赵博;邓美林;杨小珊;段云鹏;吴晓琴;屠大伟
【摘 要】建立了分散固相萃取-同位素稀释-气相谱-串联质谱同时测定动物源性食品中9种N-亚硝胺的方法.样品用乙腈提取,上清液经分散固相萃取(dSPE)净化后浓缩.选用DB-WAX极性毛细管谱柱对待测物进行分离,经EI源电离后以多反应监测(MRM)模式采集数据并做定性筛查和定量分析.9种N-亚硝胺在相应的浓度范围内线性关系良好,相关系数均大于0.99,对4类典型的动物源性食品进行3个不同浓度的加标试验,平均回收率为62.5％ ～1 18％,RSD为2.11％～ 25.6％,检出限(LOD,S/N=3)为0.02 ～0.31 μg/kg.该方法成本低廉、灵敏可靠,适用于同时对动物源性食品中9种N-亚硝胺进行定性和定量测定.铁氧体电感
【期刊名称】《谱》
【年(卷),期】2016(034)010
【总页数】7页(P998-1004)
【关键词】分散固相萃取;同位素稀释;气相谱-串联质谱;N-亚硝胺;动物源性食品
【作 者】赵博;邓美林;杨小珊;段云鹏;吴晓琴;屠大伟
【作者单位】重庆市食品药品检验检测研究院,重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心,重庆401121;重庆市食品药品检验检测研究院,重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心,重庆401121;重庆市食品药品检验检测研究院,重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心,重庆401121;重庆市食品药品检验检测研究院,重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心,重庆401121;重庆市食品药品检验检测研究院,重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心,重庆401121;重庆市食品药品检验检测研究院,重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心,重庆401121
【正文语种】中 文
【中图分类】O658
N-亚硝胺类化合物是国际公认的一类强致癌物,是四大食品污染物之一,目前已知的300种亚硝胺类化合物中,90%至少可诱导一种动物致癌。N-亚硝胺类化合物的前体物是亚硝酸盐、氮氧化物和胺类,这些物质广泛存在于食品中,至今还没有发现有一种动物对亚硝胺的致癌作用有抵抗力。近年来的研究表明人类胃癌和食管癌病与N-亚硝胺类化合物关系密切[1]。
目前《食品污染物限量》(GB 2762-2012)中规定N-亚硝基二甲胺(NDMA)在肉及肉制品(肉类罐头除外)中的含量≤3.0 μg/kg,水产制品(水产品罐头除外)中的含量≤4.0 μg/kg。推荐的检测方法GB/T 5009.26-2003中方法一需要专用的热能分析仪,方法二需要分辨率大于7 000的气相谱-高分辨质谱仪,样品前处理复杂、耗时长,适宜范围较窄,且两种方法所用的谱柱均为填充柱,而现在分析实验室大多配毛细管谱柱和质谱检测器,上述两种方法已严重不适应实验室对N-亚硝胺类化合物常规检测的要求。
目前报道测定动物源性食品中N-亚硝胺的方法较少,研究多集中在非动物源性食品检测方面,主要使用气相谱-单极质谱法[2-10]、气相谱-氮磷检测法(GC-NPD)[11]、气相谱-氢火焰检测法(GC-FID)[12]、气相谱-热能分析法[13]、液相谱-串联质谱法[14,15]和液相谱法[16]。采用气相谱-单极质谱法易产生N-亚硝基二甲胺假阳性;气相谱和液相谱法灵敏度较低且难以实现确证分析;气相谱-热能分析仪为专用设备,实际可操作性不强;液相谱-串联质谱法对低质量数N-亚硝胺响应不足。气相谱-串联质谱法(GC-MS/MS)具有高特异性和高灵敏度,是目前针对低残留物质广泛采用的检测方法。
动物源性食品普遍油脂含量高,腌制肉制品素含量高,凤爪、罐头等产品水含量高,传统的
蒸馏法存在重现性差的缺点,而固相萃取法需不同功能的萃取柱对素、油脂和水分进行净化,存在耗时长和成本高的不足。分散固相萃取(dSPE)具有简便、快速和廉价的特点,被广泛应用于植物性食品中多农药残留的检测,近年来国内外学者已将该技术引入到动物源性食品中兽药[17-23]和农药[24]的检测中。本文通过优化样品前处理及谱-质谱条件,建立了分散固相萃取-同位素稀释-气相谱-串联质谱同时快速测定动物源性制品中9种N-亚硝胺的方法,该方法适用的动物源性食品种类覆盖面广,提取净化效果好,成本低廉,灵敏度高,选择性好。采用同位素内标定量能有效消除基质效应,结果准确可靠,为动物源性食品检测提供了技术支持。
1.1 仪器与试剂
水面曲线
共享单车立体车库SHIMADZU TQ8040三重四极杆质谱仪,配岛津GC-2010 plus气相谱仪(日本岛津公司);Allegra X-30R离心机(美国贝克曼仪器有限公司); Vortex 2漩涡混合器(德国IKA仪器有限公司); MD200-2氮吹仪(杭州奥盛仪器设备有限公司);乙腈、乙酸乙酯均为谱纯(德国Sigma公司);氯化钠(分析纯,重庆川东化工有限公司);无水硫酸镁(分析纯,成都科龙有限公司),十八烷基键合硅胶吸附剂(C18E)和N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)(上海月旭股份有限公司)。
9种亚硝胺混合标准品:NDMA、N-亚硝基甲乙胺(NMEA)、N-亚硝基二乙胺(NDEA)、N-亚硝基二正丙胺(NDPA)、N-亚硝基二正丁胺(NDBA)、N-亚硝基吡咯烷(NPYR)、N-亚硝基(NPIP)、N-亚硝基吗啉(NMorPh)、N-亚硝基二苯胺(NDPhA)购自美国Supelco公司,质量浓度均为2 000 mg/L,除N-亚硝基吗啉纯度为96.6%外,其余纯度>99.5%; N-亚硝基二甲胺-d6(NDMA-d6,1 000 mg/L)和N-亚硝基二正丙胺-d14(NDPA-d14,1 000 mg/L)购自美国AccuStandard公司。
J&W DB-WAX毛细管谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)购自美国Agilent公司。
1.2 标准溶液的配制
混合标准储备液:准确移取9种N-亚硝胺标准溶液各0.5 mL至100 mL容量瓶中,用乙腈配制成10 mg/L的N-亚硝胺混合标准储备液;准确移取两种同位素内标(NDMA-d6和NDPA-d14)溶液各0.5 mL至50 mL容量瓶中,用乙腈配制成10 mg/L的混合内标储备溶液。置于棕瓶中,保存于-20 ℃。
混合中间储备液:准确移取混合标准储备液和混合标准内标储备液各1 mL至两个10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯分别稀释成1 mg/L的混合中间储备液。置于棕瓶中,保存于-20 ℃下。
混合标准工作溶液:使用前将混合标准中间储备液放至室温,吸取一定量的混合标准中间储备液和30 μL混合内标中间储备液,用乙酸乙酯稀释至1 mL,溶液中NDMA-d6和NDPA-d14的质量浓度均为30 μg/L。
1.3 样品处理
准确称取匀质试样10.00 g(精确至0.01 g),含水量较少的干质试样取样量为5.0 g,置于50 mL聚丙烯离心管中,加入90 μL混合内标中间储备液后加入15 mL乙腈,涡旋2 min混匀,再加入脱水试剂(4.0 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠),振荡1 min后以8 000 r/min离心5 min,取7 mL上清液于分散固相萃取管中(吸附剂为1 000 mg无水硫酸镁、200 mg C18E和100 mg PSA),漩涡1 min混匀后以8 000 r/min离心5 min,取5 mL上清液至氮吹管中,用氮气吹至近干,用乙酸乙酯定容至1 mL,将样品液移入瓶垫不含碎片离子m/z=74的进样瓶中,待测定。
RT: retention time; CE: collision energy; ion ratio: peak area ratio of the qualitative ion to quantitative ion. * Quantitative ion.
1.4 GC-MS/MS条件
簧网谱条件 J&W DB-WAX毛细管谱柱。程序升温:初始温度50 ℃,保持1 min,以10 ℃/min升温至110 ℃,以15 ℃/min升温至200 ℃,以40 ℃/min升温至240 ℃,保持8 min。进样口温度:240 ℃,进样口压力:250 kPa,保持1 min后压力降为35.3 kPa。进样模式:不分流进样,进样量为1 μL,分流平板1 min后打开,分流比为10∶1。载气:He(纯度>99.999%),线速度:36.3 cm/s。传输线温度:230 ℃。
防火拉链
质谱条件 离子源温度:240 ℃;电离方式:电子轰击离子(EI)源;电子能量:70 eV;电子倍增器电压:1.01 kV(MRM模式下相对于调谐结果+0.6 kV);碰撞气:Ar(纯度>99.999%)；碰撞气压力:200 kPa;采集模式:MRM模式;两个四极杆分析器(MS1及MS2)的分辨率:单位质量分辨率(Unit)；溶剂延迟时间:5 min。
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2.1 谱条件的优化
9种N-亚硝胺化合物的极性差异较大。在参考已有文献[25]的基础上,考察了N-亚硝胺在中等极性和强极性毛细管谱柱上的谱行为。结果表明:选用Agilent J&W DB-17毛细管谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)时,N-二甲基亚硝胺的谱峰形较差,分离效果不佳;选用极性谱柱DB-WAX时,所有谱峰都是尖锐的窄峰,且峰形对称,大多数化合物分离度高,几乎达
到基线分离。因此选用DB-WAX谱柱作为实验用谱毛细柱。通过试验发现,上述文献[25]报道的6种N-亚硝胺的气相谱程序升温条件满足本实验的9种N-亚硝胺及其2种内标物的测定要求。随着温度升高,谱柱柱流失增加,所以在13.0～16.5 min关闭灯丝。
2.2 质谱条件的优化
使用单针进样分析目标化合物的混合标准中间储备液,对9种N-亚硝胺及其2种内标物进行质谱全扫描分析。化合物进入一级质谱后,确定母离子,母离子进入二级质谱,对化合物的碰撞电压进行优化。在子离子扫描(product scan)模式下,对化合物母离子逐一施加一定步长的碰撞能量(CE),目标化合物发生断裂或重排等反应，产生不同的离子碎片,得到不同碰撞能量下相应的离子碎片,根据欧盟发布的2002/657/EC决议[26],每个目标化合物选取2对最具特征且响应最高的MRM离子及相应的仪器参数作为最终的质谱采集参数(见表1)。
按照上述优化的GC-MS条件,对9种N-亚硝胺及2种内标化合物进行分析,得到11种化合物的总离子流图(见图1)。
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