的膜的泽比对照膜略深，且泽略偏黄。
表 2 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE 双层抑菌膜的泽Table 2 Color of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films
酒花浸膏添加量/（g /100 mL ）
L *a *b *不透明度/mm －1094.57±0.39a 1.16±0.21a 11.84±0.61a 1.00±0.06a 0.186.61±0.53b 4.28±0.92b 14.76±1.36b 1.72±0.10b 0.286.52±1.29b 3.87±0.16b 17.39±0.38c 1.83±0.14b 0.3
82.32±1.05c
5.03±0.31c
25.08±0.67d
2.22±0.04c
0200
300
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自动牙刷➗
0.1 g/100 mL 䞂㣡⎨㞿0.2 g/100 mL 䞂㣡⎨㞿0.3 g/100 mL 䞂㣡⎨㞿
图 1
含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE 双层抑菌膜的透光率
Fig. 1
Light transmittance of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films
薄膜应用于食品表面时，薄膜的透光性和透明度也是一个非常重要的考察标准。由图1可知，在200～800 nm 范围内，随着啤酒花浸膏添加量的增大，透光率呈下降趋势。在200～380 nm 范围内添加啤酒花浸膏的膜透光率基本为零，说明该膜相较对照膜更有利于防止紫外线的透过。此外，啤酒花浸膏使壳聚糖/PE 膜的不透明度显著增加（P ＜0.05）（表2），说明加入啤酒花浸膏可以改善壳聚糖/PE 膜的光阻隔性能，防止食品发生氧化变质。因此，啤酒花浸膏壳聚糖/PE 膜更适合用于紫外线敏感的食品包装。2.3
含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE 双层抑菌膜的微观结构
10 µm 10 mm 20.00 kV 10 µm
10 mm 20.00 kV A
B
A.壳聚糖/PE 膜；
B.含0.3 g/100 mL 酒花浸膏的壳聚糖/PE 膜。图 2 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE 双层抑菌膜的SEM 图Fig. 2
Scanning electron microscopic image of chitosan-coated
antibacterial PE bilayer films
利用SEM 可观察到成膜基质微观结构的相关信息，
可有效解释成膜基质的厚度、力学性能、透气性等宏观性能的变化原因。由图2可知，壳聚糖/PE 膜表面可观察到一些颗粒，这可能是由于成膜液黏度较高造成壳聚糖聚集形成晶粒。但薄膜的表面呈现均匀、光滑、连续的结构，表明壳聚糖具有高度相容性和良好的成膜特性，此结果与de Moraes Crizel 等[17]的结果相似。相较于对照膜，添加0.3 g /100 mL 啤酒花浸膏的膜出现了相分离情况，使膜表面粗糙且凹凸不平，这种现象可能是由于啤酒花浸膏的结构特性使其不溶于水，在有机溶剂中溶解性更好，从而不能轻易地进入聚合物链。因此，可以观察到因相分离而导致出现了膜表面粗糙、杂乱无章的现象，类似的结果在文献[27]中也有报道。这也进一步佐证了0.3 g /100 mL 啤酒花浸膏的膜厚度相较其他膜偏大。2.4
含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE 双层抑菌膜的抑菌活性
表 3 含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE 双层抑菌膜的抑菌活性Table 3
Antibacterial activity of chitosan-coated PE bilayer films
incorporated with hops extract
啤酒花浸膏添加量/（g /100 mL ）
抑菌圈直径/mm
蜡样芽孢杆菌
单增李斯特菌金黄
葡萄球菌
大肠杆菌肺炎杆菌
0－－－－－
0.1
12.7±0.4a 14.4±0.7a 15.7±0.6a 14.0±1.7a
11.5±0.4a 0.219.3±1.2b 20.0±0.8b 17.7±2.5b 15.8±2.5a 15.7±0.5b 0.3
20.3±0.5b 25.2±0.9c 20.7±0.6c 19.0±2.6b 17.5±0.5c
注：－.无抑菌圈。
通过琼脂扩散法评价不同添加量啤酒花浸膏抑菌膜对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、肺炎杆菌）和革兰氏阳性菌（蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌和金黄葡萄球菌）的抑菌活性。由表3可知，壳聚糖/PE 膜对5 株菌均没有抑菌效果，这与壳聚糖的广谱抑菌性相反，主要由于增塑剂使壳聚糖分子在膜内的固定化影响了壳聚糖抑菌活性的释放，导致其抑菌活性下降，此现象与Genskowsky 等[28] 的结果相似。而添加啤酒花浸膏的膜都显示出了良好的抑菌活性，并随着啤酒花浸膏的添加量增加，抑菌圈直径也逐渐增加。这主要因为啤酒花浸膏中α-酸、β-酸以及啤酒花精油都具有良好的抑菌活性，通过作用于细菌的细胞膜，使细胞膜发生不同程度的皱缩破裂，导致细胞内核酸流出而抑制了细菌生长[29]。此外，啤酒花浸膏对革兰氏阳性菌敏感程度强于革兰氏阴性菌，可能是由于其亲脂性较强，革兰氏阴性菌的细胞壁脂多糖会阻止其中的活性成分从细胞质膜渗透[30-31]。2.5
食品模拟液中酒花浸膏的释放行为
在目前的研究中，活性包装膜的释放取决于不同的因素，如液体向膜基质的迁移、聚合物的溶解度、活性化合物通过膜基质向食品模拟液体的扩散以及由活性化合物与生物基质之间的特定相互作用等不同因素作用[32]。
本实验研究了啤酒花浸膏在3 种不同的食物模拟物（10%、50%、95%乙醇）体系中的释放规律。图3显示了含啤酒花浸膏的壳聚糖/PE 双层膜在上述3 种食品模拟物中4、25、35 ℃环境下的啤酒花浸膏不同时刻的释放量。为了更好地解释不同添加量啤酒花浸膏的释放行为，继续研究了特定时间内活性成分（啤酒花浸膏）释放率的变化，具体结果见图4。
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啤酒花浸膏啤酒花浸膏䟺 䟿/˄m g /g ˅
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A ～C.分别代表释放体系温度为4、25、35 ℃；下标1～3.分别代表模拟液乙醇体积分数10%、50%、95%；图4同。图 3
壳聚糖/PE 双层抑菌膜中啤酒花浸膏在模拟体系中的释放量Fig. 3
对旋轴流风机
Release amount of hops extract from chitosan-coated PE bilayer
films in simulated food systems
由图3可知，在所有的测试模拟体系中均观察到相似
的释放曲线，释放过程都是由快速释放到缓慢释放然后进入释放平衡阶段，但是不同食品模拟体系达到最大释放量和释放率的时间有所不同。随着温度的升高，啤酒花释放量逐渐增大，且到达平衡所需时间越短。因为随着温度的升高，分子扩散加剧，分子间排斥力增大，导致啤酒花浸膏和壳聚糖作用力降低，因此加速了啤酒花
浸膏的释放[33]
。随着模拟液中乙醇体积分数的增加，模拟液中啤酒花浸膏的释放量增加，由于95%乙醇与啤酒花浸膏具有相似的疏水性，因此它的快速、高释放水平
是可以预期的，这与陈婷等[34]
在明胶/壳聚糖膜液中添加啤酒花浸膏的结果相同。
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