网络出版时间：2020 -1 - 2 9：33 网络出版地址：htt7s ：//kgs. cnkV oegkcms/demU/34.1045. R. 2222140 1826.401. Utml
◊临床医学研究^
生物标志物和候选药物
赵旭旭12，赵卫东12，张璟鹤3陈峥峥0任萍萍、，张 影、，葛 丽0于明月0朱美玲
、
2020-08-05 接收
基金项目：安徽省自然科学基金项目（编号:1778035MH134）；安徽
省公益性研究联动计划项目（编号：1274f0874917）
作者单位/安徽医科大学附属省立医院妇产科，合肥236071
捕鼠器制作7中国科学技术大学附属第一医院妇产科，合肥2307813中国科学技术大学生命科学与医学部免疫研究所和中
国科学院天然免疫与慢性疾病重点实验室，合肥236727
作者简介：赵旭旭，男，硕士研究生；
赵卫东，男，主任医师，硕士生导师，责任作者,E-mOl : vic-/;170@ 128. com
摘要目的探究子宫内膜异位症中差异表达基因（DEG, 及其功能，筛选潜在的生物标志物和候选药物。方法 磁珠分选异位内膜和正常内膜组织中的基质细胞进行基因 表达谱分析；结合GE0数据库中可获取的同平台同类芯片 数据，利用P/mv 软件包和经验贝叶斯方法筛选DEGs，并进
行GO 和KEGG 富集分析；查询STRIGG 数据库，进行PPI 互 作网络分析，筛选核心致病基因；再检索CMAP 数据库，筛得 类药物小分子。结果869个基因在异位内膜中表达有显 著差异，其中1个上调表达250个下调表达;GO 富集分析
显示DEGs 多调控受体配体活性、通道活性和被动跨膜转运 蛋白活性等功能;KEGG 富集分析发现DEGs 多介导神经活 性配体-受体相互作用通路、细胞因子-细胞因子受体相互蛇形线
作用通路和ILD7信号通路等通路;PPI 网络表明FPR/、
SAA1RLN3、CXCL8、FPR1PF4、CCR7 和 CXCL5 共 3 个基
因是核心致病基因；经CMAP 数据库分析认为硫代罗宁和氟 *
7硝利嗪可能具有内异症的潜在价值。结论 FPR/、
SAA1RLN3、CXCL8、FPR1PF4、CCR7 和 CXCL5 共 3 个基
因是子宫内膜异位症潜在的生物标志物，硫代罗宁和氟硝利
嗪是子宫内膜异位症的候选药物。
关键词子宫内膜异位症；生物标志物；候选药物；生物
信息学
中图分类号 R7n.7、
文献标志码A 文章编号1004 -1492（2424）12 -1925 -47
doi ：14.19445/j. c/bl. issnl004 - 1490. 2420. 12. 401
子宫内膜异位症（内异症）是妇科常见的慢性、
炎症性、雌激素依赖性疾病，是导致育龄期女性出现
盆腔疼痛、月经紊乱、组织粘连和不孕的主要原
因［］。其在育龄期女性中的发病率为2% -10%,
困扰着全世界约-76亿女性［］。内异症确切的病 因和发病机制尚不清楚，缺乏特异性的药物。
被广泛接受的“经血逆流学说”认为有活性的子宫
内膜组织可随逆流经血进入盆腔，然后种植，形成内
异症。但经血逆流可发生在超过92%的输卵管未
闭的月经来潮女性中，而仅约12%的女性发病。鉴
于异位内膜与正常内膜组织具有相似的组织结构和
细胞组成，因此异位内膜细胞自身特性的改变可能
是发病的重要原因。该研究旨在检测正常内膜和卵
巢内异症的异位内膜两组基质细胞的转录谱，并结
cancer LNCap cells were cultureX in rwo , and treated with quercetin (4, 12, 42, 82 pmol/L) and methyltrans
ferase inkiVitor 5,-azo-dc( 10 mol/L) ns the cont/1 y/pp. AUer 45 h , CCK-U methoP was used / detect the in/i-
Uition rate of ill p/liferation in each y/pp. Celt /opmsis was detected Uy Uow cymmet/. Methylation status of GSTP1 yexe was ddumiup Uy methylation specific PCR(MSP). MRNA and p/teiv expression of GSTP1 in LN-
Cap cells were detected Uy real-time PCR /d Wested bUt. Results The p/liferation rate of LNCap cel-s he-
creased with the increase of quercetin dosaye and time in / cekaiv copcextratiop range ( P < 2. 05 ). The methyl/- tion of GSTP1 p/moter in LNCap cel-s decrexseX ( P < 2. 05 ) . The expression level of GSTP1 incrensed ( P <
2. 05 ) . Moreover , the decrexse of GSTP1 mRNA was nepatively correlated with the methyladon of GSTPi ype( P < 2. 05 ) . Cocclssioc Quercetin inhibited the growth an/ p/liferation of LNCap ce/s Uy reducing the methylation neLNCappenmnees2
Key worbs prostate cancer; que/ehn ; glutathione S transferase ; p/liferation
合公共数据库的基因表达谱数据，比较两组细胞的基因表达差异，分析介导疾病的主要通路和功能，筛选致病的关键基因和潜在生物标志物，并寻候选的药物。
1材料与方法
13病例资料2015年6月一2019年5月就诊于安徽医科大学附属省立医院，因卵巢内异症行卵巢囊肿剥除手术的5例女性患者。对照组的正常内膜组织取自行子宫肌瘤手术的3例患者。选取的内膜组织均为晚期分泌期（最接近反流性子宫内膜、。纳入标准：①22-03（33.5±6.0）岁；②未绝经，平素月经规律;③无子宫内膜炎。排除标准:①吸烟者;②有宫内节育器、慢性或免疫性疾病、凝血功能障碍和深静
脉血栓病史;③术前2个月内接受过抗感染、免疫抑制，激素或抗凝血剂等。患者的一般临床资料见表6所有的病理结果均由两位副主任病理医师共同诊断。本研究经安徽医科大学附属安徽省立医院伦理委员会审核通过（2019-ky066），并取得所有患者及其家属的知情同意。
机票查询接口表1入组患者的临床资料
患者编号性别
年龄
（岁）
病理诊断
是否
首诊
ASRM
弹分期
1女23卵巢异位内膜组织（左侧）是I期2女27卵巢异位内膜组织（右侧）是I期3女36卵巢异位内膜组织（左侧）是U期4女32卵巢异位内膜组织（右侧）是U期
5女25卵巢异位内膜组织（右侧）是皿期6女30卵巢异位内膜组织（右侧）是皿期7女23卵巢异位内膜组织（左侧）是V期
5女57卵巢异位内膜组织（左侧）是V期6女43正常卵巢组织是/
10女41正常卵巢组织是/
11女43正常卵巢组织是/
ASRM：美国生殖医学学会
13主要仪器及试剂DMEM/FD2购自美国Hy-cUna公司；FBS购自美国Gibco公司；IV型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶购自美国Sigma公司；青霉素-链霉素-两性霉素B购自北京索莱宝科技有限公司；CD12抗体购自美国BD公司（PE/C55377）；磁珠分选试剂盒和LS分离柱购自德国Miltevyi公司。
13分离基质细胞分离基质细胞步骤如下:①无菌条件下采集的新鲜正常内膜和异位内膜组织，置于冰浴的含12%FBS及三抗（青霉素120U/ml，链霉素0.1mg/ml，两性霉素B0.25pg/ml）的DMEM/FD2培养
液中，至实验室分离；②1x PBS 洗3次，剪碎至直径小于1mm;③转至含2.5mg/ml 的V型胶原酶和50U/ml的I型脱氧核糖核酸酶的DMEM/FD2消化液中混匀,37°C消化40min；④经60目筛网滤除未消化的组织,620r/min、4C离心6min，去除混杂的白细胞和红细胞；⑤1XPBS冲洗基质细胞，重悬备用。
13磁珠分选CD13阳性基质细胞磁珠分选CD12阳性基质细胞步骤如下:①对基质细胞离心计数，以40pUlO4个细胞的比例加入MACS buffaz重悬;②吹匀悬液，以6pl/lO2个细胞的比例加入6 pl CD12biotin-antiboda cochtail，混匀，4C避光标记22min；③MACS buffer洗1次，4C离心；④以77 p U64个细胞的比例加入MACS buffaz重悬细胞，以22pU64个细胞的比例加入mic/deabs cochtail, 0C避光标记20min;⑤加入MACS buffer洗1次,4 C离心；⑥MACS buffaz重悬，过LS柱子；⑦用MACS buffaz冲洗挂柱细胞,4C离心，得到纯化的CD12阳性基质细胞。
13基因芯片数据的下载和处理纯化的基质细胞，利用GPL6450（G0112F；AgiS/t）平台检测其全基因组表达谱。从基因表达谱综合数据库（GEO）筛得基于同平台检测分泌期正常内膜和异位内膜基质细胞的GSE120123和GSE3753两组芯片，补充6个正常内膜组织（GSM3393491-GSM3393499）和 6个异位内膜组织（GSM3343720-GSM3363725, GSM928792,GSM628800,GSM628809,GSM628805, GSM92886）o依次用Rodust Multiarray Averaga和sva hnchaga对3组芯片的原始数据进行预处理并消除批次差异，得到归一化的标准数据。采用Umma 软件包和经验贝叶斯方法筛选差异表达基因（diffeu evtial-a expressed aeoes；DEGs、，
其中P<0.05,I/p2 FoU-changel M1.0的基因被认为表达显著差异。芯片数据可从GEO数据库中获取（GSEHOIO）o
13差异基因的功能富集分析结合基因本体（GO）数据库和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库，利用cUstergro/Sr软件包对DEGs 富集通路和功能进行分析和可视化展示。符合错误发现率（FDR）<0.05且P<0.05的条件，被认为是差异有统计学意义的显著富集。
13蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建将差异基因提交到在线数据库STRING（https：// /），得到PPI数据。选择综合得分>
2. 5的PPI 节点构建PPI 网络。利用生物信息学软 件 Cytoscape v ). 7. 0( http ：//eww . cymscape. ory/)分 析候选蛋白的交互关系，对各节点蛋白相互作用蛋
白数目进行排序，筛选出核心靶点。
1.4类药物小分子化合物的筛选将差异基因分 为上、下调两组，分别输入关联性图谱(CMAP , hc
tg ：//kTW. U/adinstCute. ory/dMAP/)数据库检索。
比较差异基因与CMAP 中小分子干扰基因的表达 模式相似性，识别出与疾病相关的小分子化合物。 P <2. 91且mean 绝对值> 2. 5的小分子被认为与
疾病显著相关。
1. 4 统计学处理 使用GmphPad Pksm & 0统计 数据和做图。所有的数据均使用双尾非配对i 检验
进行分析。P<2.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1异位内膜和正常内膜组织中DEGs 的筛选 为筛选异位内膜和正常内膜组织中DEGs ，以P<
2. 05 , I Ua 2 FolP-change I =s1.6 为条件，对 25 个样本
(0个正常内膜、15个异位内膜)中1 692个基因 的表达数据进行筛选。共筛得862(7.0%)个差异
表达基因，包括12个上调基因和852个下调基因。
见图1A 。利用R 语言gn/ts 包对差异基因进行聚
类分析并可视化。见图lB o
2.2异位内膜组织中DEGs 的功能注释和通路富 集 为探究异位内膜组织中差异基因的功能，对其
进行GO 和KEGG 功能注释。GO 富集分析显示前
3位变化条目包括受体配体活性、通道活性、被动
跨膜转运蛋白活性、DNA 结合转录激活因子活性和
rna 聚合酶n 特异性、底物特异性通道活性、离子
通道活性、离子门控通道活性、门控通道活性、细胞
因子活性、神经递质受体活性。见图0A o 其中，仅 DNA 结合转录激活因子活性和RNA 聚合酶n 特异
性在病灶中被上调。KEGG 通路富集分析发现，神
经活性配体-受体相互作用通路、细胞因子-细胞
因子受体相互作用通路、、L-12信号通路、破骨细胞
分化通路、金黄葡萄球菌感染通路、尼古丁成瘾通
路出现功能紊乱。见图2B 。结果表明异位内膜组 织可能通过这些显著富集的功能条目和通路机制参 与疾病的发生、发展。
2.3异位内膜组织中差异基因PPI 网络的构建 为深入挖掘异位内膜组织中核心的致病基因和潜在
的生物标志物，将全部差异基因输入STRING 数据
库预测它们之间的相互作用网络。见图3A o 根据 各网络节点的度(dex/e ；表示网络中和节点相连路
线的条数)筛选出与其他节点蛋白相关性最强的3
个核心基因，包括甲酰肽受体2(fodiyt pepbde re
ceptor 0, FPRO )、血清淀粉样蛋白 A1 ( sepm amyloid A1, SAA1)、松弛肽 3 (reUxi/A , RLN3)、细胞介素 8
(C-D-9 mo/f chemoXi/e 8, CXCL8/IL8)、甲酸基肽 受体 1 (fodiyi peptide receptor 1 ,FPR1)、血小板因子 7 ( platlet factor 7 ,PF7)、趋化因子受体 2 ( C-C chemo-
图1差异基因的筛选和聚类分析
A ：异位内膜组织与正常内膜组织间不同表达基因的火山图;
B ：根据l/g6 F
C I 值筛选的869个差异基因的热图；Up ：上调基因；Dosn ：下调
基因；NoDiff ：
无明显差异基因
A
B
受体配体活性
通道活性
被动跨膜转运蛋白活性
DNA 结合转录激活因子活性
和RNA 聚合酶II 特异桎
底物特异性通道活性
离子通道活性
离子门控通道活性
门控通道活性
细胞因子活性 神经递质受体活性
基因数目
神经活性配体-受体相互作用通路
-细胞因子受体相互作用通路
IL-17信号通路
破骨细胞分化通路
金黄葡萄球菌感染通路
尼古丁成瘾通路
0.04
0.08
0.12
基因比率
1 2
数
图2差异基因的功能注释和通路富集分析
A ：上调和下调基因富集分析的前6个GO 条目；
B ：上调和下调基因富集分析的2条KEGG 通路
kina rece/toz typo 7 , CCR7 )和趋化因子配体 5 ( C-N- C motif chemodina 5 ,CXCL5)基因。与其相互作用
的关系对和基因如表2所示。利用小提琴图比较3 个关键基因的表达变化，结果显示它们在异位病灶
中均下调，以FPR/、SAA1和CXCL8基因的下调最 显著(i = 3. 5374=0. 41 8；1 =2. 0654=0- 46 5；
i = 2. 187、P = 0.039 2；1 = 3.022、P = 0.006 1；3 =
2.256、P = 0.033 6； i = 2.775、P = 0.012 8； i = 2. 175,P =0.039 6；1 =2.258、P =0.0337)o 见图
3B 。这些核心基因可能在异位内膜病灶的形成中 起关键作用，有望成为内异症潜在的生物标志物。
23与内异症疾病相关的类药物小分子的筛选
为寻内异症的候选药物小分子，并为进一步
实验验证提供理论依据，将异位内膜组织的差异基
因表达谱与CMAP 数据库进行比对。包括Prew twCU-692、硫代罗宁、氟硝利嗪、苯海索和喹毗罗在
内的5个小分子化合物与内异症的关联性最强(表
3)o 其中，硫代罗宁和氟硝利嗪与病灶中的差异基
因具有相反的作用机制，是拮抗内异症的潜在小分
子化合物。而PrestwCU-692、苯海索和喹毗罗与内
异症某些生物过程或状态有相似的关系，与发病可
能有类似的作用机制。硫代罗宁和氟硝利嗪的化学 分子式、作用机制和临床应用见表0o
NE EE
—Median
-10 I | | | | | | | | | | | | | | | |
图3核心差异基因的筛选及表达差异分析
A ：PPI 网络的聚类分析筛得3个核心差异基因；
B ：分别与正常子宫内膜组比较5个核心基因在异位内膜组中表达差异的小提琴图;NE ：
正常子宫内膜组;EE ：异位子宫内膜组；Median ：中位值；与NE 组比较：* P <0.25, ** P
<0.61
表2/个核心基因相关的互作基因
核心基因互作基因
数量
互作基因
FPR987CXCL3FPR9CXCR1SAA1SLC11A1MCEMP1GPR34FCAR PFF IOGB4CXCL3GPR13P2RX1CXCL6EDN4MGAM CCR7GPR51CNR9CCKBR TAS1RO DRD8KISS1CHRM1CHRM5DRD4OXT SSTRO KGS1R NTSR4RXFP8NPY4R
PPY HRH8RLN8NPBWR9HTR1A
SAA135CXCL3FPR9FPR1S127A10CXCL3CXCL6PF4NFKB4CXCR1CCR7PPY CHRM1HRH8GPR13OXT NPY4R NPB-WR4SSTRO DRD8RLN8KISSI R CNRO RXFP5CHRM5CCKBR GPR51DRD4HTR1A EDNO KISS1NTSRO TAS1RO
APOC8APOA4CRP
RLN838RXFP8CRHR1NPBWR9MC3R NPY4R LHB PTHO SSTRO HTR1A PPY TAAR4CCR7GPR13DRD8TAS1RO CXCL5 CXCL8DRD5GPR34HRH8PF4HTR6CXCR1FPRO CXCL6SAA1GPR81GPR25FPR1DRD4CNRO HRH4GPR45 CXCL336CXCR1IT1B FPRO CCR7SAA1FPR1PFF CXCL6CXCL5MMP4CNRO HTR1A DRD4CRP DRD8PPY NPBWRO NPY4R GPR13SSTRO GPR51RLN8HRH8RXFP5TAS1RO IT1RN MMP1FOS MUC5AC MMP8
FPR127FPRO SAA1CXCL3CXCR1NPY4R PF4CXCL3GPR13NPBWRO CCR7CXCL6DRD8DRD4CHRM1TAS1RO SSTRO CNRO GPR51HRH8HTR1A PPY CEACAM6RXFP8RLN8TREM1AQP4
PF425CXCR1SERPIOFO CXCL3CCR7CXCL6FPRO FPR1SAA1CXCL3ORM4CNRO GPR13GPR51NPBWRO HRH8 TAS1RO RLN8DRD8NPY4R PPY HTR1A RXFP8SSTRO DRD4PHF14
CCR724CXCL1CXCL5PFF GPR13CXCL6CXCR1FPR1FPRO CNRO GPR51SAA1DRD8DRD4RLN8SSTRO RXFP8HRH8 PPY NPY4R TAS1R0NPBWRO HTR1A CCL13PRF1
CXCL524CXCR1CXCL1CCR7SAA1CXCL6FPR1FPRO PFF CNRO GPR51GPR13RLN8NPBWRO
DRD8HTR1A SSTRO NPY4R HRH8TAS1RO RXFP8DRDO PPY IT1B MMP9
表8CMAP数据库筛选出的关联度最强的5种小分子化合物
化合物关联系数P值
PpstcicU-6927.6330200002
硫代罗宁-7.6640200018
氟硝利嗪-7.5999.0078
苯海索7.619.00733
喹毗罗7.5449.00770
表4负相关小分子化合物的作用机理及应用
CMAP名称药物分子式主要作用机制主要应用
空调百叶风口硫代罗宁
控制DNA转录
联络柜和蛋白质合成,
促进糖异生，增
加糖原储藏的
利用和动员，并
刺激蛋白质合
成，增加基础代
甲状腺功能减
退的替代疗法2
辅助甲状
腺癌，在轻度甲
亢或甲状腺自
主性抑制试验
中作为诊断试C1-H10-G-N-A7谢率。剂
氟硝利嗪
选择性钙进入
阻滞剂，具有钙
调蛋白结合特
性和组胺H1
阻断活性。
C27-H27-92-D2
预防偏头痛2闭
塞性周围血管
疾病，中枢和外
周起源的眩晕2
并作为癫痫治
疗的佐剂。
8讨论
异内症作为一种慢性炎症性疾病，可引起严重的慢性疼痛（痛经、性交困难、腹痛）和一系列生殖问题，长期困扰着世界各地数以百万计的女性。尽管越来越多的证据表明遗传、内分泌、免疫、微生物和环境因素与异内症的发病相关［］，但明确内异症的病因、发病机制和开发特异物仍是难点。
本研究表明异位内膜和正常内膜的基因表达谱整体相似，仅少部分基因差异表达，以下调基因为主。在异位内膜病灶中受体配体活性、细胞因子活性和神经递质受体活性的改变可能介导疾病的发生和疼痛的调节，神经活性配体-受体相互作用通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路和16-12信号通路
等通路的调控紊乱也与疾病发生密切相关，这与之前的研究相符［］。深入分析病灶中的基因改变,FPR9、SAA11RLN3、CXCL8、FPR1、PF4、CCR2和CXCL5共3个基因被认为是关键的致病因素，是内异症潜在的生物标志物。本研究首次显示SAA1在人内异症病灶中的表达降低。已有研究表明SAA是由肝细胞产生和释放的一种急性期蛋白，参与维持黏膜组织中的免疫平衡，在肉牛子宫内膜的正常和炎症状态中均表达⑷。炎症消退后SAA1的高表达被认为参与了子宫内膜组织中免疫平衡的重建，因此，人内异症中低表达的SAA1可能反应了组织中的炎症状态⑷。与Volpato et at［］的研究一致，本研究显示，在分泌晚期异位内膜中FPR6和FPR1的表达水平均降低。膜粘连蛋白A1激活甲酰基肽受体2/阿司匹林触发脂蛋白（FPR2/ALX）可诱导M1型巨噬细胞向M2型分化，并减弱病灶中
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