WB操作步骤-⾃⼰整理
Western Blot 相关实验⽅法与试剂（湿转法）
⼈⼯肝实验室学习姚瑶
（⼀）⽬的蛋⽩提取：
（1）单层贴壁细胞总蛋⽩的提取：
无纺布切割机1、倒掉细胞培养液，加⼊Hanks液洗涤⼀次后倒掉，根据所⽤细胞决定是否⽤胰酶消化，加⼊适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移⾄4⽀离⼼管内，配平后，1500转离⼼10min。
2、倒掉上清，⽤4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离⼼10min。 共洗三次，每次⼗分钟。
3、倒掉上清，吸净，每管加⼊50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加⼊后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移⾄1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。
4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做）
5、4℃，12000转离⼼10min。
6、将上清转移⾄0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待⽤。
（2）组织中总蛋⽩的提取：
1、取约100mg肝组织于研磨器内，加⼊500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加⼊500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离⼼10min。
3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待⽤（⼆）蛋⽩含量的测定：
1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。
2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加⼊于96孔板内，并⽤PBS将各孔补⾜20ul。
3、将第2、3排96孔板分别加⼊样品1ul、0.5ul，（可采⽤倍⽐稀释法），并⽤PBS将各孔补⾜20ul。
4、配制⼯作液：按A液：B液=50：1配制适量⼯作液，每孔加⼊200ul。
5、37℃⽔浴30min。
6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。
7、绘制标准曲线，计算样品蛋⽩浓度。
（三）SDS-PAGE电泳：
（1）清洗玻璃板
（2）灌胶与上样：
1、配胶：根据⽬的蛋⽩的⼤⼩，决定分离胶的浓度。
以5ml 10%分离胶、3ml 5%浓缩胶为例：
10%分离胶5%浓缩胶
去离⼦⽔ 1.9ml 2.1ml
30%聚丙烯酰胺 1.7ml
0.5ml
1.5M Tris-HCl（Ph8.8） 1.3ml ------
1.0M Tris-HCl（Ph6.8）------- 380ul
10%SDS 50ul 30ul
丝光机10%AP 50ul 30ul物流器具
TEMED 2ul 3ul
2、处理蛋⽩：计算含20-50ug蛋⽩的溶液体积即为上样量，
加⼊上样量等体积的2×上样缓冲液Buffer，再加⼊上述总体积1/10的β-巯基⼄醇，混匀后，放⼊PCR仪内，95℃反应10min。 3、加样：加⼊1×Tris-⽢氨酸电泳液，电泳液⾄少要漫过内侧⼩玻璃板，取下梳⼦，安装好电泳槽，倒⼊缓冲液，微量加样器加样。需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染。
（3）电泳：100V，20min，待溴酚蓝成⼀直线后，150V，电泳⾄溴酚蓝刚跑出即可终⽌电泳(⼀般1.5h)，取出跑好的凝胶，切胶⾄适合⼤⼩。进⾏转膜。也可在转膜前验证是否有⽬的条带，使⽤考马斯亮蓝液置于摇床染⾊12h。染完后观察，⽤脱⾊液脱⾊，20min/次，直⾄透明。再进⾏转膜。 （四）转膜：
配制1×转膜缓冲液（现配）。⼀般配制成10×转膜缓冲液储存。需要时配制成1×现⽤。PVDF膜需⽤甲醇激活(15s)，注意戴⼿套、赶⾛⽓泡、胶与膜的位置、膜的正反⾯。
（⼤放置顺序为：海绵--滤纸2层—PVDF膜—凝胶--滤纸2层—海绵。⼩：凝胶>滤纸>PVDF膜）
（五）免疫反应：背心袋生产设备
1、5%脱脂奶粉封闭，4℃过夜。
2、⼀抗孵育。
3、洗膜：PBST/TBST洗膜3次，10min/次。
4、⼆抗孵育。
5、洗膜：PBST/TBST洗膜3次，10min/次。止血带压力
（六）显⾊：
将HyGLO试剂A 750ul与试剂B 750ul混合后，均匀地滴于膜正⾯，约1min后，抖掉膜上液体，并吸⼲后显⾊。
在Western Blotting实验过程中使⽤内参的⽅法有：
⼀、超级简便的标记内参使⽤法：只要在⼆抗孵育时加⼊HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
⼆、普通内参：当⽬的蛋⽩的分⼦量⼤⼩与选⽤的内参蛋⽩分⼦量相差不⼤时，可以先进⾏⽬的蛋⽩的抗体温育显⾊和检测。然后使⽤Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进⾏内参蛋⽩的抗体温育、显⾊检测。
三、当⽬的蛋⽩的分⼦量⼤⼩与选⽤的内参蛋⽩分⼦量⼤⼩相差⽐较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋⽩质Marker的⼤⼩将膜剪为⼤分⼦量和⼩分⼦量两部分，使内参蛋⽩与⽬的蛋⽩分开。然后两块膜分别与内参蛋⽩抗体以及⽬的蛋⽩抗体进
⾏温育，⼆抗温育以及显⾊。
丽春红染⾊剂是⼀种阴离⼦重氮染料，由重氮氨基偶氮苯⼆磺酸（diazotized 4-amino-1,1’-azobenzene-3,4’-disulfonic acid）和萘酚⼆磺酸（2-naphthol- 3,6-disulfonic acid）耦合到四钠盐上。其分⼦式C22H12N4Na4O13S4，分⼦量为760.6。最⼤吸收光谱为520nm波长。带负电荷的丽春红分⼦与正电荷的蛋⽩质氨基基团结合，也可以⾮共价键形式与蛋⽩质⾮极性区域结合。
丽春红染⾊溶液是染料丽春红与蛋⽩质氨基基团的结合并显⽰红⾊蛋⽩条带，快速、敏感、可逆地检测PVDF膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜上的蛋⽩成分。丽春红染⾊溶液性能长期稳定，着⾊清晰灵敏，可检测250ng以上的蛋⽩。
丽春红对蛋⽩的染⾊是可逆的，染⾊后可以⽤蒸馏⽔，PBS或其它适当溶液漂洗去除。
使⽤⽅法：
1．取适量丽春红染⾊液，⽤去离⼦⽔10X稀释备⽤，染⾊液的⽤量，依膜的⼤⼩⽽定，浸没膜即可；
2．将PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染⾊液中，振荡5-10分钟或更长时间；
3．取出印迹膜，⽤蒸馏⽔，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，可出现清晰条带，记录结果；
4．⽤蒸馏⽔，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，每次3-5分钟，去除丽春红，进⾏后续的Western检测。
Western Blot 相关试剂
附1：溶液配制
1、胰酶：0.25g 胰酶加PBS⾄100ml。
2、30%聚丙烯酰胺：聚丙烯酰胺29g+双丙烯酰胺1g 见蒸馏⽔⾄
100ml
捕鱼网具3、Tris-HCl：
1.5 M ：36g Tris 加⽔⾄200ml 加HCL滴定⾄pH 8.8。
1.0 M ：24g Tris 加⽔⾄200ml 加HCL滴定⾄pH 6.8。
4、10% AP：AP 1g 加蒸馏⽔⾄10ml
5、5×Tris-⽢氨酸电泳缓冲液：Tris 15.1g ⽢氨酸94g SDS 5g 。
使⽤时稀释成1×Tris-⽢氨酸电泳缓冲液
6、10×转膜缓冲液：⽢氨酸 29g Tris-HCL 58g SDS 3.7g 加蒸馏⽔⾄1 L。
1×转膜缓冲液：10×转膜缓冲液配100ml+甲醇200ml+蒸馏⽔⾄
1000ml
7、10% SDS：SDS 10g，加⼊约80ml去离⼦⽔，68℃加热溶解，加
去离⼦⽔定容⾄100ml。室温保存。
8、TBST缓冲液：NaCL 8.8g 1 M Tris-HCl(pH 8.0) 20ml 加
⼊800ml去离⼦⽔，加⼊0.5ml Tween 20后充分混匀。定容⾄
1L，4℃保存。
9、封闭液：脱脂奶粉5g 加⼊TBST/1×PBS 定容⾄1L。
Tween-20
【性状】聚氧⼄烯去⽔⼭梨醇单⽉桂酸酯和⼀部分聚氧⼄烯双去⽔⼭梨醇单⽉桂酸酯的混合物。
【作⽤与⽤途】为司盘和环氧⼄烷的缩合物，由于其分⼦中有较多的亲⽔性基团⼀聚氧⼄烯基，故亲⽔性强，为⼀种⾮离⼦型
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议