⼀、增加反应体系的灵敏度：
铍铜1. 分离⾼质量RNA：
成功的cDNA合成来⾃⾼质量的RNA。⾼质量的RNA⾄少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最⼤值。⼀般的RNA纯化⽅法是使⽤异硫氰酸胍/酸性酚的⼀步法。为了防⽌痕量RNase的污染，从富含RNase的样品(如胰脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存⾼质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从⼤⿏肝脏中提取的RNA，在⽔中贮存⼀个星期就基本降解了，⽽从⼤⿏脾脏中提取的RNA，在⽔中保存3年仍保持稳定。另外，长度⼤于4kb的转录本对于痕量RNase的降解⽐⼩转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离⼦的甲酰胺中，存于-70℃。⽤于保存RNA的甲酰胺⼀定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA⾄少可以在甲酰胺中保存⼀年。当准备使⽤RNA时，可以使⽤下列⽅法沉淀RNA：加⼊NaCl⾄0.2M及4倍体积的⼄醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离⼼5分钟。
2. 使⽤⽆RNaseH活性(RNaseH-)的逆转录酶：
pgd-426在逆转录反应中经常加⼊RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第⼀链合成
反应中，在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加⼊，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从⽽释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋⽩RNase抑制剂仅防⽌RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防⽌⽪肤上的RNase，因此尽管使⽤了这些抑制剂，也要⼩⼼不要从⼿指上引⼊RNase。
逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本⾝的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或⼤⼤降低逆转录酶的RNaseH活性将会⼤有裨益。 SuperⅡ逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及thermo逆转录酶，RNaseH- 的AMV，⽐MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。Thermo⽐AMV的灵敏性强得多。RT-PCR产物的⼤⼩受限于逆转录酶合成cDNA的能⼒，尤其是克隆较⼤的cDNA时。同MMLV相⽐，SuperScripⅡ显著提⾼了长RT-PCR产物的产量。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在⾼于正常的37-42℃的温度下进⾏。在建议的合成条件下，使⽤oligo(dT)引物和10μCi的[α-P]dCTP。第⼀链的总产量使⽤TCA沉淀法计算。全长cDNA使⽤在碱性琼脂糖胶上将⼤⼩分类的条带切除并计数的⽅法分析。 3. 提⾼逆转录保温温度：
较⾼的保温温度有助于RNA⼆级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除⼤多数⼆级结构，从⽽使引物可以结合。然⽽某些模板仍然会存在⼆级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使⽤Thermo逆转录酶，并将逆转录反应置于较⾼温度下进⾏以改善扩增。较⾼的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使⽤基因特异性引物(GSP)进⾏cDNA合成时(见第三章)。如果使⽤GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在⾼于60℃时使⽤oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使⽤较⾼的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加⼊预热的2×的反应混合物提⾼特异性(cDNA热启动合成)。这种⽅法有助于防⽌较低温度时所发⽣的分⼦间碱基配对。使⽤PCR仪可以简化 RT-PCR所需的多种温度切换。
Tth热稳定聚合酶在Mg2+存在条件下作为DNA聚合酶，在Mn2+存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最⾼65℃条件下保温。然⽽，PCR过程中Mn2+的存在会降低忠实性，这使得Tth 聚合酶不太适合⽤于⾼精确度的扩增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，⽽且，既然单个酶就可以进⾏逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能⽤来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。
4. 促进逆转录的添加剂：
包括⽢油和DMSO在内的添加剂加到第⼀链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA⼆级结构，最多可以加⼊20%的⽢油或10%的DMSO⽽不影响SuperⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20%的⽢油⽽不降低活性。为了在SuperⅡ逆转录反应中最⼤限度提⾼RT-PCR的灵敏度，可以加⼊10%的⽢油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加⼊到PCR中，那⽢油在扩增反应中的浓度为0.4%，这不⾜以抑制PCR。
5. RNaseH处理：
5. RNaseH处理：
在PCR之前使⽤RNaseH处理cDNA合成反应可以提⾼灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻⽌扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。⼀般当扩增较长的全长cDNA⽬标模板时，RNaseH 处理是必需的，⽐如低拷贝的tuberous scherosisⅡ。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了SuperⅡ或AMV合成的cDNA所产⽣的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤⼀般会将RNA：DNA复合物中的RNA⽔解掉。
6. ⼩量RNA检测⽅法的提⾼：
当仅有⼩量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加⼊的作为载体的糖元有助于增加管式反应器
⼩量样品的产量。可以在加⼊Trizol的同时加⼊⽆RNase的糖元。糖元是⽔溶性的，可以同RNA保持在⽔相中以辅助随后的沉淀。对于⼩于50mg的组织或106个培养细胞的样品，⽆RNase糖元的建议浓度为250µg/ml。
在使⽤SuperⅡ的逆转录反应中加⼊⼄酰化BSA可以增加灵敏度，⽽且对于⼩量RNA，减少SuperⅡ的量并加⼊40单位的RnaseOut核酸酶抑制剂可以提⾼检测的⽔平。如果在RNA分离过程中使⽤了糖元，仍然建议在使⽤SuperⅡ进⾏逆转录反应时加⼊ BSA或RNase抑制剂。
⼆、增加RT-PCR特异性
1. CNDA合成：
第⼀链cDNA合成的起始可以使⽤三种不同的⽅法，各种⽅法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。
随机引物法是三种⽅法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退⽕，产⽣短的，部分长度的cDNA。这种⽅法经常⽤于获取5'末端序列及从带有⼆级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终⽌位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的⽐例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20µl反应体系。因为使⽤随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板⼀般选⽤ poly(A)+RNA。
倒立摆Oligo(dT)起始⽐随机引物特异性⾼。它同⼤多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA⼤概占总RNA的1%到2%，所以与使⽤随机引物相⽐，cDNA 的数量和复杂度要少得多。因为其较⾼的特异性，oligo(dT)⼀般不需要对RNA和引物的⽐例及poly(A)+选择进⾏优化。建议每20μl反应体系使⽤0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适⽤于多数RT-PCR。Thermo RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适⽤于较⾼的保温温度。
基因特异性引物(GSP)对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA⽬的序列杂交，⽽不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退⽕。⽤于设计PCR引物的规则同样适⽤于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3'最末端退⽕的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退⽕。对于部分扩增对象，为了成功进⾏RT-PCR，需要设计多于⼀个反义引物，因为⽬的RNA的⼆级结构可能会阻⽌引物结合。建议在20µl的第⼀链合成反应体系中使⽤1pmol 反义GSP。
2. 提⾼逆转录保温温度：
分闸脱扣器为了充分利⽤GSP特异性的全部优点，应该使⽤有较⾼热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较⾼温度保温以增加反应严谨性。⽐如，如果⼀个GSP退⽕温度为55℃，那么如果使⽤AMV或M-MLV在低严谨性的37℃进⾏逆转
录，GSP所带有的特异性就没有完全利⽤。然⽽SuperScripⅡ和Thermo可以在50℃或更⾼进⾏反应，这就会消除较低温度时产⽣的⾮特异性产物。为获得最⼤的特异性，可以将RNA/引物混合物直接从65℃变性温度转移到逆转录保温温度，并加⼊预热的2×反应混合液(cDNA合成热启动)。这有助于防⽌低温时分⼦间碱基配对。使⽤PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度转换。
3. 减少基因组DNA污染：
RT-PCR所遇到的⼀个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使⽤较好的RNA分离⽅法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产⽣于基因组DNA的产物，可以在逆转录之前使⽤扩增级的DNaseⅠ对RNA 进⾏处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终⽌DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离⼦，防⽌⾼温时所发⽣的依赖于镁离⼦的RNA⽔解。
钻井泥浆泵为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显⼦退⽕的引物。来源于cDNA的PCR产物会⽐来源于沾染的基因组DNA 的产物短。另外对每个RNA模板进⾏⼀个⽆逆转录的对照实验，以确定⼀个给定⽚段是来⾃基因组DNA还是cDNA。在⽆逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。
定⽚段是来⾃基因组DNA还是cDNA。在⽆逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。赞”
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