Western Blot protocol

一、试剂准备

RPIA	1 ml
PMSF	10μl
Cocktail	20μl

1. 蛋白裂解液配方：

2. 1.5 mol/L Tris.HCL(PH 8.8)

Tris base (MW 121.1) 181.7g dd H2O 800 ml

溶解之后用浓盐酸调PH至8.8（一般加几滴即可，可以在调之前先测溶解液的PH，然后再估计浓盐酸的使用量），然后定容至1L。高压灭菌后保存。

3. 1 mol/L Tris.HCL(PH 6.8)

Tris base (MW 121.1) 30.9 g dd H2O 200 ml

溶解之后用浓盐酸调PH至6.8（，可以在调之前先测溶解液的PH，然后再估计浓盐酸的使用量。一般）

PH	HCl
7.4	约17ml
7.5	约16ml
7.6	约15ml
8.0	约10ml

然后定容至250 ml，经高压灭菌后使用。

4. 10% AP （过硫酸铵）:

0.1 g过硫酸铵 + 1.0 ml Dd H2O 溶解后分装，-20℃保存。

5. 10% SDS：用900 ml的H2O加100 g SDS加热至68℃助溶，然后用浓盐酸调节PH至7.2，最后定容至1L。miae-043

6. 分离胶( 12% )[常用]：

分离胶			备注
体系	共10 ml	单位：ml	备注
dd H2O		3.3	室温保存
30% ACrglamide		4.0	4 ℃保存
1.5 mol/L Tris.HCL(PH 8.8)		2.5	4 ℃保存
10% SDS		0.1	室温保存
10% AP		0.1	- 20℃保存
TEMED		0.005	速凝，动作要快

7. 浓缩胶( 5% )：

浓缩胶			备注
体系	共10 ml	单位：ml	备注
dd H2O		2.7	室温保存
30% ACrglamide		0.67	4 ℃保存
1.0 mol/L Tris.HCL(PH 6.8)		0.5	4 ℃保存
10% SDS		0.04	室温保存
10% AP		0.04	- 20℃保存
TEMED		0.005	速凝，动作要快

8. 5 × Running Buffer（储存液）:

Tris base	15.1 g
甘氨酸	94 g
10% SDS	50 ml
dd H2O	至1000 ml

9. 1 × Running Buffer （工作液）：200 ml的5 × Running Buffer + 800 ml的dd H2O。

10. 转膜缓冲液：3.03 g Tris base + 14.4g甘氨酸溶解在少量的蒸馏水中，完全溶解后加100ml的甲醇，再用蒸馏水定容至1L。

11. 10 × TBS ( 储存液) ：24.2 g Tris base + 80 g NaCl 溶解，用Hcl调PH至7.6，最后定容至1L。

12. 1 × TBS （工作液）：100 ml的10 × TBS + 900 ml的dd H2O。

13. TBST：含0.1% 吐温—20的1 × TBS。

14. 封闭液：含5% 的脱脂奶粉的TBST。即100 ml的TBST中含5 g 脱脂奶粉。

15. 一抗、二抗稀释液：含5% BSA的TBST（或者TBS）。

16. 4× Tris.Cl/SDS ( PH 6.8)[0.5 M Tris.Cl Contaning 0.4% SDS]

方法如下：

1　将0.65g Tris base 溶解于40 mlH2O中，并用1N HCL调节PH 至6.8。

2　补足 H2O 至 100 ml 。

3　将液体转移至一个新的瓶子中，加入0.4g SDS，待其溶解后将其4 ℃保存。

17. 6× buffer的配方：

1M×Tris.HCl/SDS ( PH 6.8,0.4%SDS)	7 ml
Glycerol（甘油）	3ml
SDS	1g
DTT	0.93g
Bromphenol blue (溴酚蓝)	1.2mg
+ dd H2O	定溶至10 ml
Store in -70℃

18. 1mol DTT 的配方（二硫苏糖醇）：用0.01mol/L乙酸钠溶液（PH 5.2）溶解于3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml，小分储存于-20℃。

19. 发光液的配方：

1) 储存液：

⏹ 10 ml Luminol 250 nM in DMSO stock (-20 ℃):442.9 mg luminol in 10ml DMSO.

⏹ 5 ml P-coumaric acid 90 mM in DMSO stock(4 ℃):73.872mg P-coumaric acid in 5ml DMSO.

⏹ 1 M Tris-HCl PH 8.5、

⏹ 30% H2O2

2) 使用液：

A （Dark 4 ℃）	100 ml	B（Dark 4 ℃）	100 ml
闸道机10 ml Luminol 250 nM in DMSO stock (-20 ℃)	1 ml
5 ml P-coumaric acid 90 mM in DMSO stock(4 ℃)	440μl
1 M Tris-HCl PH 8.5	10 ml	1 M Tris-HCl PH 8.5	10 ml
30% H2O2	60μl	30% H2O2	60μl
dd H2O	88.5 ml	dd H2O	89.9 ml

WB 步骤

一、蛋白样品制备

（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1. 收集蛋白：

1　弃去原培养基，用PBS洗3次，后加胰酶消化细胞。

2　待细胞消化好后用PBS终止消化，将消化好的细胞悬液移到离心管中，用13000 rpm，离心5min。

3　弃去上层清夜，用PBS重悬细胞，再用13000 rpm，离心5min。

4　重复以上操作步骤。后弃去弃去上层清夜，用滤纸(或小头)将水分吸干，-80℃保存以备使用。

2. 提蛋白：（全部操作都在冰上进行）

1　按以下配方配制蛋白裂解液：

RPIA		1 ml
PMSF		10μl
Cocktail		20μl 自动排污阀
Cocktail	一粒+1.5 ml dd H2O 溶解		即为 7 X
	一粒+1 ml dd H2O 溶解		即为 10 X

2　加入适当的蛋白裂解液，裂解30 min，间隔振荡。

3　用13000 rpm，离心30 min。

旋转式清堵机

4　吸上清液到一个新的EP管中，做好标记并检测蛋白浓度。

5　按以下体系配制蛋白检测浓度体系：

孔号	0	1	2	3	4	5	6	7
蛋白标准浓度（μl）	0	1	2	4	8	12	16	20
dd H2O（μl）	20	19	18	16	12	6	4	0
对应蛋白量（μg）	0	0.5	1.0	2.0	4.0	6.0	8.0	10.0

6　工作液的配制：BCA试剂A：BCA试剂B=50：1。

7　每孔酶标板加20μl的待测蛋白（如稀释20倍或50倍）和200μl的工作液。

8　将酶标板振荡30 sec，37℃ 静置30 min。

9　用562 mm的波长测定蛋白浓度。

10　整理数据，根据所得的数据绘制蛋白的标准曲线，计算待测蛋白的浓度。

（2）组织中总蛋白的提取：

1. 将组织在研钵中研磨成粉末，再根据组织的量加蛋白裂解液。

2. 其它操作与提取细胞蛋白一致。

二、 SDS –聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS- PVDF）：

1. 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干(或者烤干)。使用前用酒精棉球拭擦玻璃。

2. 灌胶与上样

1　玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。可以用加样注入少许双蒸水检查是否漏液。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶。）

2　胶配制选择：（附表中附带有各种浓度的分离胶的配方）

按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用应力传感器10ml吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）

3　当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。一般凝胶时间为30min。

4　按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时

要使梳子保持水平。【由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1-2次就行了，不补胶问题也不大）。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。】

5　将制作好的胶连同支架一起转移到电泳槽内槽中，制成一个封闭的体系。（可以在内槽中加入少量的running buffer，检测封闭系统是否漏液）

6　配制上样体系（总体积不超过20μl）：根据测得的蛋白浓度计算检测蛋白的体积，（上样蛋白白含量后一般为20-50μg，实验中可以根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）；按照以下配方配制上样体系：

标本号	浓度ug/ul	每孔上样30ug	6*loading	H2O	上样量ul
1号蛋白样品	11.33094	2.64761795	3.35	14.002382	20
2号蛋白样品	12.827676	2.338693263	刷镀液3.35	14.311307	20
3号蛋白样品	10.907963	2.750284244	3.35	13.899716	20