V o l.25高等学校化学学报 N o.7 2004年7月 CH E M I CAL JOU RNAL O F CH I N ESE UN I V ER S IT IES 1288～1290
[研究简报]
E n terococcus du rans产胞外多糖EPS- 的 顾笑梅1，吴厚铭2，马桂荣13
(1.山东大学生命科学院微生物技术国家重点实验室，济南250100;
2.中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室，上海200032)
关键词 E nterococcus d u rans;EPS2 ；胞外多糖；分离纯化
中图分类号 O629.12 文献标识码 A 文章编号 025120790(2004)0721288203
乳酸菌(LAB)作为对人类健康有益的食品级微生物正日益受到国内外科研工作者的关注.乳酸菌所产胞外多糖(EPS)即是LAB在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的粘液多糖或荚膜多糖.不同种类的LAB所产的胞
外多糖也不同，其结构变化多样，生物活性与其空间结构、分子量、分支度和溶解度有密切关系[1,2].近年来国外有报道分离得到具有抗肿瘤和抗炎活性的乳酸菌EPS[3,4]，但是国内对乳酸菌所产胞外多糖的研究尚未见报道.本实验从鸡肠道中的一株乳酸菌E n terococcus d u rans的发酵液中分离纯化得到一种具有免疫活性的胞外多糖EPS2 [5,6]，通过化学和光谱分析证明它是由葡萄糖和甘露糖组成的五糖重复单元聚合的多糖，同时得出EPS2 的五糖重复单元结构. 1 实验部分
1.1 试剂和仪器 C M2纤维素;D EA E2Sep hadex A225和Sephadex G2100(瑞典Phar m acia公司)；四甲基脲(1,1,3,32T etram ethylu rea,A.R.级，美国A ldrich公司)，其它试剂为国产分析纯.B SZ2100自动部分收集器(上海康华生化仪器制造厂);LABCON CO冷冻干燥机;4K15C冷冻离心机(美国S IG M A公司);DL S D ynam ic光散射仪(P ro tein So lu ti on s公司);241M C Po lari m eter比旋光仪(美国Perk in2E l m er公司);W aters600泵和W aters410示差检测器(美国W aters公司);UV23100和Q P 5000型气质联用仪(日本Sh i m adzu公司);CP2Sil8CB low b leed M S毛细管分析柱;I NOVA600型核磁共振波谱仪和V ISTA型气相谱仪(V arian);OV217毛细管分析柱.
1.2 EPS2 的分离纯化和分析 将于-20℃保藏的乳酸菌株E n terococcus d u rans活化后接入2L M R SC[5]液体培养基中，按文献[5]方法得到粗品，上C M2纤维素柱(2c m×40c m)，用1.0m o l L的N aC l
醋酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为30mL h，苯酚2硫酸法检测得到峰I1，透析浓缩后用磷酸缓冲液(0.02m o l L,pH=7.4)平衡过夜，上D EA E2Sep hadex柱(2c m×40c m)，用0.5m o l L的N aC l磷酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为24mL h，得到峰I
2.然后上Sep hadex G2100柱(2c m×100c m)，用醋酸铵缓冲液(0.05m o l L)洗脱，流速为6mL h，得到洗脱峰I，冻干.产品经高效液相谱(H PL C)分析，用W aters水溶性GPC柱2U ltrahydrogel L inesr(7.8mm×300mm)，醋酸铵缓冲液(0.1m o l L)作流动相，样品体积分数为0.17%，柱温为室温，流速0.8mL m in，经示差折光检测器检测.样品经紫外扫描;KB r压片测红外光谱；光散射法测定分子量；于20℃条件下测定比旋光度；用600M H z 核磁共振仪测定其1H NM R,13C NM R,DQ F2CO SCY,TOCSY,HM Q C,HM BC和NO ESY谱.
1.3 糖组成分析和甲基化分析 将5m g EPS2 用2m o l L三氟乙酸2mL在100℃水解10h后，按文献[7]中的步骤转化成糖醇乙酸酯衍生物，进行气相谱分析.将10m g EPS2 在氮气保护下加入二甲基亚砜3mL，于40℃超声处理30s，使样品充分溶解，依次加入0.25mL四甲基脲和3mL甲基亚磺酰甲基钠[8]，按改良的H akom o ri法[9]甲基化，重复3次，经红外光谱检测3500c m-1附近无吸
收稿日期:2003205216.
联系人简介：马桂荣(1938年出生)，女，教授，主要从事微生物资源方面的研究.E2m ail:gr m a@beel
ink
收峰.全甲基化EPS 2 经水解和乙酰化得到部分甲基化糖醇乙酸酯[10]进行气相2质谱联用分析.2 结果与讨论
2.1 分离纯化和分析 E n terococcus d u rans 菌株发酵液经分离纯化得到一种白疏松固体EPS 2 ，产量100m g L .H PL C 分析结果为单峰，说明EPS 2 是均一多糖；紫外扫描显示在260和280nm 处无明显吸收峰，说明EPS 2 不含蛋白质和核苷酸.红外光谱分析表明EPS 2 具有多糖的特征吸收峰,3369c m -1为OH 的伸缩振动,2930c m -1为CH 的伸缩振动,1250～950c m -1的一组强峰为吡喃环醚键(COC )和羟基吸收峰.元素分析表明,EPS 2 不含氮、磷和硫，碳和氢含量分别是41.08%和
7.23%，在多糖碳氢组成范围内.光散射法测得EPS 2 分子量为42000.20℃下[Α]D =+10.0°.
2.2 结构分析 结果表明,EPS 2 由葡萄糖和甘露糖组成，摩尔比为1∶4.在1H NM R 谱中,∆5.69,5.60,5.47,5.38和5.34为5种端基质子的信号峰，同时在DQ F 2CO SY 和TOCSY 相关谱中，端基质子与各自糖环上的H 22有强相关峰，说明EPS 2 有5种糖残基.按化学位移从大到小的顺F ig .1 T OCS Y spectru m of EPS - 序将这5种端基质子所处的糖环标记为A ,B ,C ,
D 和
E .从TOCSY 谱(图1)中看出,H A 1通过环上
质子H A 2,H A 3,H A 4和H A 5显示了一组相关峰，说明
残基A 上的质子都在a 键上，是葡萄糖；氢谱中相
对其它残基较弱的信号，提示残基A 位于糖链的末
端，归属为Glc (1；其余残基仅与各自环上相邻的
H 22质子有相关峰，说明这些糖环上的H 22质子在
e 键上，因此B ～E 是甘露糖残基
.表1的部分甲基化糖醇乙酸酯的气质联用分析
结果也表明EPS 2 由5种吡喃糖残基组成，质谱
(M S )分析5种糖残基分别是Glc p (1,2)M an p (1,4)M an p (1,3)M an p (1和2,6)M an p (1.从HM Q C
谱中的信号可以确定C B 2,C D 2,C D 6和C C3的化学位移分别为∆78.4,78.9,66.0和77.2，与未发生取代的甘露糖C 22,C 26和C 23的化学位移相比都向低磁场移动，是糖基化位点.根据甲基化分析的结果，糖残基E 推导为4)M an (1.在NO ESY 谱中，端基质子H B 1与H D 2和H D 1与H B 2之间有交叉峰,H A 1和H C3,H C1和H E4以及H E1和H D 6之间也存在NO E 关系.在HM BC 光谱中,H B 1与C D 2和H D 1与C B2之间有远程1H 213C 耦合(3J C —H )，说明残基B 和D 是相邻基团并组成多糖分子的主链;H C1和C E4以及H E1和C D 6之间也有残基间的3J C —H 关系.
Table 1 GC -M S dat a for parti ally m ethylated alditol acet ated of EPS -
t R m in M S i ons ,m z
Compound Sugar residue M o lar rati o 11.88101,129,161,145,117,87,71,205,59
合成氨变换工段1,52di 2O 2acetyl 22,3,4,62tetra 2O 2m ethylhexito l Glc p (1113.17129,43,87,189,71,101,145,233
1,2,52tri 2O 2acetyl 23,4,62tri 2O 2m ethylhexito l 2)M an p (1113.52117,233,101,87,71,129,173,189
沥青透水混凝土
1,4,52tri 2O 2acetyl 22,3,62tri 2O 2m ethylhexito l 4)M an p (1113.59129,117,101,161,71,233,201
1,3,52tri 2O 2acetyl 22,4,62tri 2O 2m ethylhexito l 3)M an p (1114.86
129,43,87,189,2331,2,5,62tetra 2O 2acetyl 23,42di 2O 2m ethylhexito l 2,6)M an p (11Table 2 I n ter -glycosidic correlation s fro m the ano m er ic
proton s observed i n 1H ,1H NOES Y and 1H ,
13C H M BC spectra of EPS
Sugar residue
∆H o r ∆C A nom eric p ro ton NO E HM BC A
Α2D 2Glc p (1→5.694.22(H C3)B
→2)Α2D 2M an p (1→5.604.34(H D 2)78.9(C D2)C
→3)Α2D 2M an p (1→5.474.28(H E4)78.1(C E4)D
→2,6)Α2D 2M an p (15.384.44(H B2)78.4(C B2)E →4)Α2D 2M an p (→15.344.35(H D 6)66.0(C D6
)Sche m e 1 Pen t asacchar ide repeati ng un its
由表2数据可以推出残基B 与D 通过1→2糖苷键组成糖分子的主链；残基A 与C 的3位相连,9821N o .7顾笑梅等:E nterococcus d u rans 产胞外多糖EPS 2 的分离纯化和结构分析
0921 高等学校化学学报V o l.25
砭石能量房残基C与E的4位相连,E通过1→6糖苷键与主链上的残基D相连组成多糖分子的支链.
另外，甘露糖残基B～E的端基质子的∆都在低场(>5.2),C25的∆73.5，而且C22的3J H—H都在7～10之间，说明是Α2连接的甘露糖；端基葡萄糖残基A的H21和H22之间有残基内的NO E相互关系，说明它是一个Α2连接的葡萄糖.构成乳酸菌所产生物胞外多糖的葡萄糖和甘露糖的绝对构型是D 型.综合分析，推断EPS2 是由葡萄糖和甘露组成的五糖重复单元(Schem e1)所聚合的多糖，与已知的乳酸菌产生的胞外多糖在单糖组成和结构上都不同，是一种新的乳酸菌产生的胞外多糖.
参 考 文 献
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Isola tion,Pur if ica tion and Structura l Eluc ida tion of EPS- ,
an Extracellular Polysacchar ide from E n terococcus du rans
GU X iao2M ei1,W U Hou2M ing2,M A Gu i2Rong13
(1.S tate K ey L aboratory of M icrobial T echnology,S hand ong U niversity,J inan250100,Ch ina;
2.S tate K ey L aboratory of B ioorg anic and N atu ral P rod ucts Che m istry,S hang hai Institu te of O rg anic Che m istry,
雨污分流器
Ch inese A cad e m y of S ciences,S hang hai200032,Ch ina)
Abstract T he rough crystal of exopo lysaccharide p roduced by E n terococcus d u rans,a strain of lactic acid bacteria screened from the in testine of a cock in ou r labo rato ry,w as pu rified by C M2cellu lo se co l2 um n ch rom atograp hy,D EA E2Sephadex A225i onexchange and Sephadex G2100gel ch rom atography to give EPS2 .T he EPS2 w as elu ted as a single peak in H PL C analysis,indicating the hom ogeneity of EPS2 and free from low2m o lecu lar2w eigh t po lysaccharides.T he m o lecu lar w eigh t of the EPS2 w as deter m ined as42000by the ligh t scattering m ethod.T he resu lt of its elem en tal analysis w as C41.08%and H7.23%w ithou t the ele
m en ts of N,P and S.M ono saccharide analysis show ed that it w as com po sed of Glc and M an in a m o lar rati o of4∶1.Sugar com po siti on analysis,m ethylati on anal2 ysis and1H and13C NM R sp ectro scop y revealed that the EPS2 w as com po sed of pen tasaccharide re2 p eating un its.T he sequence of sugar residues w as deter m ined by u sing tw o2di m en si onal NM R,in2 cluding heteronuclear m u lti p le2bond co rrelati on(HM BC)and nuclear overhau ser effect sp ectro scop y (NO ESY).T he structu re of the p en tasaccharide repeating un it of EPS2 w as given,a new excellu lar po lysaccharide from lactic acid bacterium com p ared w ith o ther EPSs w as repo rted.
双臂电桥Keywords E n terococcus d u rans;EPS2 ;Ex tracellu lar po lysaccharide;Pu rificati on
(Ed.:H,J,Z)
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