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一种采用HPLC同时测定多种侧链保护氨基酸异构体的检测方法与流程

fmoc-l-赖氨酸异构体的方法，实现简便、快速、稳定控制物料质量，为多肽的生产提供严格的质量控制手段。
10.其所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实施：
11.一种同时测定boc-l-丙氨酸、boc-l-谷氨酰胺、boc-fmoc-l-赖氨酸异构体的检测方法，所述方法采用高效液相谱仪，直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)为填充剂的谱柱，检测器为紫外检测器，检测波长为205nm-210nm，流速为0.8ml/min-1.2ml/min，洗脱程序为等度洗脱，柱温为25℃-35℃，进样量为10-100μl，以流动相为正己烷-醇-三氟乙酸，其中，流动相中的醇为异丙醇、或异丙醇和无水乙醇的混合醇、或异丙醇和甲醇的混合醇；
12.优选的，所述流动相正己烷-醇-tfa比例为80～85∶15～20∶0.1～0.2，优选正己烷-醇-tfa＝85∶15∶0.1；
13.优选的，所述的流动相中的醇为异丙醇；
14.优选的，所述谱柱为大赛璐chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm的手性谱柱；
15.优选的，所述的流动相的流速为1.0ml/min；
16.优选的，所述谱柱柱温为30℃；
17.优选的，所述检测波长为210nm。
18.本发明通过大量实验发现，在正己烷-醇-三氟乙酸混合体系中，当醇只有乙醇时，不能使boc-l-丙氨酸、boc-fmoc-l-赖氨酸与其异构体有效分离，而改为异丙醇或在异丙醇中加入适量甲醇或乙醇是可以有效分离的。
19.作为本技术的进一步改进，确定了流动相体系后，又进一步对其系统适应性进行研究，确定了方法的定量限，确保可以灵敏的检出异构体杂质。
20.采用上述技术方案的测定方法，可以用一种简单的谱体系，同时检测boc-l-丙氨酸、boc-l-谷氨酰胺、boc-fmoc-l-赖氨酸中异构体的含量，并且该方法灵敏度较高。
21.本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
22.(1)解决了侧链氨基被叔丁氧羰基保护这类氨基酸的手性分离问题，尤其是对boc-l-丙氨酸、boc-l-谷氨酰胺、boc-fmoc-l-赖氨酸中异构体的有效检测。本发明所述的检测方法，采用同一个谱体系实现对boc-l-丙氨酸、boc-l-谷氨酰胺、boc-fmoc-l-赖氨酸中异构体的同时检测，避免了检测过程中频繁更换谱体系及谱柱的繁琐工作，缩短了检测周期。
23.(2)该方法流动相和样品的配置简便，避免了样品处理及操作产生的误差。
24.(3)本发明检测方法具有专属性好，灵敏度高，重复性好等优点，可用于氨基酸及多肽商业化生产过程中保护氨基酸异构体的同时监控。
附图说明
25.图1为实施例1谱图。
26.图2为实施例2谱图。
27.图3为实施例3谱图。
28.图4为实施例4谱图。
29.图5为实施例5谱图。
30.图6为实施例6谱图。
31.图7为实施例7谱图。
32.图8为实施例8谱图。
33.图9为实施例9谱图。
34.图10为实施例10谱图。
35.图11为实施例11谱图。
36.图12为实施例12谱图。
37.图13为实施例13谱图。
具体实施方式
38.下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
39.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
40.下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
41.除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
42.实施例1
43.仪器与条件
44.高效液相谱仪：agilent 1100
45.谱柱：chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm
46.流动相：正己烷-异丙醇-tfa(80∶20∶0.1)
47.流速：1.0ml/min
48.检测波长：210nm
49.柱温：30℃
50.进样量：100μl
51.实验步骤
52.boc-l-丙氨酸溶液：称取约100mg boc-l-丙氨酸，置10ml量瓶，加2ml无水乙醇溶解后，用正己烷稀释至刻度。
53.boc-d-丙氨酸溶液：称取约10mg boc-d-丙氨酸，置10ml量瓶，加2ml无水乙醇溶解后，用正己烷稀释至刻度。
54.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图1，boc-l-丙氨酸的出峰时间为5.366min，boc-d-丙氨酸出峰时间为4.390min。boc-l-丙氨酸与boc-d-丙氨酸可以完全分离，峰型良好。可见流动相体系为正己烷-异丙醇-三氟乙酸时，可对异构体有较好的分离，实现对异构体杂质的检测。
55.实施例2
56.仪器与条件
57.高效液相谱仪：agilent 1100
58.谱柱：chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm
59.流动相：正己烷-无水乙醇-tfa(80∶20∶0.1)
60.流速：1.0ml/min
61.检测波长：210nm
62.柱温：30℃
63.进样量：100μl
64.实验步骤
65.溶液配置同实施例1。
66.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图2，boc-l-丙氨酸的出峰时间为4.247min，boc-d-丙氨酸出峰时间为4.403min。boc-l-丙氨酸与boc-d-丙氨酸不能完全分离。可见流动相体系中的醇不能为单独的乙醇。
67.实施例3
68.仪器与条件
69.高效液相谱仪：agilent 1100
70.谱柱：chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm
71.流动相：正己烷-异丙醇-无水乙醇-tfa(80∶15∶5∶0.1)
72.流速：1.0ml/min
73.检测波长：210nm
74.柱温：30℃
75.进样量：100μl
76.实验步骤
77.溶液配置同实施例1。
78.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图3，boc-l-丙氨酸的出峰时间为5.096min，boc-d-丙氨酸出峰时间为4.585min。boc-l-丙氨酸与boc-d-丙氨酸可以完全分离。说明在流动相体系中，在乙醇中加入一定量的异丙醇能够实现对异构体的分离检测。
79.实施例4
80.仪器与条件
81.高效液相谱仪：agilent 1100
82.谱柱：chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm
83.流动相：正己烷-异丙醇-tfa(80∶20∶0.2)
84.流速：1.0ml/min
85.检测波长：210nm
86.柱温：30℃
87.进样量：100μl
88.实验步骤
89.溶液配置同实施例1。
90.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图4，boc-l-丙氨酸的出峰时间为5.211min，boc-d-丙氨酸出峰时间为4.472min。boc-l-丙氨酸与boc-d-丙氨酸可以完全分离。说明当流动相体系正己烷-异丙醇-tfa比例为(80∶20∶0.2)时可以实现对异构体的分离检测。
91.实施例5
92.仪器与条件
93.高效液相谱仪：agilent 1100
94.谱柱：chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm
95.流动相：正己烷-异丙醇-tfa(85∶15∶0.1)
96.流速：1.0ml/min
97.检测波长：210nm
98.柱温：30℃
99.进样量：100μl
100.实验步骤
101.溶液配置同实施例1。
102.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图5，boc-l-丙氨酸的出峰时间为6.314min，boc-d-丙氨酸出峰时间为5.296min。boc-l-丙氨酸与boc-d-丙氨酸可以完全分离。说明当流动相比例为正己烷-异丙醇-tfa(85∶15∶0.1)时，可以实现对异构体的分离检测。
103.实施例6
104.仪器与条件
105.高效液相谱仪：agilent 1100
106.谱柱：chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm
107.流动相：正己烷-异丙醇-甲醇-tfa(80∶15∶5∶0.1)
108.流速：1.0ml/min
109.检测波长：210nm
110.柱温：30℃
111.进样量：100μl
112.实验步骤
113.boc-l-谷氨酰胺溶液：称取约50mg boc-l-谷氨酰胺，置10ml量瓶，加2ml无水乙醇溶解后，用正己烷稀释至刻度。
114.boc-d-谷氨酰胺溶液：称取约2.5mg boc-d-谷氨酰胺，置10ml量瓶，加2ml无水乙醇溶解后，用正己烷稀释至刻度。
115.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图6，boc-l-谷氨酰胺的出峰时间为6.761min，boc-d-谷氨酰胺的出峰时间为5.922min。boc-l-谷氨酰胺与boc-d-谷氨酰胺可以完全分离。
116.实施例7
117.仪器与条件
118.高效液相谱仪：agilent 1100
119.谱柱：chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm
120.流动相：正己烷-异丙醇-tfa(85∶15∶0.1)
121.流速：1.0ml/min
122.检测波长：210nm
123.柱温：30℃
124.进样量：100μl
125.实验步骤
126.溶液配置同实施例6。
127.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图7，boc-l-谷氨酰胺的出峰时间为9.283min，boc-d-谷氨酰胺的出峰时间为6.708min。boc-l-谷氨酰胺与boc-d-谷氨酰胺可以完全分离。可见该谱体系可以实现对boc-l-谷氨酰胺及其异构体的检测。
128.实施例8
129.仪器与条件
130.高效液相谱仪：agilent 1100
131.谱柱：chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm
132.流动相：正己烷-异丙醇-tfa(80∶20∶0.1)
133.流速：1.0ml/min
134.检测波长：210nm
135.柱温：30℃
136.进样量：10μl
137.实验步骤
138.boc-fmoc-l-赖氨酸溶液：称取约20mg boc-fmoc-l-赖氨酸，置10ml量瓶，加2ml无水乙醇溶解后，用正己烷稀释至刻度。
139.boc-fmoc-d-赖氨酸溶液：称取约10mg boc-fmoc-d-赖氨酸，置25ml量瓶，加5ml无水乙醇溶解后，用正己烷稀释至刻度。
140.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图8，boc-fmoc-l-赖氨酸的出峰时间为10.261min，boc-fmoc-d-赖氨酸的出峰时间为7.999min。boc-fmoc-l-赖氨酸与boc-fmoc-d-赖氨酸可以完全分离。说明该谱体系可以实现对boc-fmoc-l-赖氨酸及其异构体的检测。
141.实施例9
142.仪器与条件
143.高效液相谱仪：agilent 1100
144.谱柱：chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm
145.流动相：正己烷-无水乙醇-tfa(80∶20∶0.1)
146.流速：1.0ml/min
147.检测波长：210nm
148.柱温：30℃
149.进样量：10μl
150.实验步骤
151.溶液配置同实施例8。
152.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图9，boc-fmoc-l-赖氨酸的出峰时间为7.702min，boc-fmoc-d-赖氨酸的出峰时间为8.091min。boc-fmoc-l-赖氨酸与boc-fmoc-d赖氨酸不能完全分离。可见流动相体系中的醇不能为单独的乙醇。
153.实施例10
154.仪器与条件
155.高效液相谱仪：agilent 1100
156.谱柱：chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm
157.流动相：正己烷-异丙醇-tfa(85∶15∶0.1)
158.流速：1.0ml/min
159.检测波长：210nm
160.柱温：30℃
161.进样量：100μl
162.实验步骤
163.溶液配置同实施例8。
164.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图10，boc-fmoc-l-赖氨酸的出峰时间为17.816min，boc-fmoc-d-赖氨酸的出峰时间为12.847min。boc-fmoc-l-赖氨酸与boc-fmoc-d-赖氨酸能完全分离。说明在该流动相比例下，可以实现对boc-fmoc-l-赖氨酸及其异构体的分离检测。
165.实施例11
166.仪器与条件
167.高效液相谱仪：agilent 1100
168.谱柱：chiralpak ad-h，4.6
×
250mm，5μm
169.流动相：正己烷-异丙醇-tfa(80∶15∶0.1)
170.流速：1.0ml/min
171.检测波长：210nm
172.柱温：30℃
173.进样量：100μl
174.实验步骤
175.溶液配置同实施例1。
176.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图11，boc-l-丙氨酸的出峰时间为7.320min，boc-d-丙氨酸出峰时间为5.542min。该谱柱体系虽然能够实现boc-l-丙氨酸与boc-d-丙氨酸的分离，但boc-l-丙氨酸与boc-d-丙氨酸的峰型较宽，检测灵敏度低，不能实现对杂质的检出。
177.实施例12
178.仪器与条件
179.高效液相谱仪：agilent 1100
180.谱柱：chiralpak ad-h，4.6
×
250mm，5μm
181.流动相：正己烷-异丙醇-tfa(80∶15∶0.1)
182.流速：1.0ml/min
183.检测波长：210nm
184.柱温：30℃
185.进样量：100μl
186.实验步骤
187.溶液配置同实施例6。
188.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图12，boc-l-谷氨酰胺的出峰时间为10.311min，boc-d-谷氨酰胺出峰时间为6.097min。boc-l-谷氨酰胺与boc-d-谷氨酰胺虽然可以分离，但boc-l-谷氨酰胺与boc-d-谷氨酰胺的峰型极宽，检测灵敏度低，不能实现对杂质的有效检出。
189.实施例13
190.仪器与条件
191.高效液相谱仪：agilent 1100
192.谱柱：chiralpak ad-h，4.6
×
250mm，5μm
193.流动相：正己烷-异丙醇-tfa(80∶15∶0.1)
194.流速：1.0ml/min
195.检测波长：210nm
196.柱温：30℃
197.进样量：100μl
198.实验步骤
199.溶液配置同实施例8。
200.按上述条件进行高效液相谱分析，记录谱图，结果见附图13，boc-fmoc-l-赖氨酸的出峰时间为29.795min，boc-fmoc-d-赖氨酸的出峰时间为15.987min。boc-fmoc-l-赖氨酸与boc-fmoc-d-赖氨酸可以完全分离，但峰型极宽检测灵敏度低，不能实现对杂质的有效检出。
201.实施例14
202.仪器与条件
203.高效液相谱仪：agilent 1100
204.谱柱：chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm
205.流动相：正己烷-异丙醇-tfa(80∶15∶0.1)
206.流速：1.0ml/min
207.检测波长：210nm
208.柱温：30℃
209.进样量：100μl
210.实验步骤
211.将boc-d-丙氨酸、boc-d-谷氨酰胺、boc-fmoc-d-赖氨酸溶液逐级稀释，采用上述谱条件检测，至信噪比为10时，则为该方法的定量限。实验结果如下：
212.名称浓度(μg/ml)信噪比相当于供试品的百分比boc-d-丙氨酸8070.50.0085％boc-d-谷氨酰胺20450.0133％boc-fmoc-d-赖氨酸487.80.0069％
213.以上结果说明，该谱体系能够灵敏的检测0.01％以上的异构体杂质，方法灵敏度较高，对三个物料的质量控制提供了准确的测定方法。
214.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：

1.一种同时测定boc-l-丙氨酸、boc-l-谷氨酰胺、boc-fmoc-l-赖氨酸异构体的检测方法，所述方法采用高效液相谱法，以直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)为填充剂的谱柱，检测器为紫外检测器，检测波长为205nm-215nm，流速为0.8ml/min-1.2ml/min，洗脱程序为等度洗脱，柱温为25℃-35℃，进样量为10-100μl，流动相为正己烷-醇-三氟乙酸，其中，流动相中的醇为异丙醇、或异丙醇和无水乙醇的混合醇、或异丙醇和甲醇的混合醇。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相正己烷-醇-tfa比例为80～85∶15～20∶0.1～0.2，优选正己烷∶醇∶tfa＝85∶15∶0.1。3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相中的醇为异丙醇。4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述谱柱为大赛璐chiralpak ia，4.6
×
250mm，5μm的手性谱柱。5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为1.0ml/min。6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述谱柱柱温为30℃。7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测波长为210nm。

技术总结

本发明涉及一种同时测定多种侧链保护氨基酸异构体的检测方法，谱条件采用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶为填充剂的手性柱，以正己烷-醇-三氟乙酸为流动相，实现对Boc-L-丙氨酸、Boc-L-谷氨酰胺和Boc-Fmoc-L-赖氨酸中异构体的分离测定。本发明提供的检测方法的专属性、灵敏度、各吸收峰的分离度、准确度和稳定性均较好，可以实现简便、快速、稳定控制物料质量的方法，为多肽的生产提供严格的质量控制手段。供严格的质量控制手段。