L-鼠李树胶糖激酶在D邛可洛酮糖合成中的应用
温俊婷$2，李子杰12，高晓冬*$，2
（1.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122；2.江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）
摘要：D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-psicose-3-epimerase,DPE)可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的可逆反应，但D-阿洛酮糖的产率较低％L-鼠李树胶糖激酶(L-rhamnulose kinase,RhaB)具有磷酸化酮糖类物质的活性，将其与DPE偶联，可以打破DPE的可逆平衡，从而提高D-阿洛酮糖的产率％在反应体系中引入多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK)，可实现ATP的再生，降低反应的成本。本实验在大肠杆菌Rosetta(DE3)中分别过表达DPE、RhaB和PPK，优化其反应条件，计算产物得率。结果表明，RhaB的相对分子质量约为5.3x10*，最适pH和温度为8.0 和35"。将DPE和RhaB偶联，最适条件如下：pH8.5，温度35"，最适金属离子Mg2+,DPE和RhaB酶量比(质量比)1：2，产物得率为70%。将DPE、RhaB和PPK偶联,ATP浓度降为D-果糖的1/5,D-阿洛酮糖得率为50%。本研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供理论依据％ 关键词：D-阿洛酮糖;L-鼠李树胶糖激酶;D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；多聚磷酸盐激酶
中图分类号:Q814.9文章编号:1673-1689(2020)12-0049-08D01:10.3969/j.issn.1673-1689.2020.12.008 Application of L-rhamnulose Kinase on Production of D-psicose
WEN Junting1,2,LI Zijie1,2,GAO Xiaodong61,2
(1.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi214122,China@ 2.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,China)
Abstract:D-psicose can be produced from D-fructose using D-psicose-3-epimerase(DPE). However,the reaction catalyzed by DPE is reversible,which eventually reaches equilibrium between the D-fructose and D-psicose leading to a low conversion rate.L-rhamnulose kinase(RhaB) catalyzes the phosphorylation of ketoses in an irreversible way.In a cascade reaction based on the combination with DPE,RhaB can break the equilibrium by phosphorylating the D-psicose.Thus,an increased production of D-psicose can be expected.Polyphosphate kinase(PPK)is overexpressed in the cascade reaction to establish the ATP-regeneration system in order to reduce the industrial costs. DPE,RhaB and PPK were overexpressed in coH Rosetta(DE3)respectively to explore the optimum condition and the product yield.RhaB protein with a molecular weight of5.3x104was thus ac
hievedat pH8.0under35".When RhaB coupled with DPE,the consequent yield of D-psicose could reach70%under optimum ,pH8.5,35",Mg2+and DPE:RhaB of1：2.In the cascade reaction of DPE and RhaB combined with PPK,the ATP concentration was reduced to1/5 of D-fructose and the yield of D-psicose was50%.The results provide a theoretical basis for the
收稿日期：2019-04-17
基金项目：国家自然科学基金项目(21778023)。
p通信作者：高晓冬(1965—)，男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事细胞分子生物学和生物化学研究&E-mail:******************
很2020年第39卷第12期
WEN Junting,et al；Application of L-rhamnulose Kinase on Production of
D-psicose
industrial production of D-psicose.
Keywords:D-psicose,L-rhamnulose kinase,D-psicose-3-epimerase,polyphosphate kinase
稀有糖(rare sugar)指自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物叫目前已发现34种稀有糖及糖醇倒，包括D-阿洛酮糖、D-塔格糖、D-阿洛糖等#稀有糖具有独特的生物活性，可作为添加剂改善食品的理化性质冈，发挥多种生理功能因此在食品、保健、医药等领域引起了广泛关注。
D-阿洛酮糖(D-psicose)属于稀有糖中的一种，其甜度为蔗糖的70%，但能量仅为蔗糖的0.3%，具有低热量的特性，可作为蔗糖的食用性替代物'日。随着稀有糖研究的不断推进，D-阿洛酮糖了广泛的关注，其在医疗、保健具有功效，如
糖冈、'刃，因用于糖病患者的食用㈣。另外，D-阿洛酮糖可以作为肝脂类酶问和: !-糖的剂，少[12]，具有减肥功效。
D-阿洛酮糖在自然界中含量极少，主要存在于小麦、物以及甜菜糖蜜中[13-14]O目前应用较广泛的为化和生物。相较于化，生物的优势更为，例如反和、物少、于目的物的化，因此
化生问。
目前的用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-psicose-3-epimerase，DPE)催化D-糖和D-阿洛酮糖之间的化'1:-17)#但于
DPE化的异构化一可的，以D-阿洛酮糖的低何。因此，化反应的化生产D-阿洛酮糖的# L-鼠李树胶糖
激酶(L-rhamnulose kinase，RhaB)是己糖-hsp70-购，其N 域是ATP的，可以ATP的结
#RhaB一种物特性㈣，
代谢L-糖及的关一㈤。其催化的物为C3-R构型的稀有糖，D-阿洛酮糖#的化为：D-阿洛酮糖磷酸化生成D-阿洛酮糖-1-，消耗一分子ATP，生成对应的ADP#由于RhaB催化的为不可，因此DPE与RhaB串联，可以破坏异构化反应的平衡，从D-阿洛酮糖的，有于工业化生产#
多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase，PPK)分为2种：多聚盐1(PPK1)和多聚盐
酶2(PPK2)，其中PPK1负责多聚磷酸盐(polyphosphate，polyP)的合成以及ATP的代谢(合严，参与的促为：
龙脑抑菌剂ATP+polyP n-1!ADP+polyP…
PPK2主要负责GTP的代谢，中只有PPK1，不存在PPK2㈣。由于PPK1催化的反应为可，当ATP/ADP值偏低时,PPK1可催化ADP 化为ATP^。因此，本文中用来源的PPK1参与的ATP再生过程，以减少反应中ATP 的用量和ADP的积累，从低D-阿洛酮糖的本。
本研究中将重组蛋白RhaB在大肠杆菌中大量表达，以D-阿洛酮糖为物，研究RhaB的性质，并对纯酶RhaB的进行优化。,
梭状芽抱杆菌(Clostridium cellulolyticum H10)来源的DPE和来源的RhaB偶联，以D-果糖为物，化偶联系的，计算反应的
化率。后，将DPE、RhaB和li)三酶偶联，低ATP的用量，D-阿洛酮糖。
1.1试验材料
1.1.1质粒和菌株pET-28a质粒：购于Novagen 公司；pET28a-r345、pET28a-pp7：作者所在实验室构建；MG1655和Rosetta(DE3)：作者所在实验室保存；pET28a-8pe：作者在实验室前期构建的质粒。
1.1.2酶、试剂及耗材限制性内切酶和DNA连接酶：购于TaKaRa生物公司；腺-5'-三磷酸二钠盐(ATP"和多聚磷酸盐(polyphosphate,polyP)：购于上海生工生物公司；卡那霉素、异丙基-"-D-硫代半乳糖昔(IPTG)、酸性磷酸酶！acid phosphatase from sweet potato,AP)：购于Sigma-Aldrich公司；Ni2+亲和层析柱：购于GE公司；D-果糖：购于阿拉丁有限公司；D-阿洛酮糖：购于TCI(上海"化成工业发展有
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温俊婷，等：L-鼠李树胶糖激酶在D-阿洛酮糖合成中的应用
绝缘法兰
限公司；C ig谱柱(250mm x4.6mm)和Sugar-Pak™谱分析柱(300mm x6.5mm)：购于Waters公司。1.1.3培养基及其他溶液配制TB培养基：酵母抽提物(24g/L)，胰蛋白：(12g/L),K2HPO4-3H@O (16.4g/L),KH2PO+(2.31g/L)，甘油体积分数0.4%。LB固体培养基：胰蛋白：(10g/L)，酵母抽提物(5g/L),NaCl(10g/L)，琼脂粉(20g/L)；湿热灭菌121",20min。
蛋白质纯化缓冲液：1)裂解、平衡缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),150mmol/L NaCl；洗涤缓冲液：25mmol/L Tris-HCl(pH8.0),150mmol/L NaCl,60mmol/L imidazole；2)洗脱缓冲液：25mmol/L Tris-HCl(pH8.0),150mmol/L NaCl,500mmol/L imidazole；3)脱盐缓冲液：25mmol/L Tris-HCl(pH &0),50mmol/L NaCl。
1.2仪器与设备
PCR分析仪:Eppendorf公司产品；Bio-Rad Power/PAC300电泳仪：美国伯乐公司产品；高效液相谱仪HPLC：日本日立公司产品；超声波细胞粉碎机：南京新辰生物科技有限公司产品+
1.3实验方法
1.3.1重组质粒的构建采用PrimeSTAR聚合酶进行PCR时，以BL21菌液，以rhaB-F：5#-GCGCGGATCCATGACCTTTCGCAATTG TGTC-3$($#%H I)为上游引物，以rhaB-R：5$-GCG CAA
GCTTTCATGCGCAAAGCTCCTTTGT-3'(Hin d III)为下游引物来扩增rhaB基因+采用Bam H I和Hind III2种限制性内切酶分别对pET-28a和rhaB 基因进行双酶切理,37"3h。，对酶切产物进行，并用DNA酶ligationmix基和质进行，16"静置2h。产物菌,25min, 42"热激40s，冰上放置3min。将转化产物涂布于有性平进行，化子进行菌PCR，并进行质粒提取、酶切和基因测序，体pET28a-rhaB。pET28a-
*p e质粒。pET28a-pp-+
1.3.2重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达将重组质粒pET28a-rhaB转入大肠杆菌Rosetta(DE3) ，化，LB-Kan平板上,37"
培养，化5mL LB-Kan培养基中37"过夜培养后，取500!L培养基，离心收集菌体品，2mL200mL TB-Kan培养基中，37"摇床培养3~4h，待OD600为0.6~0.8时，加入IPTG诱导(终浓度0.1 mmol/L),16"诱导20h，取500“L培养基，离心收菌体品，5mL菌体超声碎，分液和用于SDS-PAGE检测。
余培养基菌体，-20"保存待用。
1.3.3重组蛋白的分离纯化及脱盐菌体收集后，平衡缓冲液清洗2遍，用10mL平衡缓冲液充分悬浮菌体，超声碎,4"下超声5s间歇5s，超声时间共为30min。12000g离心30min，收集液，用于蛋白质纯化。破碎液中存量杂蛋白质，采用Ni2_亲和层析柱对其进行纯化，可以高、纯净的目的蛋白+蛋白质
纯化如下：30mL去水清洗Ni2'亲和层析柱，约6个柱体积；10mL0.1mol/L NiSO。再生柱子，去离子水洗掉柱多余Ni2'；20mL平衡缓冲液平衡Ni2'亲和层析柱，约4个柱体积；缓慢，使液中蛋白质与Ni2'柱充分结合；20mL平衡缓冲液再次平衡Ni2'亲和层析柱，洗掉未结合蛋白质；20mL 洗涤缓冲液平衡Ni2'亲和层析柱，利用低咪G 洗掉与Ni2'柱合较弱的杂蛋白质；20mL洗脱缓冲液平衡Ni2'亲和层析柱，利用高咪G洗脱并收集与Ni2'柱结合较强的目的蛋白；20mL0.1mol/L EDTA洗掉Ni2'；最后20mL0.1mol/L NaOH保存柱。
由于最后收集到的洗脱液里含有高浓度的咪G和NaCl，为避免其影响续反应，需要进行脱盐处理+纯化蛋白质经由超滤管进行缩,4"下，4000g离心30min，并换用脱盐缓冲液以降低蛋白质盐浓度+最，利用BCA蛋白质试剂盒精目的蛋白浓度，分装甘油,-80"长保存+DPE、PPK纯化与RhaB—致。
1.3.4重组蛋白RhaB活性测定方法检测RhaB 的活性反应条件(250!1反应体系)如下：在50 mmol/L Tris-HCl(pH&0)缓冲液中，加入D-阿洛酮糖5g/L, 5mmol/L Mg2',30mmol/L ATP,0.2g/L RhaB,35"反应30min后，用高浓度NaOH调pH，止反应+15000g10min，上清液过0.22!m水膜除去杂质，通过高效液相谱
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D-psicose
(HPLC)检测是否有产物的产生#利用谱柱C18来测定反应液中ATP和ADP的含量#HPLC工作条件：0.1mol/L KH2PO4(pH6.25)作为流动相，流速1mL/min，柱温箱温度25!，用紫外检测器进行检测(入=254nm)。
1.3.5DPE和RhaB偶联体系的活性测定方法检测DPE和RhaB偶联体系的活性反应条件(250“L
反应体系)如下：在50mmol/L Tris-HCl(pH&0)缓冲液中，加入D-果糖5g/L,Mg2+5mmol/L,ATP 30mmol/L,DPE0,2g/L,RhaB0,4g/L，在35!反应30min后,100!灭活10min,15000g离心取上清液，将pH值调为5,0左右，外加酸性磷酸酶AP (0.8!L)处理,30!静置过夜#反应结束后，将pH 值调回7.0左右,100!加热10min，终止反应# 15000g离心，上清液过0.22!m的水膜除去杂质，利用Sugar-Pak TM谱分析柱来检测产物D-阿I 糖的生量#HPLC工作条件：流相为500mg/L EDTA钙盐，其流速为0.5mL/min，柱温80!,R I示差检测器。
1.3.6DPE、RhaB和PPK偶联体系的活性测定方法检测DPE&RhaB和PPK偶联体系的活性反应条件(250p,L反应体系)如下：在50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，加入D-果糖5g/L,Mg2G 5mmol/L,ATP6mmol/L,polyphosphate6mmol/L, DPE0.2g/L,RhaB0.4g/L,PPK0.4g/L，在35!反应1h后，后 1.3.5。
1.3.7重组蛋白RhaB反应条件的优化温度和pH对RhaB活性的影响均以134中所提到的反应体系为基础，反应时间均为30min#相酶活定义为相对所占的分比。为了测定温度对RhaB活性的影响，以50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)作为缓冲液，采用温度(10~ 70!)测定RhaB的酶活。为了测定不同pH对RhaB活性的影响，用3缓冲液测定酶活, pH5.0-7.0为磷酸缓冲液,pH7.0-9.0为Tris-HCl 缓冲液,pH9.0-11.0为Glycine-NaOH缓冲液。
1.3.8DPE和RhaB偶联体系的条件优化为了测定温度偶联体系活性的影响，反应体系
辐照灭菌设备1.3.5。采用温度(10~70!)测定酶活，反应时间为30min#为了测定pH偶联体系活性的影响，采用3缓冲液测定酶活,pH5.0~7.0为磷酸缓冲液,pH7.0-9.0为Tris-HCl缓冲液,pH9.0~11.0为Glycine-NaOH缓冲液#为了测定金属离子对偶联体系活性的影响，取Mg2+、Ca2G以Mn2G召8种离子测定酶活。为了测定DPE和RhaB酶比例偶联体系活性的影响，用的酶质量(1：4、1：2、1：1、2：1、4：1)测定酶活，其他条件。
2.1RhaB和DPE在大肠杆菌中的表达
根据大肠杆菌来源的rhaB基因的理论碱基序列长度，件测质相对分质量为5.3# 104。SDS-PAGE(见图1(a))显示，经IPTG诱导20h 后，在5.0x104~7.0x104有清条，相分子质量在5.3x10"左右，测基
。
,RhaB蛋白质大量在上清液中，经Ni2G和层析柱后度较高的目的蛋白。理,DPE的相分子质量为3.4x104，理论值(见图1(b))。
(b)
1：蛋白质marker；2：诱导前全细胞；3：诱导20h的全细胞；4：细胞裂解液上清液;5：纯化后蛋白质。
图1SDS-PAGE检测RhaB和DPE的表达
Fig.1SDS-PAGE analysis of RhaB and DPE expression 2.2RhaB的酶活性分析
RhaB磷酸化D-阿洛酮糖生成D-阿洛酮糖-1-磷酸，后是磷酸糖，在上难以获得，中过检测副产
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温俊婷，等：L-鼠李树胶糖激酶在D-阿洛酮糖合成中的应用
物ADP的生成来验证RhaB酶活性。由图2可知，反应初始，体系中仅含有ATP；反应30min后,ATP的峰值降低,ADP的峰生成，加入脱磷酸酶AP后, ATP和ADP的峰均消失。由此说明RhaB的确催化D-阿洛酮糖生成D-阿洛酮糖-1_磷酸，并将ATP 转化成ADP。
4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250
4000
3750
3500
3250
3000
2750uvlo电路
2500
2250n
250
1200
1220
1250
1050
750
500
252
5.0 5.5
6.0 6.5
7.07.5
8.08.5变压器油箱
9.09.510.010.511.011.512.0
%
、
込
史
te
宾
(a)
4567891011
pH
(b)
t/min
铁氧体电感
1：反应0min；2：反应30min；3：反应30min后加入AP酶。
图2HPLC检测RhaB的活性
Fig.2Activity of RhaB detected by HPLC
2.3温度、pH对RhaB活性的影响
研究温度、pH对RhaB活性的影响，如图3(a)所示，当温度为35!时,RhaB活性最高，且耐受温度范围较广；在10!时，活性仍可达到60%以上，在60!的高温下仍保有80%左右的酶活；但当温度高于70!时，酶活逐渐丧失。根据报道，
热袍菌MSB8(Thermotoga maritima MSB8)的RhaB 最反应pH值为&0㈣。由图3(b)可知,
杆菌的RhaB最适pH值为&0，且酶在酸「碱下，仍保有50%以上的酶活。
2.4温度、pH对DPE和RhaB偶联体系活性的影响
由2.3可知,RhaB酶的最适温度为35!，而文献DPE酶的最适温度为55!，二者相差较大，此需要确定偶联体系的最适反应温度。如图4(a)所示，体系在35!时拥有最高酶活，温度：升高后，酶活逐渐下降。另外，RhaB和DPE对外界温度的化均有较的适应性，在10~70!范围，酶活可以在51%以上。由图4(b)可知，当pH值为8.5时，体系的酶活性最高；当pH酸性时，酶活性降低，仅有10%；当碱性时，酶活趋势稍有下降，但仍在50%以上。3
g-F i
图3温度、pH对RhaB活性的影响
3Effect of temperature and pH on RhaB activity
温度/弋
(b)
图4温度、p7对DP，和RhaB偶联体系活性的影响Og.4Effect of temperature and pH on the activity of DPE and RhaB
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