超高效液相谱-串联质谱法测定阿胶中马、牛、羊、猪、骆驼、鹿皮源成分 杭宝建;田晨颖;陈晓;邢晟;石峰;冷佳蔚;巩丽萍
湿厕巾【摘 要】A method was established for detecting the ingredients of horse,ox,sheep,pig, camel and deer skin in colla corii asini using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). Theoretical marker peptides were selected by comparing the collagen sequences in the skins of donkeys,horses,oxen,sheep,pigs,camels,and deer. Marker peptides were identified by protease cutting techniques and high resolution mass spec-trometry and then analyzed by UPLC-MS/MS. The separation was performed on a UPLC system with a BEH C18 column via the gradient elution of acetonitrile containing 0.1%(v/v)acetic acid and water containing 0.1%(v/v)acetic acid. The marker peptides were identified in the modes of electrospray positive ionization(ESI+)and multiple reaction monitoring(MRM). The marker peptides for the horse,ox,sheep,pig and camel skin were detected in 15 samples. The method is simple,highly reproducible,and suitable for the identification of mixed skin ingre
di-ents in colla corii asini. It has been successfully used to detect the authenticity of colla corii asini.%建立了阿胶中马、牛、羊、猪、骆驼、鹿皮源成分的检测方法.通过比对驴皮和马皮、牛皮、猪皮、羊皮、骆驼皮、鹿皮胶原蛋白的序列,采用蛋白酶切技术和高分辨质谱技术发现理论的各杂皮胶原蛋白特征肽.同时建立三重四极杆质谱筛查方法,以含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液和0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相,梯度洗脱,电喷雾离子源(ESI)正离子扫描模式,多反应监测.15批阿胶样品检出了杂皮源成分.该方法操作简便,专属性强,可用于阿胶中杂皮源成分的鉴别,并已成功用于阿胶日常打假监督抽验工作. 【期刊名称】《谱》
【年(卷),期】2018(036)004
【总页数】5页(P408-412)
【关键词】超高效液相谱-串联质谱;特征肽;胶原蛋白;阿胶
【作 者】杭宝建;田晨颖;陈晓;邢晟;石峰;冷佳蔚;巩丽萍
可降解塑料检测
【作者单位】山东省食品药品检验研究院,山东济南250101;山东中医药大学,山东济南250355;山东省食品药品检验研究院,山东济南250101;山东省食品药品检验研究院,山东济南250101;山东省食品药品检验研究院,山东济南250101;山东省食品药品检验研究院,山东济南250101;山东省食品药品检验研究院,山东济南250101
互动投影装置【正文语种】中 文
【中图分类】O658
阿胶出现于先秦,至汉代已成为常用药物,具有补血益气、滋润养颜、提高机体免疫力等功能,可用于失血贫血、缺铁贫血、再生障碍贫血及年老体弱、儿童、妇女的滋补[1-4]。近年来,驴皮资源短缺,阿胶生产企业为了解决原料紧缺问题及降低成本,采用供应量大的马、牛、猪、羊、骆驼、鹿皮等低值皮进行掺假,而现有标准仅对牛皮源成分进行控制,未控制上述其余杂皮的检查,因此急需对现有标准进行提升。
皮的主要成分胶原蛋白经高温熬制后成为不完全水解的肽段,不同物种的胶原蛋白经胰蛋白酶酶切后可形成物种特异性的多肽[3-5]。本研究参考文献[6-8],采用蛋白酶酶切技术和质谱
多肽识别技术建立了马、牛、羊、猪、骆驼、鹿等非驴皮源成分的掺假鉴别方法,可有效控制阿胶掺假现象,提升产品品质。
表 1 几种动物特征肽的序列及离子信息Table 1 Sequence and ion information of the marker peptides of several kinds of animalsMarkerpeptideSequencetR/minParention(m/z)Production(m/z)Cone/VCollisionenergy/eVHorseGASGPAGVR2．95386．4377．4∗4022322．34021OxGEGGPQGPR1．54427．9668．4∗5025329．45026SheepGFPGSDGVAGPK(3hydroxylation)10．08553．0450．9∗5221787．55235PigGPTGPAGVR6．29406．5657．6∗4525556．64524CamelSGHPGTVGPAGLR9．31407．9416．1∗4019570．24016DeerSGETGASGPPGFAGEK(10hydroxylation)9．75732．8875．6∗4738962．64737
* Quantitative ion.
本研究通过提取阿胶原材料驴皮及掺假马、牛、猪、羊、骆驼、鹿等杂皮的胶原蛋白,采用蛋白质组学技术,将驴皮与掺假皮源进行蛋白质组比对,出各杂皮的理论特征肽,同时采用
高分辨质谱结合蛋白搜库技术对理论特征肽进行序列及结构的验证,根据确证的杂皮特征肽,采用超高效液相谱-串联质谱法建立了马、牛、羊、猪、骆驼、鹿等非驴皮源成分的掺假鉴别方法,可有效控制阿胶掺假现象,提升产品品质。
1 实验部分
1.1 仪器与试药
AB SCIEX Triple Quad 6500+超高效液相谱-三重四极杆质谱联用仪(AB公司); KQ-300GDV型恒温数控超声器(昆山市超声仪器有限公司); Vortex-6涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
甲醇、乙腈均为谱纯(德国Merck公司)、甲酸为谱纯(美国Fisher公司),胰蛋白酶为优级纯(美国西格玛公司),水为去离子水(Milli-Q纯水系统生产),碳酸氢铵为分析纯(上海国药集团)。
对照品:马皮特征肽、牛皮特征肽、羊皮特征肽、猪皮特征肽、骆驼皮特征肽、鹿皮特征肽对照品均由上海强耀生物有限公司合成,纯度为98%。
样品:研究用阿胶、马、牛、羊、猪、骆驼、鹿皮胶样品为实验室自制,其余阿胶样品为日常监督抽验样品,共15批。
引向器1.2 马、牛、羊、猪、骆驼、鹿皮特征的序列鉴别
本工作参考文献[9],通过提取阿胶原材料驴皮及掺假马、牛、猪、羊、骆驼、鹿等杂皮的胶原蛋白,采用蛋白质组学技术,将驴皮与掺假皮源进行蛋白质组比对,出各杂皮的理论特征肽,同时采用高分辨质谱结合蛋白质搜库技术对理论特征肽进行序列及结构的验证,序列见表1。
1.3 谱、质谱条件
液相谱条件:谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),流速0.3 mL/min,流动相A为0.1%甲酸溶液,B为0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脱程序:0～3 min, 4%B; 3～8 min, 4%B～8%B; 8～15 min, 8%B～50%B; 15～16 min, 50%B; 16～16.1 min, 4%B; 16.1～25 min, 4%B;流速:0.3 mL/min。
质谱条件:电喷雾离子源(ESI)正离子扫描模式,多反应监测;离子源温度:550 ℃。定性、定量
离子对、锥孔电压、碰撞能量见表1。
1.4 标准溶液及样品溶液的制备
标准溶液:取研究用自制阿胶样品0.1 g,置于50 mL量瓶中,加入质量分数约为1%的NH4HCO3水溶液(1 g固体,加入100 mL水溶解)40 mL,超声处理30 min,使样品完全溶解并加1% NH4HCO3水溶液定容至刻度,摇匀,得阿胶基质溶液。分别取马、牛、羊、猪、骆驼、鹿皮特征肽适量,加阿胶基质溶液制成各特征肽质量浓度为2 μg/mL的溶液,作为标准储备溶液。系列标准溶液用阿胶基质溶液配制,现用现配。
样品溶液:取胰蛋白酶适量,加1% NH4HCO3溶液溶解,制成质量浓度为1 μg/μL的胰蛋白酶溶液。取阿胶样品0.1 g,置于50 mL量瓶中,加1% NH4HCO3溶液40 mL,超声处理30 min,使样品完全溶解并加入上述1% NH4HCO3溶液定容至刻度,过0.22 μm滤膜,取100 μL续滤液至300 μL微量进样瓶中,同时加入上述1 μg/μL的胰蛋白酶溶液10 μL,摇匀,37 ℃恒温酶解12 h,即得。彩铅芯
表 2 几种动物特征肽的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限Table 2 Linear
ranges, regression equations, correlation coefficients (R2), LODs and LOQs for the marker peptides of several kinds of animalsMarkerpeptideLinearrange/(mg/L)RegressionequationR2LOD/(ng/kg)LOQ/(ng/kg)Horse0．02-2．0Y=3．052×107X+1．369×1060．9998933Ox0．02-2．0Y=9．077×107X+1．808×1060．99721960Sheep0．02-2．0Y=6．208×108X+2．101×1070．999128Pig0．02-2．0Y=1．697×107X+3．010×1050．998739120Camel0．02-2．0Y=2．839×106X+9．242×1040．99901030Deer0．02-2．0Y=1．742×107X+1．715×1050．999950160
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