一、 实验原理：
2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。二、 实验步骤： 1. 芽孢杆菌蛋白质的提取
将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。 水化液配置：用dd H20定容
水化液 | 浓度 | 100ml | 20ml |
尿素（60.06） | 7M/L | 42.0g | 8.4g |
硫脲（76.12） | 2M/L | 15.2g | 3.04g |
CHAPS | 4% | 4g | 0.8g |
DTT(154.2) | 1% | 1g | 一个度导航0.2g |
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（注：DTT现用现加）
3. Bradford法测蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。 取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。
例如：
标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。 a、b通过作图输入数据可知
G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。使用前滤纸过滤。
比皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
表-1 五种蛋白质测定方法的比较
方法 | 灵敏度 | 原理 | 干扰物质 |
凯氏定氮法（Kjedahl法） | 0.2～1.0mg | 将蛋白质转换为氮，用酸吸收后滴定变压器油泵 | 非蛋白氮（可用三沉淀蛋白质而分离） |
双缩脲法 （Biuret法） | 1～20mg | 多肽键加碱性铜离子生成紫络合物 | 硫酸铵，Tris缓冲液和某些氨基酸 |
Folin-酚试剂法 （Lowry法） | 5μg | 磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和 Phe还原 | 硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇 |
考马斯亮蓝法 (Bradford法) | 1～5μg | 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其λmax由465nm变为595nm | 强碱性缓冲液，TritonX-100,SDS |
紫外吸收法 | 50～100μg | 蛋白质中的酪氨酸和氨酸残基在280nm处的光吸收 | 各种嘌呤和嘧啶，各种核苷酸 |
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3. 双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水,16-18个小时）
3. 蛋白质的水化
蛋白质的上样浓度，选用胶条长度17 cm， PH 3-10：蛋白质上样量为600ug/300ml,最终体积为300ml，蛋白质含量为600ug 。 若测得蛋白质量：B为12ug/ul (600/12=50)，按每管50ul分装，加250ul水化液体，最终体积300ul（体积300ul，蛋白质含量600ug）。
IPG胶条蛋白质载样量（考马氏亮蓝R-250）
胶条长度 | 加样体积 | 样品蛋白量 |
7 cm | 125 ul | 169 ug |
11 cm | 185 ul | 250 ug |
17 cm | 300 ul | 405 ug |
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4. 取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 3-10），室温中放置30分钟。而后，用
镊子去除IPG胶条上的保护层。
5. 加样： 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。分两次吸取样品，每次300ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽一侧(17cm，pH 3—8 ， 蛋白质上样量600ug/300ul)胶条。
6．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡，使水化液浸湿整个胶条，10分钟。
7. 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶条长度,本实验2ml)，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上，盖上盖子放置在室温，14小时。（用水平仪调整胶曹的水平）
8．上胶：取出过夜的胶条，正面向上放置在用超纯水润湿的滤纸上吸除矿物油。取滤纸桥用超纯水润湿，放置在IEF的正负两级上。从正极到负极将胶条压入槽中，同时加入矿物油，注意把气泡赶出，盖上盖子。
17 cm聚焦盘
9. 对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。
其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦（16-18小时）
IPG运行条件(17cm高压锅限压阀胶条)
温度 | 20℃ |
最大电流 | 50uA per IPG strip |
胶条水化体积 | 300 (17cm IPG strip) |
电压 | 时间 |
S1 ( 50v , slow，慢速 溶胀) | 10min |
S2 ( 250v, line, 线性 除盐) | 30min |
S3 ( 1000v, rapid, 快速 除盐) | 50mine |
S4 ( 9000v, line, 线性 升压) | 4.50h |
S5 ( 9000v, rapid, 快速 聚焦) | 65000vh |
S6（火锅餐具 500v, rapid 快速 保持） | 任意时间 泄洪道 |
| |
选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。（50A/根）
设置等电聚焦时的温度。（20℃）
高通量聚焦槽
10.IEF主机通电检查，如屏幕显示如下，则为正常
BIO-RAD LABORATORIES
PROTEAN IEF CELL
FIRMWARE VERSION 1.40
SYSTEM INITIALIZATION
之后，屏幕会显示如下
REHYDRATION >
PRESET METHOD >
STORED METHOD >
NEW METHOD >
IPG胶条所需水化液体积
胶条长度(cm) | 7 | 11 | 13 | 18 | 24 |
每条需水化液体体积(ul) | 125 | 200 | 250定心支片 | 350 | 450 |
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不同胶条长度胶条等电聚焦程序设置：
7cm胶条
水化 12小时（18℃） 主动水化（50V）或被动水化
S1 250V 线性 30分钟 除盐
S2 500V 快速 30分钟 除盐
S3 4000V 线性 3小时 升压
S4 4000V 快速 20,000伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。（50A/根）
设置等电聚焦时的温度。（20℃）
11cm胶条
水化 12小时（20℃） 主动水化（50V）或被动水化
S1 250V 线性 30分钟 除盐
S2 1000V 快速 30分钟 除盐
S3 8000V 线性 4小时 升压
S4 8000V 快速 40,000伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。（50A/根）
设置等电聚焦时的温度。（17℃）
17cm胶条
水化 12小时（20℃） 主动水化（50V）或被动水化
S1 250V 线性 30分钟 除盐
S2 1000V 快速 1小时 除盐
S3 10000V 线性 5小时 升压
S4 10000V 快速 60,000伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。（50A/根）
设置等电聚焦时的温度。（20℃）
4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE
4.1 配制12.5%的丙烯酰胺凝胶两块
配胶：（最有胶液的总体积200ml）(10%SDS 3ml 称取0.3g 10% APS 3ml 称取0.3g)
(1). dd H20 62.7ml
(2).30% Acr/Bis 83.3ml （购买）
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