家用电视天线冯森玲|#，梁宝莹，谭湘萍1，梅峥嵘\袁中文M(1.广州医科大学附属第三医院药学部，广东省产科重大疾病重点实验 室，广东广州5丨0150;2.广州中医药大学第二附属医院，广东省中医院皮肤科，广东广州510120)
摘要：目的探究尼卡地平逆转耐奥沙利铂结肠癌细胞HCTI16/L耐药的疗效及其机制。方法采用MTT法分别检测尼卡 地平和奥沙利铂在HCT116/L和HCT116细胞上的药敏性，并检测尼卡地平能否逆转奥沙利铂耐药,，采用流式细胞仪（FCM) 检测HCT116/L细胞凋亡和细胞内罗丹明-123的浓度。结果奥沙利柏在耐药细胞HCT116/L及亲本细胞HCT116的/C5Q分别为（20.07±1.32)(^,(0.65±0.05)|^，具有明显的耐药差异性（户<0.00丨），耐药指数（/?/)为（30.86±2.2丨）。尼卡地平在耐药 细胞HCT116/L及亲本细胞HCT116的/C5。分别为（22.76±丨.52)(^\1,(21.65±1.35>\1，两者之间的细胞毒性没有统计学差异。FCM法检测结果显示尼卡地平和奥沙利铂联用能显著增加耐药细胞株凋亡率（P<0.001)，且能明显增加耐药细胞HCT116/L 内罗丹明-123的浓度。结论尼卡地平能增强HCT116].细胞对奥沙利铂的敏感性，其逆转耐药的作用与诱导耐药细胞 HCT丨丨6/L凋亡，影响转运蛋白P-gp的功能有关… 关键词：尼卡地平；奥沙利钼；人结肠癌细胞；耐药
中图分类号：R%6 文献标志码：A文章编号：1674-229X( 2021)02-0110-05
Doi ：10.12048/j.issn. 1674-229X.2021.02.006
The Reversal Effect of Nicardipine on HCT116/L Colon Cancer Cells
FENG Senling1*,LIA NG Baoying'*,TAN Xiangping1,M E I Zhengrong1,YUAN Zhongwe.n'' ({.Department of Pharmacy, Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou^ Guangdong510150, China；2. Department of Dermatology y the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Tnulitional Chinese Medicine, Giuingdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Mediciney Guangzhouy Guangdong 510120, China)
ABSTRACT：OBJECTIVE To study the mechanism of nicardipine reverse cell resistance in HCT116/L cells, and to detect the effect of combination of nicardipine and oxaliplatin on HCT116/L cells. METHODS MTT method was used to detect the drug sensitivity of nicardipine and oxaliplatin on HCT116/L and HCT116 cells,and to detect whether nicardipine could reverse oxaliplatin resistance. Flow cytometry ( FCM) was used to detect the apoptosis of HCT116/L cells and the content of Rhol23 in HCT116/L cells. RESULTS The /C50 of oxaliplatin in drug-resistant cells HCT116/L and parental cells HCT116 were( 20.07± 1.32) |xM and ( 0.65± 0.05) jxM,respectively,sho
wing significant differences in drug resistance (P<0.001).And the resistance index (/?/) was 30.86±2.21. The /C50 of nicardipine in HCT116/L and HCT116 were( 22.76± 1.52) (xM and ( 21.65± 1.35) (xM,respectively. There was no statistical difference in cytotoxicity between the two cells. FCM assay showed that nicardipine combining with oxaliplatin could significantly increase the apoptosis rate of HCT116/L (P<0.001) ,and significantly increase the content of Rhol23 in drug-resistant cells HCT116/L. CONCLUSION Nicardipine can reverse the resistance of HCT116/L cells to oxaliplatin. The effect of reversing resistance are related to induce the apoptosis of HCT116/L cells and affect the function of the P-gp transport protein.
KEY WORDS ：nicardipine；oxaliplatin ； HCT116/L；drug resistance
结肠癌是一种常见的恶性消化道肿瘤，具有高 沙利铂（Oxaliplatin,L-0HP)的F0LF0X方案是一线发病率和高病死率，在全球的患病率位居第三，多数 化疗方案，奥沙利铂对早期的结肠癌有一定效果2]，患者确诊时已属中晚期[1]。NCCN指南推荐含有奥 但是长期使用会产生耐药性，导致了该化疗方案的
基金项目：广东省基础与应用基础研究基金区域联合基金（2019A1515im〇9)；广东省医院药学研究基金（2020A28)；广州医科大学附 属第三医院2019年度博士启动科研项目（2019B03)；广东省医学科学技术研究基金项目（A2020365)；广东省中医药局科研项目 (20201213)
#共同第一作者：冯森玲，主管中药师，研究方向：中药抗肿瘤研究；梁宝莹，主治医师，研究方向：中医外科通信作者：袁中文，副主任中药师，研究方向：中药药效物质，E-mail:*******************(丨u
• 110•Pharmacy Today, 2021 February , Vol. 31 No. 2今闩药学202丨年2月第31卷第2期
疗效受到了极大的限制[3]。因此，寻结肠癌耐药 逆转剂，从而克服肿瘤细胞耐药性、提高化疗药物疗 效，成为结肠癌中亟待解决的关键性问题。
P-糖蛋白（P-gp)是ATP结合盒转运体家族中 重要的外排转运体。很多肿瘤细胞耐药性由P-gP 高表达引起[4]。研究表明钙离子通道阻滞剂（钙拮 抗剂）能逆转细胞对化疗的耐受性，从而提高化疗药 物的效果5]。尼卡地平（Nicardipine,N)作为降 低高血压脑出血患者血压的有效干预药物，为钙拮 抗剂，有研究表明尼卡地平能逆转胰腺癌[6]、肝 癌;7)、胶质瘤细胞+9]等的耐药性，但能否逆转结肠 癌细胞对奥沙利铂的耐药性没有相关研究。为了阐 明尼卡地平能否在HCT116/L细胞上逆转奥沙利铂 耐药，为临床应用提供理论依据，本研究采用奥沙利 铂耐药的人结肠癌细胞株模型HCT116/L。运用 MTT、流式细胞术检测结肠癌细胞株在耐药性，细胞 凋亡率和细胞内罗丹明123浓度的改变，初步探索尼 卡地平逆转HCT116/L细胞奥沙利铂耐药的机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 主要仪器 Thermo Scientific™1300 系列 I I 级A2型生物安全柜，美国赛默飞世尔；BP211D型 十万分之一电子天平，德国Satorius公司；Therm o Fisher M ultiskan FC酶标仪，美国赛默飞世尔；流式 细胞仪（Flow cytometry，FCM)BD FACS Aria，BD Biosciences,San Jose,CA;C02 恒 温培养箱，美国赛默飞 世尔。
1.1.2试剂RPMI1640培养液（货号：11875093，美 国GIBC0公司）；胎牛血清/ FBS(货号：四季青 FBS385，浙江天杭生物科技有限公司）；胰酶（货号：25200-056 美国 GIBC0 公司）；3-(4,5-二甲基噻唑- 2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，噻唑蓝，货号：HZB0375，上海 Sigama公司），100 X Penicillin/Strep-tomycin Solution(货号：C55-SV30010.01，Hyclone); AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒（货号：C1062L，上海碧云天生物技术有限公司）；奥沙利铂 (Oxaliplatin/L-OHP，货号：61825-94-3)、尼卡地平(Nicardipine/N，货号：M B1792-S)、奎尼丁（QND，货 号：MB1702)、罗丹明-123( Rhodamine123/Rhol23, 货号:62669-70-9)购自大连美仑生物科技有限公 司；台盼蓝（广州威佳生物科技有限公司）；二甲基亚砜（DM S0，广州威佳生物科技有限公司）。
1.1.3生物样本人结肠癌细胞系HCT116及人结 肠癌耐奥沙利铂细胞系HCT116/L均购自南京凯基 生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1细胞培养HCT116细胞：将HCT116细胞接 种到含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液 中，置37 1,5%C02饱和湿度孵箱内培养，细胞呈 单层贴壁生长。传代时用含EDTA胰酶消化，台盼 蓝拒染法计算活细胞数。l~2d更换一次新鲜培养 基，待细胞生长融合至90%，进行细胞传代。
HCT116/L细胞：本研究中结肠癌奥沙利铂耐药 细胞模型HCT116/L对奥沙利铂的耐药培养浓度为2.5 |j l M。取对数生长期HCT116细胞，向培养液中 加人奥沙利铂溶液，使其终浓度分别为2.5 j j l M的含 药培养液，维持其耐药性。其余培养条件同HCT116 细胞。
1.2.2 MTT法检测药物细胞毒性应用MTT法检 测奥沙利铂和尼卡地平在亲本细胞株HCT116和耐 药细胞株HCT116/L的/C5。值。将对数生长期的HCT116 或 HCT116/L细胞用 0.25 % 不含 EDTA 的胰蛋白酶消化成细胞悬液，用含有10%胎牛血清的 RPMI1640细胞培养液稀释成5x l〇4个.mL'每孔 100 IxL加人96孔板中，每组平行6个复孔。37 T：、5%C02培养至细胞贴壁后，进行无血清处理24 h。每板分别设置阴性对照组（仅有细胞，无药物）、奥 沙利铂给药组（浓度梯度200，100，50,20，10,5，2, l,0.5,0.2pM)。尼卡地平给药组（浓度梯度200, 100,50,20，10,5,2，1，0.5,0.2 |xM)，作用 72 h后，每 孔加人 100 |j l L 0_5 mg.m L_1M T T工作液，5%C02、37丈孵育4 h。弃去上清，每孔加人100吣D M S0，低 速振荡10 min，使结晶充分溶解。用酶标仪在570 nm 波长处测定各组样品的吸光度0D值。
实验重复3 次。分别测得尼卡地平在HCT116和HCT116/L细 胞上的/C5。及奥沙利铂在HCT116和HCT116/L细 胞上的/C5。值。
1.2.3 MTT法检测尼卡地平逆转奥沙利钼耐药的 药效作用将对数生长期的HCT116或HCT116/L 细胞消化，种板。无血清处理24 h后给药。给药组 分别加入不同浓度的奥沙利铂（药物浓度梯度200, 100,50,20，10,5,2，1，0.5,0.2 pM)培养液，不同浓 度的奥沙利铂与尼卡地平（2.25,4.5,9 pM)的混合
今日药学2021年2月第31卷第2期Pharmacy Today, 2021 February , Vol. 31 No. 2• 111 •
单独作用时测得的/CM 值为（22.96±2.13)_，尼卡 地平(2.25，4.5,9 +M )与奥沙利铂联合作用时测得 的忙50值分别为（6.93±0.65)|xM 、（ 1.86±0.18)|xM 、 (0.69±0.06)^^，逆转倍数分别为（3.31±0.27) (12.34± 1.44) (33.28±3.24)，阳性对照组奎尼丁 (4.5 j j l M )与奥沙利铂联合作用时测得的/C 5。值为 (0.62±0.06)m _M ，逆转倍数为（37.03±3.51)。表明 不同浓度尼卡地平都能逆转HCT 116/L 细胞对奥沙 利销的耐药，且呈一定的浓度梯度。从细胞存活率 曲线可知4.5 ixM 尼卡地平对HCT 116/L 细胞存活 率影响较小，没有明显细胞毒作用，故后续实验选择4.5 JIM 尼卡地平进行研究。而在HCT 116细胞中,4.5
尼卡地平与奥沙利铂联用及奥沙利铂单独
作用时测得的/C ，。值分别为（0.54 ± 0.04) (xM 和 (0.72±0.06) j j l M ，表明尼卡地平没有明显改变奥沙 利铕在HCT 116细胞上的药敏性，见图2B 。
图1 MTT 法测定奥沙利铂在HCT116和HCTI16/L 细胞上 的/C J A )及尼卡地平在HCT116和HCT116/L 上的/C J B)
2.3流式细胞仪检测尼卡地平与奥沙利铂联用对 HCT 116/L 细胞凋亡的影响
如图3所示，对照组不加任何药物处理48 h
润滑油回收后，凋亡率为（8.27±丨.81)%，2.5卜\1奥沙利铂或
4.5 pM 尼卡地平单独作用后的凋亡率分别为（9.46±1.93) %和（丨
太阳影子定位技术5.01±2.61)%，与空白对照组相比没有
显著性差异。2.5 奥沙利钼和4.5 ixM 尼卡地平
联合作用后的凋亡率为（48.98±5.69)%，与单用2.5 j j l M 奥沙利铂给药组相比，差异均具有统计学意 义（P <0.001)。
培养液，不同浓度的奥沙利销与奎尼丁（4.5 (xM ，阳 性对照组）的混合培养液，作用72 h 后，加入MTT 工 作液孵育4 h 。用DMSO 充分溶解结晶。用酶标仪 在570 n m 波长处测定各组样品的吸光度O D 值。 实验重复3次。分别计算尼卡地平对奥沙利铂在
HCT116和HCT116/L 细胞耐药性的影响。1.2.4 流式细胞仪（FCM )检测细胞凋亡情况
HCT 116/L 细胞种板，每组3个复孔，分组给药处理 48 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化收集细胞（胰酶消 化时间不宜过长，否则容易引起假阳性）；用PBS 洗 涤细胞2次1 500 r .minM 离心5 min ，收集约lxlO 5 个细胞；加入500 j j l L 的Binding Buffer 悬浮细胞；加 入 5 |xL Annexin V-EGFP 混匀后，力口人 5 |xL Propidium
Iodide ，混匀；室温避光反应15 min ；在1 h 内进行流 式细胞仪检测。
1.2.5流式细胞仪（FCM )分析细胞内Rh 〇123浓度
HCT 116/L 细胞种板，每组3个复孔，分组给药处 理8 h ，加人终浓度为1
的Rh 〇123培养基继续
培养2 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化收集细胞；用绩效评估系统
PBS 洗涤细胞2次（1 500 1离心5 min )，收集约lx l 〇4个细胞直接在流式细胞仪上检测HCT 116/L 细胞内Rhol 23的荧光强度。1.3统计学处理方法
每组实验重复3次，最后的计数资料数据结果 以均值±标准差)表示，实验数据采用统计分析 软件GraphPad 7.0作图，并用SPSS 19.0软件进行统 计学分析。统计学差异表示r P <〇.〇5为差异有统 计学意义，P <0.01为有显著统计学差异，…P <〇. 001为有极显著的统计学差异。2 结果
2.1耐药细胞株奥沙利铂药敏鉴定及尼卡地平细 胞毒作用测定
HCT 116/L 细胞株能在含2.5 j j l M 奥沙利铂的培 养液中正常生长。结果显示：奥沙利铀在HCT 116和
HCT 116/L 细胞上的/C w 值分别为（0.72±0.06) pM 和 (22.14±2.07) j j l M ，耐药指数（Resistant Index , /?/)为 (30.75±2.16)，见图1 A ，差异具有统计学意义（P < 0.001)。尼卡地平在HCT 116和HCT 116/L 细胞上的 /(：5…值分别为（20.98± 1.63) |j l M 和（22.96±2.07) |j l M ，见 图1 B ，差异无统计学意义。
2.2尼卡地平逆转奥沙利铂耐药药效实验
在HCT 116/L 细胞中，如图2 A 所示，奥沙利铀
%
/#!徙驾思
B
%/劫徙驾思
• 112 •
Pharmacy Today , 2021 February , Vol. 31 No. 2
今H 药学2021年2月第31卷第2
期
L(^M):-
2.5 - 2.5N(nM):-
-
4.5
4.5
注:2.5 奥沙利铂组比较，…尸<0.001
图3流式细胞仪检测尼卡地平（N )、奥沙利铂（L _OHP )单 用或联用对HCT116/L 凋亡率的影响（A )；凋亡率统计分 析（B )
今日药学2021年2月第31卷第2期
HCT116/L
6〇 I
多聚磷酸盐
HCT116/L
M (；n 16/L
DMSO 1 jtM Rh 〇123
nM Rho 123+20 jiM Verapamil I m -M Rhol23+20 j j l M +4.5 fiM N
3
讨论
结肠癌细胞对化疗药物的耐药性，是结肠
癌的一个主要障碍。关于逆转多药耐药的药理学研 究始于20世纪80年代，此后有三代MDR (
m ulti drug resistance )逆转剂出现lu ，第一-代MDR 逆转剂 具有较明显的毒副作用并会影响化疗药物代谢排 泄；第二代MDR 逆转剂体内活性太低；第三代M DR 逆转剂大多数无法通过IH 期临床试验。因此寻结 肠癌耐药的逆转剂，特别是发现临床上在用且具有 逆转耐药的药物对于结肠癌的后续和临床研究 具有很重要的意义。
尼卡地平作为一种钙拮抗剂，临床上常用于治
疗高血压和心绞痛，有研究者将尼卡地平在制备抗 肺癌产品中应用[11]。在我们的研究中发现尼卡地 平有逆转结肠癌耐药的作用。MTT 实验结果表明，
HCT 116/L 对奥沙利铂的耐药指数约为30.75倍，高 中低3个剂量的尼卡地平与奥沙利铂联用都能提高 奥沙利铂的耐药逆转倍数，说明尼卡地平能增强奥
沙利铀对HCT 116/L 细胞的药敏性，但逆转效果弱 于同浓度阳物奎尼丁和奥沙利柏联用组。我们 进一步用流式细胞仪测定了尼卡地平与奥沙利销联 用对HCT 116/I .的细胞凋亡及尼卡地平对罗丹明 123进入HCT 116/L 内的含量的影响。结果表明，尼 卡地平与奥沙利铂联用能显著促进HCT 116八。的细
Pharmacy Today , 2021 February, Vol. 31 No.2
2.4 尼卡地平对Rhol 23进入细胞HCT 116/L 内浓度的影响
HCT 116/L 细胞单用1 j j l M Rh 〇123处理后，与 DM S 0组比较荧光强度微弱增加，由于P -g P 的外排 作用进入细胞内的Rh 〇123极少。当加人4.5 pM 尼 卡地平处理后，细胞内Rh 〇123的荧光强度明显升高 (红），但低于20 j j l M 维拉帕米（Verapamil ，P -gp 抑 制剂，绿）作川后的荧光强度，见图4。
0.002 0.02
举宫是什么意思0.2 2 20
L-O H P/m M
荧光强度
图2尼卡地平逆转HCT116/L 对奥沙利铂耐药（A > ；尼卡 地平不影响奥沙利铂在HCT116细胞上的药敏性（B 丨图4流式细胞仪检测尼卡地平对进入HCT116/L 细胞内
RIW123浓度的影响
%/留
居
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B
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4
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思
胞凋亡，提示尼卡地平对HCT116/L细胞的耐药逆 转作用可能与此相关。进一步研究显示尼卡地平能 增加P-gp底物Rh〇123在耐药细胞HCT116/L中的 浓度，说明尼卡地平能抑制转运蛋白P-gp对Rh〇123 的外排功能，从而发挥逆转耐药的作用。
以上研究是对尼卡地平逆转耐药的初步探索，以期为尼卡地平逆转结肠癌耐药的应用提供理论依据。
我们的研究阐明了尼卡地平逆转耐药的作用与联合 奥沙利销可增强诱导耐药细胞HCT116/L凋亡，影响 转运蛋白P-gP的功能有关。但是肿瘤多药耐药的机 制十分复杂，涉及许多生物学机制和信号通路的调控 作用，耐药肿瘤血管、耐药肿瘤免疫、免疫都 是目前肿瘤研究的热点和难点。后续研究中我们将 进一步研究尼卡地平对结肠癌细胞HCT116/L耐药 的逆转作用机理。比如MAPK、R0S、PI3K/Akt等信 号通路影响P-gp的活性或功能[14"15]，对于结肠癌上 皮-间质转化的影响调控结肠癌耐药的相关机制，通 过免疫组化、免疫荧光、流式分析、RNA分析等手段 分析耐药肿瘤微环境内的调节机制，并通过自噬调 节相关信号通路逆转结肠癌耐药的机制研究以及通 过体内实验研究并探索尼卡地平对结肠癌耐药的逆 转作用。进一步阐明尼卡地平对结肠癌耐药的逆转 作用机制，为临床结肠癌提供更多可靠的理论 依据。
参考文献
[1]杨畅，范兰兰，黄旭.结肠癌药物预防的研究进展[J].当代化工
研究,2019(6) :181-182.
[2]井元英.结肠癌采用奥沙利铂联合化疗的疗效探究[J].中
国实用医药，2019,14(33) :1丨3-114.[3]田春阳，刘晓政，范军朝.奥沙利销联合柔红霉素诱导结肠癌细
胞系HT-29凋亡[J].基础医学与临床，2020,40(3) :310-314. [4] Dong J,Q in Z, Zhang W D,ef al.Medicinal chemistry strategies to
discover P-glycoprotein inhibitors：An update[ J . Drug Resist Up- dat, 2020,49： 100681.
[5 ] Alnajjar l. M , Bulatova N R, Darwish R M. Evaluation of four calcium
channel blorkers as fluconazole resistance inhibitors in Candida gla- brata[J]. J Glob Antimicrob Resist,2018,14： 185-189.
[6]杨军，石欣，严伟，等.尼卡地平对胰腺癌Patu8988株培美曲塞
耐药的逆转作用[J].世界华人消化杂志，20丨0，丨8(2) : 132-136. [7]刘伟，只达石.尼卡地平和威猛联合逆转C6/VM-26耐药并诱导
凋亡研究[J].中华神经外科疾病研究杂志，2005,4(6):512- 515.
[8]刘伟，魏盾，孙续腾.尼卡地平和VM-26逆转C6/VM-26耐药性
研究[J].北华大学学报（自然科学版）,2002,3(3) :206-209. [9]陈贤鸿，王炳芳，陈锡美.尼卡地平抑制肝癌耐药细胞增殖的研
究[J].铁道医学，2001,29(3) :149-丨51_
[10 ] Palmeira A ,Sousa E, Vasconcelos M H al. Three decades of P-gp
inhibitors：Skimming through several generations and scaffolds[ J ].
Curr Med Chem,2012,19( 13) ： 1946-2025.
[11] Shi Y Y,Song Z J. Applications for nicardipine in preparing anti
lung cancer prcMlucts[ J]. US Patent App,2018.
[12] Feng S L,Yuan Z W,Yao X },et al.Tangeretin,a Citrus pentame-
thoxyflavone, antagonizes ABCB1-mediated multidrug resistance by inhibiting its transport function[ J . Pharmacol Res,2016,110： 193- 204.
[13] Feng S L,Luo H B,Cai L,e/ al.Ginsenoside Rg5 overcomes chemo
therapeutic multidrug resistance mediated by ABCB1 transporter：In vitro and in vivo study[J]. J Ginseng Res,2020,44( 2) ：247-257. _14] Feng S,Zhou H,Wu D,e/ al.Nobiletin and its derivatives ov
ercome multidrug resistance ( MDR) in cancer：Total synthesis and discov
ery of potent MDR reversal agents[J]. Acta Pharm Sin B,2020,10
(2)： 327-343.
[15]李中辉，董旺，陈敏，等.大黄素下调ILK/PI3K/Akt信号通路抑
制结肠癌CAC0-2细胞增殖的机制研究[J].今日药学，2020, 30(2) ： 116-120.
(收稿日期：2020-05-09；在线出版日期：202丨-02-04)
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