曲培艺1，郁洁雯1，王琳2*
(1．佳木斯大学研究生院，黑龙江佳木斯154007；2．佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002) [摘要]本实验对人肝癌细胞HepG2细胞株进行培养，检测EGCG和亮氨酸对细胞的毒性和细胞增殖情况。观察得出EGCG对HepG2细
胞有杀伤抑制作用；而亮氨酸可促进HepG2细胞增殖，然而达到一定浓度后也会对HepG2细胞产生抑制作用。为今后肝癌的及预后提供一些依据。
[关键词]HepG2；EGCG；亮氨酸
[中图分类号]TQ [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2020)23-0036-01
nfs5Effects of EGCG and Leucine on the Proliferation of HepG2 Cells
Qu Peiyi1, Yu Jiewen1, Wang Lin2*
(1. Graduate School, Jiamusi University, Jiamusi 154007；2. The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154002, China)
Abstract: In this experiment, the HepG2 cell line of human liver cancer cells was cultured to detect the toxicity and cell proliferation of EGCG and leucine. It was observed that EGCG had inhibitory effect on HepG2 cells. However, leucine can promote the proliferation of HepG2 cells, and it will also have an inhibitory effect on HepG2 cells after reaching a certain concentration. This experiment can provide some basis information for the treatment and prognosis of liver cancer in the future.
Keywords: HepG2；EGCG；leucine
国画调盘EGCG是一种重要的儿茶素类黄酮[1]，是绿茶茶多酚的主要组成成分[2]，同时具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤作用[3-6]，活性取决于类黄酮上的第三个环结构。EGCG对高胰岛素血症及高氨血症中的突变GDH有同等有效抑制作用，使其成为可能的先导化合物[7]。亮氨酸是一种白的结晶性粉末，虽无臭，但味微苦。这种物质在甲酸中易溶，在水中略溶，而在乙醇或乙醚中极微溶解。亮氨酸的作用主要包括与异亮氨酸和缬氨酸一起合作修复肌肉，控制血糖，并为机体组织提供能量。亮氨酸是最有效的一种支链氨基酸，能够更快的分解转化为葡萄糖[8]。本实验对HepG2细胞株进行培养，检测上述两种物质对细胞的毒性和细胞增殖情况，为今后肝癌的及预后提供一些依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
HepG2细胞株(上海细胞库)。CO2培养箱(上海润度生物科技有限公司)，酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)。
1.2 实验方法
在细胞培养瓶中培养HepG2细胞，长满后将细胞培养于96孔板中，每孔
1.25
原材料检测
万个。待孔板中的细胞长好后，每孔加入不同
浓度含的
EGCG及亮氨酸的培养基，培养24 h和48 h后，每孔
加入10 μL的CCK8溶液，37 ℃孵育1 h后利用酶标仪测量每孔在450 nm处的吸光度。细胞存活率根据公式计算：细胞存活率(%)=(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度) 100 %。
2 结果与分析
表1 不同浓度EGCG对HepG2细胞在不同时间
的细胞增殖抑制率/%(x±s)
Tab.1 Inhibition rate of different concentrations of EGCG on
HepG2 cells at different times/%(x±s)
EGCG/(µg/mL) 24 h 48 h
0 0±0 0±0
25 6.37±2.45 9.63±1.78*
50 13.75±0.93*15.40±3.08*
75 17.81±3.32*21.41±3.94*
100 22.28±1.59*28.31±0.50*
125 38.05±2.49*43.29±1.64*
150 175 200 47.06±1.89*
52.83±4.73*
59.93±2.01*
50.21±1.99*
55.10±0.78*
61.50±1.41*
注：*与对照组相比，P＜0.05
图1 不同浓度EGCG对HepG2细胞抑制率的影响
Fig.1 Effects of different concentrations of EGCG on the inhibition
rate of HepG2 cells
表2 不同浓度亮氨酸对HepG2细胞在不同时间
卷绕电池
的细胞存活率/%(x±s)
Tab.2 Inhibition rate of different concentrations of leucine on
HepG2 cells at different times/%(x±s)
亮氨酸/(µg/mL) 24 h 48 h
0 100±0 100±0
25 152.74±4.29*156.64±6.49*
50 150.29±4.17*157.97±9.62*
75 149.70±3.85*158.53±6.17*
100 149.82±3.95*159.60±4.74*
125 149.29±3.76*167.12±6.37*
150 134.54±4.72* 108.83±5.78* 注：*与阴照组相比，P＜0.05
不同浓度EGCG对HepG2细胞抑制率的影响如图1、表1所示。可以看出，随着EGCG浓度的增大，对细胞的抑制率逐渐增强。不同浓度亮氨酸对HepG2细胞存活率的影响如图2、表2所示。培养48 h，浓度为125 µg/mL时存活率达到峰值，随后下降。
(下转第10页)
[收稿日期] 2020-10-16
[作者简介] 曲培艺(1994-)，女，齐齐哈尔人，硕士研究生，主要研究方向为肿瘤生化与分子诊断学。
*为通讯作者：王琳(1974-)，女，硕士研究生，副主任技师，从事恶性种瘤的实验室诊断。
2 实验部分
2.1 试剂与仪器
所用试剂与药品均为市售分析纯或化学纯。AV500型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS 为内标)，瑞
士Bruker 公司；AB SCIEX Triple TOF4600质谱仪；E2695型高效液相谱仪，美国Waters 公司。 2.2 合成
2.2.1 4-羟基吡唑烷-1,2-二羧酸二叔丁酯(M2)的合成
将80 %水合肼20 g(0.32 mol)和水80 g 加入到500 mL 四口烧瓶中，降温至10 ℃，控制温恒定在10~30 ℃，向反应液中滴加环氧氯丙烷24 g(0.26 mol)，滴加完毕，控温10~30 ℃，搅拌反应2 h 。反应完毕后滴加丙酮60 g ，然后再搅拌反应30 min 。反应液用乙酸乙酯(50 mL×2)洗涤，合并保留水相。 将上述水相转移至500 mL 四口烧瓶中，加入四氢呋喃30 g ，碳酸钾42 g(0.30 mol)，搅拌降温至0 ℃。控制温温度在0~10 ℃范围内，滴加四氢呋喃30 g 和Boc 酸酐95 g(0.44 mol)的混合液，滴加完毕，控温0~10 ℃，搅拌反应2 h 。将反应液过滤，滤饼用80 mL 乙酸乙酯洗涤，母液分层后，水层用80 mL 乙酸乙酯萃取一次，合并有机相，用1 N 盐酸(600 mL×2)洗涤，再用600 mL 饱和碳酸氢钠洗涤，最后用饱和盐水(60 mL)洗涤，合并有机相无水硫酸钠干燥，蒸馏乙酯乙酯得粘稠液体72 g 。
取2 g 所得粘稠液体柱谱法纯化，乙酸乙酯：石油醚(1：10)
洗脱得到1.5 g 纯的化合物M2。1
H-NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ=1.42(m ，18H)，2.96(m ，2H)，3.21(m ，2H)，5.28(m ，1H),5.02(br ，
1H); ESI-MS ：calc. for C 13H 24N 2O 5:[M+H]+
=m/z 288.18，found:289.18。
2.2.2 4-((甲磺酰基)氧基)吡唑烷-1,2-二羧酸二叔丁酯
将70 g 化合物M2(0.24 mol)，二氯甲烷200 g 和三乙胺32 g(0.32 mol)加入到250 mL 四口烧瓶中搅拌降温至0 ℃，滴加甲磺酰氯32 g(0.28 mol)搅拌反应2 h 。加入150 mL 水搅拌5 min ，静置分层。有机相用100 mL 饱和碳酸氢钠洗涤，合并有机层无水硫酸钠干燥并过滤，收集滤液减压浓缩，加入100 g 正庚烷升温至回流搅拌0.5 h ，冷却至室温过滤，滤饼室温真空干燥3 h ，得80.5 g 化合物M3。三步总收率为84.5 %。1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ=1.42(m ，18H)，3.21(m ，2H)，2.96(m ，2H)，3.16(s ，3H),6.04(m ，1H)；ESI-MS ：calc. for C 14H 26N 2O 7S ：[M+H]+=m/z 367.15 found ：367.15。
2.2.3 4-((甲基亚磺酰基)氧基)吡唑烷-1,2-二羧酸二叔丁酯
将22 g 化合物M3(0.06 mol)、硫代乙酸钾8.5 g(0.07 mol)、乙腈70 g 和DMF 30 g 加入250 mL 三口瓶
升温至100 ℃，反应3 h 。向反应体系中加入150 mL 乙酸乙酯和100 g 水搅拌10 min ，静置分层有机相用水洗(50 g×2)，有机相蒸干得20 g 油状物M4，收率
为96.2 %。1
H-NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ=1.42(m ，18H)，2.30(s ，3H)，3.44(m ，2H)，3.69(m ，2H),4.05(m ，1H)；ESI-MS ：calc. for C 15H 26N 2O 5S ：[M+H]+=m/z 347.16 found ：347.16。 2.2.4 四叔丁基4,4'-二硫代二基双(吡唑烷-1,2-二羧酸酯)
将20 g(0.058 mol)M4用100 mL 四氢呋喃溶解并将反应体系降温至0 ℃，分批加入氢氧化钾14.4 g(0.26 mol)控制反应温度小于10 ℃，搅拌反应0.5 h 检测反应完成后滴加30 %双氧水7 g(0.06 mol)，控制温度在15 ℃以下搅拌反应0.5 h 。减压蒸除四氢呋喃加入二氯甲烷150 g 和水100 g 搅拌、静置、分层，蒸除二氯甲烷，柱谱法分离乙酸乙酯︰石油醚(1︰15)，得33.4 g 化合物M6收率为95.0 %。1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ=1.42(m ，36H)，3.08(m ，4H)，3.33(m ，4H)，3.78(m ，2H)；ESI-MS ：calc. for C 26H 47N 4O8S 2：[M+H]+=m/z 607.28 found ：607.28。
参考文献
[1]GRöNBECK H ，CURIONI A ，ANDREONI W ．Thiols and Disulfides on the Au(111) Surface ：
The Headgroup-Gold Interaction[J]．Journal of the American Chemical Society ，2000，122(16)：3839-42．
[2]DIRAIMONDO T R ，PLUGIS N M ，JIN X ，et al ．Selective Inhibition of Extracellular Thioredoxin by Asymmetric Disulfides[J]．Journal of Medicinal Chemistry ，2013，56(3)：1301-10．
[3]MU Y ，NODWELL M ，PACE J L ，et al ．Vancomycin disulfide derivatives as antibacterial agents[J]．Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters ，2004，14(3)：735-8．
[4]NAOI K ，SUEMATSU S ，KOMIYAMA M ，et al ．An electrochemical study of poly(2,2′-dithiodianiline) in acidic aqueous media[J]．Electrochimica Acta ，2002，47(7)：1091-6．
[5]NICOLAOU K C ，LU M ，TOTOKOTSOPOULOS S ，et al ．Synthesis and Biological Evaluation of Epidithio-，Epitetrathio-，and bis-(Methylthio)diketopiperazines ：Synthetic Methodology ，Enantioselective Total Synthesis of Epicoccin G ，8，8′-epi-ent-Rostratin B ，Gliotoxin ，Gliotoxin G ，Emethallicin E ，and Haematocin and Discovery of New Antiviral and Antimalarial Agents[J]．Journal of the American Chemical Society ，2012，134(41)：17320-32．
[6]GONG J-X ，SHEN X ，YAO L-G ，et al ．Total Synthesis of Gymnorrhizol ，an Unprecedented 15-Membered Macrocyclic Polydisulfide from the Chinese Mangrove Bruguiera gymnorrhiza[J]．Organic Letters ，2007，9(9)：1715-6．
[7]HARA K ，BABA S ，MATSUMOTO F ，et al ．[Clinical evaluation of biapenem in various infectious diseases][J]．Japanese Journal of Antibiotics ，1999，52(11)：629．
[8]刘相奎，杨玉雷，朱雪焱，等．比阿培南的合成[J]．中国医药工业杂志，2006，37(12)：793-6．
(本文文献格式：陈桂平．一种重要化工中间体二硫化物的合成[J]．广东化工，2020，47(23)：9-10)
(上接第36页
)
图2 不同浓度亮氨酸对HepG2细胞存活率的影响 Fig.2 Effect of different concentrations of leucine on the cell
viability of HepG2 cells
3 结论
推拉活动护栏EGCG 对HepG2细胞有杀伤抑制作用，随着药物浓度的增大抑制效果逐渐增强。亮氨酸可促进HepG2细胞增殖，低浓度时随药物的浓度增加细胞的增殖效果也增加，然而达到一定浓度后，增殖效果达到峰值，随后也会对HepG2细胞产生抑制作用。这为
今后肝癌的和预后及更高的附加价值和其他方面的利用提供基础数据和依据。
参考文献
[1]张百川，孟祥晨，张明江．表没食子儿茶素没食子酸酯对增殖性疾病生长因子的诱捕作用[J]．中草药，2007(01)：151-153． [2]肖泽斌，赵颖海．绿茶提取物主要成分EGCG 抗肿瘤机制研究进展[J]．时珍国医国药，2016(11)：2731-2734．
[3]张岚翠，于海宁，孙世利，et al ．ECGC 抗癌作用相关的细胞内蛋白研究进展[J]．实用肿瘤杂志，2007，022(006)：555-558． [4]陈科，罗招阳．EGCG 的特性及抗肿瘤作用[J]．美国中华临床医学杂志，2006(2)：238-240．
[5]余芳．富硒绿茶功能成分的抗氧化和抗肿瘤作用及其机理研究[D]．南京农业大学，2007．
调盘[6]阴海鹏．多酚类化合物通过抑制NLRP3炎症小体发挥抗炎作用的研究[D]．2018．
[7]Li C ，Allen A ，Kwagh J ，et al ．Green tea polyphenols modulate insulin secretion by inhibiting glutamate dehydrogenase[J]．The Journal of Biological Chemistry ．2006，281(15)：10214-10221．
[8]邱俊强，耿国强，潘阳梦柔．支链氨基酸联合葡萄糖补充时机对大强度离心运动后延迟性肌肉酸痛及相关指标的影响[J]．中国体育科技，2019，55(03)：66-72．
(本文文献格式：曲培艺，郁洁雯，王琳．EGCG 和亮氨酸对HepG2细胞的增殖影响[J]．广东化工，2020，47(23)：36)
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