南方医科大学分生实验-绿荧光蛋白EGFP的基因克隆

绿荧光蛋白（EGFP）的基因克隆

南方医科大学学院

摘要

本实验旨在学习基因克隆并检验，绿荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α (克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。

关键词：绿荧光蛋白克隆表达

实验名称	绿荧光蛋白的基因克隆
实验日期	2015- ~ 2015-		实验地点
合作者			指导老师
评分		教师签名		批改日期

一、实验目的

1.学习使用限制性切酶进行DNA222a2酶切的原理和方法。

2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。

3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。

4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。

5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。

6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。

7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤

二、实验原理

1.pEGFP-N1质粒

2.T载体

三、材料与方法：

1.实验材料：

质粒：pEGFP-N1

T载体：pUCm-T

菌种：DH5 (克隆菌)

PCR引物：

金属检测传感器F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA

R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC

Tm=56

实验试剂：

即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）

快速DNA连接试剂盒

限制性切酶：EcoR I（Fermentas）

Axygen质粒提取试剂盒

抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)

X-gal、IPTG等

实验仪器：

超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等

2.方法

分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子

四、实验具体流程

1.获取外源基因

1)碱裂解法提取质粒

使用Axygen质粒提取试剂盒

彻底弃上清

弃上清

菌液

离心1300r pm,1min 瞬时离心

加350μl 溶液S3

加250μl 溶液S2

加250μl 溶液S1

漩涡震荡颠倒数次

悬浮沉淀

取上清600μl耐热钢焊接加到吸附柱中

离心13000rpm,10min

颠倒数次离心

放置3-5min13000rpm,1min

弃滤液，加入600μl洗涤液W

离心离心

放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加40μl洗脱液

13000rpm,1min 13000rpm,1min

PCR扩增 / -20℃保存备用

弃滤液

空柱离心离心

13000rpm,2min13000rpm,1min

2)PCR扩增目的基因GFP

取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：

H2O	6 l
质粒DNA（pEGFP-N1）	2 l
引物GFP1 (10 M)	1 l
引物GFP2 (10 M)	1 l
Premix Taq	10 l
总体积	20 l

加完试剂后，将PCR反应管放到t型槽尺寸PCR仪上。

PCE参数设置：

1 94℃预变性5分钟后开始以下循环

2 94℃ 30 秒

56℃ 30 秒 30 循环

72℃ 1 分钟

3 72℃ 7 分钟

4 4 ℃保温

3)琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒

凝胶准备→胶床准备→铺胶→静置→胶床置于电泳槽中→加电泳缓冲液→拔梳子→上样（1 lPCR产物，6 l loading buffer混合点样）→点marker→电泳→取出凝胶→拍照

2.构建重组DNA

使用即用型蓝白T载体和快速DNA连接试剂盒。按下表加入试剂：为了检验转化是否成功，设置对照组实验

	实验组①	对照组②
人脸识别怎么建模即用型蓝白T载体	1 l	1 l
PCR扩增产物	1 l	—
Control Insert DNA	—	1 l
快速连接缓冲液(2X)	5 l	5 l
超纯水-ddH2O	2.5 l	2.5 l
Rapid T4 DNA ligase	0.5 l	0.5 l
总体积	10 l	10 l