2008-09-28 作者：张敏作者单位：（200233）中国上海市，上海交通大学附属第六人民医院眼科
【摘要】目的：建立可靠稳定的视网膜新生血管动物模型，为今后探究视网膜新生血管疾病的发生机制和方法奠定模型基础。
方法：将24只新生C57BL/6J小鼠随机分为正常组和模型组，每组各12只。将模型组小鼠于生后第7d置于750mL/L 氧浓度环境，生后第12d返回正常空气中；正常组小鼠始终置于正常空气环境喂养。至小鼠生后第17d进行心脏荧光素灌注造影视网膜铺片以及眼球连续切片苏木精 伊红（H E）染，观测视网膜新生血管生成情况。
结果：模型组小鼠心脏荧光素灌注造影结果显示视网膜中央区域呈无灌注缺血，另外视网膜血管有迂曲扩张、荧光渗漏等异常表现。眼球连续切片发现模型组小鼠突出视网膜内界膜的血管内皮细胞核数为48.65±6.24个/片/眼，而正常组小鼠平均为0.38±0.21个/片/眼，两组比较差异有显著统计学意义（P<0.01）。
结论：氧诱导的视网膜缺血模型可成功诱导小鼠产生视网膜新生血管，可作为探究视网膜新生血管疾病发生机制和方法的可靠动物模型。
关键词：视网膜新生血管；氧诱导；小鼠
【关键词】视网膜新生血管氧诱导小鼠
0引言
视网膜新生血管是众多疾病如早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity, ROP）、糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）等发生的共同病理改变；其造成的渗出、出血和增生等一系列变化最终会导致视力丧失的严重后果。新生血管形成是机体对慢性缺血作出的一种适应性代偿反应。组织的缺血、缺氧以及血流对血管壁切应力的改变均可触发炎性细胞在血管壁周围聚集，引起血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖、分化和迁移，导致血管出芽并最终形成新的血管网。针对其缺血、缺氧的主要病理改变，我们选择建立氧诱导下的小鼠视网膜缺血（oxygen induced ischemic retinopathy，OIR）模型，并通过心脏荧光素灌注造影、视网膜铺片和眼球连续切片苏木精 伊红（hematoxylin/eosin，H E）染分别检测视网膜新生血管生成情况从而观测该模型的成模情况，为今后探究视网膜新生血管疾病发生机制和方法奠定可靠稳定的模型基础。
1材料和方法
1.1材料C57BL/6J新生小鼠24只及其哺乳母鼠4只（购自中国科学院上海动物中心）；动物实验舱（上
海七0一所杨园医用氧舱厂）；测氧仪（江苏梅城电化仪器分析厂）；FITC dextran（Sigma）；荧光显微镜（Zeiss）。
1.2方法
1.2.1动物模型将24只C57BL/6J小鼠随机分为两组，正常组和模型组，各12只。将模型组小鼠于生后第7d时，随同2只哺乳母鼠放置到连接测氧仪的动物实验舱中，以1.5L/min的流量通入氧气(O2)，经过几次洗舱后，使氧浓度稳定控制在75%±2%。舱内温度控制在23±2℃，日光照明。每天定时规律地打开氧舱清扫、换敷料（保持干燥）、换食加水，并将在正常环境的哺乳母鼠与舱内母鼠更替。至小鼠生后第12d时将模型组小鼠及其哺乳母鼠返回正常空气环境(21% O2)中，以诱导小鼠视网膜新生血管产生。正常组小鼠始终放置在正常空气中喂养。
1.2.2荧光素灌注造影、视网膜铺片于小鼠生后第17d，腹腔内注射100g/L水合氯醛麻醉。称取50mg异硫氰酸葡聚糖荧光素（FITC dextran，分子量为2×106），充分溶于1mL的磷酸盐缓冲液（PBS）中。打开小鼠胸腔，于
左心室灌注，然后立即摘取眼球，置于40g/L的多聚甲醛中避光固定4℃过夜。次日在解剖显微镜下去除角膜、晶状体、玻璃体后，将视网膜小心剥离下来置于载玻片上，以视乳头为中心放射状对称切为4片，滴少量甘油明胶封片，于荧光显微镜下观察并摄片。荧光标本可于低温避光保存数月。
1.2.3眼球连续切片、H E染两组小鼠均于生后第17d处死，将眼球摘除，标记方向后立即置于40g/L多聚甲醛中4℃过夜。次日常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，矢状面平行视神经进行连续切片(去掉有视神经的切面)，片厚5μm，每片相隔30μm，每只眼球选取10个切片。常规脱蜡后进行切片H E染，于高倍镜下观察切片中突破内界膜（inner limiting membrane，ILM）的血管内皮细胞核的情况，并计数。计数由两个与本实验不相关的人员进行，并遵守随机双盲原则。H E染：石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精入水。苏木素液染5～15min，自来水洗涤，10g/L 盐酸乙醇溶液分化30s，洗涤，伊红染1～2min，洗涤。经750mL/L、950mL/L及1000mL/L乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
统计学处理：平均每只眼每张视网膜切片突破内界膜的血管内皮细胞核数量以均数±标准差(±s)表示。将模型组与正常对照组进行比较，采用SAS 6.12统计软件非配对t检验统计，若P<0.01，则差异有显著统计学意义。
2结果
正常小鼠生后第17d心脏荧光素灌注造影、视网膜铺片后，在荧光显微镜下可清晰地观察到视网膜主要动脉、静脉、毛细血管的走行，表层血管呈现一个自视盘发出的放射状分枝形态（图1A）。而模型组小鼠生后第17d进行血管荧光素造影发现，中央大面积的无灌注区域产生（图1B），并且在高倍镜下可观察到血管高度迂曲扩张、荧光渗漏等异常表现（图1C、D）。
另外，眼球连续切片H E染观察到，模型组小鼠视网膜与正常对照组小鼠视网膜有明显差异，正常组小鼠视网膜内界膜平整，显有血管内皮细胞核突入玻璃体腔（图2A），而模型组小鼠有许多明显的血管内皮细胞核突破内界膜，并且内界膜下的细胞增殖，排列紊乱（图2B）。对突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数进行计数统计，正常对照组小鼠平均有0.38±0.21个/片/眼，而模型组小鼠平均为48.65±6.24个/片/眼，经过非配对t检验，得出P<0.01，两者差异具有显著统计学意义。
标定3讨论
为探究视网膜新生血管的发病机制和方法，建立具有相似的典型病理特征并且重复性高的动物模型是保证后期研究工作结果客观可靠的前题条件。目前，国内外实验室已相应建立了许多种视网膜新生血管动物模型用于进行视网膜新生血管形成的病理机制及抗新生血管形成的药物的研究：有采用电凝、光凝[1]等方法造成动物视网膜静脉阻塞，致视网膜、视盘新生血管的动物模型，但需要较大的动物才能施行激光光凝术，术后需较长时间才能产生视网膜新生血管，使得实验室费用倍增，不利于大规模实验研究的开展；有通过高精饲料或注射STZ诱导[2]的糖尿病视网膜病变的动物模型，但动物造模周期长，饲养过程中动物死亡率高，并且许多糖尿病老鼠模型一般不产生典型的增殖性视网膜病变，主要广泛用于DR发病机理及早期微循环形态学改变等的研究；有多种转基因小鼠视网膜新生血管模型[3]，但制作较为复杂；另外还有氧诱导[4]、二氧化碳或酸中毒[5]致血管增生性视网膜病变的动物模型等。
本实验所选择建立的氧诱导的视网膜新生血管模型，视网膜血管病理改变与人类ROP的病理过程高度相似[6]；先是高氧阶段的血管闭塞和消失，正常发育中的视网膜血管停止生长，然后是进入空气相对低氧的环境下，导致了在缺氧状态下的视网膜血管异常增殖。此模型制作周期短，且能产生典型的视网膜新生血管，是理想的模拟视网膜新生血管疾病的动物模型。
在建立氧诱导视网膜新生血管模型的动物选择方面，国内外目前大多集中选择C57BL小鼠、SD大鼠、Brown Norway 有大鼠等啮齿类动物，该类动物生理性视网膜血管都是从血管周围的血管前体细胞发育而来，这点与人类相似。其中，
大鼠具有生长快、繁育性能好、存活率高等优点；相对于小鼠而言，耐高氧能力及生命力要明显增强；并且出生后第17d 的大鼠相对于同鼠龄的小鼠而言，眼球体积大，可为玻璃体腔内注射提供有利的操作条件。虽然大鼠上述优点使其在眼科实验研究方面有比较高的应用价值，但是在氧诱导视网膜缺血模型中，大鼠的成模率明显不如C57BL小鼠，尤其是SD大鼠；我们在预实验中曾运用SD大鼠进行建模，可是荧光素灌注造影和眼球连续切片H E染均未显示出典型的视网膜新生血管表现，故转向选择使用C57BL小鼠作为实验所用动物。新生小鼠的视网膜血管发育程度相当于人类孕龄为4～5mo的早产儿，并且生后第7d新生小鼠玻璃体动脉退化程度最大，最接近人类早产儿视网膜血管的特点。所以选择新生小鼠作为本实验模型动物有其一定的优势。
我们将生后第7d的C57BL/6J小鼠暴露在75%的氧浓度环境中，5d后返回正常空气，使得视网膜相对缺氧，以最大程度刺激并增加功能异常且渗漏的新生血管产生。若选择刚出生的小鼠置于高氧环境中，玻璃体动脉的异常扩张伴视乳头新生血管会使模型新生血管的量化困难并且重复性减低。而C57BL小鼠生后第7d小鼠的玻璃体腔内血管基本退行，视网膜血管发育尚未成熟，因此当缺氧刺激后所出现的血管增生性反应主要为异常的视网膜血管增生，这样可以最大限度地反应出病理情况下视网膜血管新生的程度，减少检测视网膜血管增生时的误差，所以选择C57BL小鼠生后第7d是进入高氧环境进行实验的最佳时间。
图1 小鼠荧光素灌注造影、视网膜铺片结果（略）
A：正常组小鼠视网膜（×4）；B：模型组小鼠视网膜，箭头代表无灌注区（×4）；C：血管迂曲、扩张（×20）；D：荧光渗漏（×20）
图2 小鼠视网膜切片H E染结果（×40）（略）
A：正常组小鼠视网膜；B模型组小鼠视网膜，箭头所指的即为突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核
动物模型制备过程中，母鼠能否存活是关系到新生小鼠能否健康成长的关键因素，是人工喂养难以替代的，母鼠的死亡可间接导致动物模型制备的失败。在实验中我们发现，母鼠的耐高氧能力显著比新pvc再生颗粒
生鼠弱，不能连续在高氧环境中存活5d。所以我们选择母鼠交替的方法，在每日定时打开氧舱清扫换食时，将正常环境中的哺乳母鼠与舱内母鼠更替，这样母鼠能在整个实验过程中存活下来。同时，氧舱内的氧浓度也需保持稳定，过低的氧浓度对新生血管的形成不利，会影响成模，而>80％的氧浓度虽然会一定程度上增加小鼠视网膜新生血管的生成，但同时会使小鼠及母鼠的死亡率明显上升，因此实验采用了75%±2%的氧浓度，使实验小鼠产生基本一致的血管增生性反应。我们安排了专业人员每天平均1～2h观测一次氧浓度，如果有变化及时予以调整。另外，应注意让实验小鼠和哺乳母鼠生活在一个相对固定的地方，饲养室内应保持安静，避免嘈杂；安排专业人员饲养，不宜经常更换；每天定时换水、换食、换敷料，保证母鼠正常的饮食和保证生活环境的干燥舒适，避免母鼠受到环境的不利影响和外界刺激造成母鼠吞食小鼠的情况，保证了同一实验条件下的动物数量。在实验中，我们还发现氧诱导的模型组小鼠比正常组小鼠体型小、质量轻，说明小鼠在高氧环境中有发育延缓的趋势。
新生小鼠离开高氧环境进入相对低氧环境后，视网膜逐步产生新生血管，至生后第17d视网膜新生血管的生长达到高峰[7 8]，之后新生血管逐渐被正常的血管分支方式所取代，所以我们选择在小鼠生后第17d进行形态学观察新生血管生成情况。由于小鼠眼球较小，直接进行眼底观察非常困难，采用离体视网膜铺片则可以帮助我们客观完整形象地观察小鼠视网膜血管形态和分布情况。采用墨汁染和ADP酶染方法存在染背景过高、显影不清、视网膜染不完全、显影不稳定、操作复杂等缺点。另外实验初期我们应用临床所用的造影剂荧光素钠进行实验观察，由于该化合物分子量低，在行视网
萃取装置膜固定铺片过程中已有大量渗透过血管壁，使整个视网膜组织呈现弥散的绿荧光，不能清楚显示出正常和异常血管，且重复性差。而相对高分子量的荧光素因渗透异常血管壁的速度慢，在完成造影及随后的视网膜固定铺片时可清晰地显示出正常和异常视网膜血管完整的走行、形态。在氧诱导的模型小鼠视网膜上可观察到视网膜中央大量的无灌注区域，由于高氧使得视网膜正常血管发育被抑制，从而形成无血管区域。而高氧后相对的缺氧环境使新生血管大量产生，由于新生血管形态异常，缺乏正常的血管屏障特性；本研究通过应用高分子质量的荧光素灌注后所获得的视网膜铺片可以清晰地分辨出缺氧和高压状态下所致的一系列典型的病理改变，如血管呈高度扭曲、扩张，高荧光渗漏区等特征表现[9]。
另外，我们还对模型眼的眼球进行了连续切片，观测突破内界膜的血管内皮细胞核数，以客观评价该模型新生血管生成情况。视网膜内界膜在正常情况下均匀一致而无特殊结构及细胞，视网膜血管位于内界膜下，不会突破内界膜。而病理状态下的新生血管会突破内界膜位于视网膜表面。因此，一般将突出于视网膜内界膜进入玻璃体腔的血管视为是视网膜新生血管。目前国内外都以计数视网膜组织切片中突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数作为进行定量研究的标准[10,11]。苏木素—伊红染可很好地显示视网膜内界膜及突破内界膜的血管内皮细胞核，且方法简便易行，通过计数视网膜组织切片中突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数可反映视网膜新生血管的增生情况。正常组小鼠突入内界膜的血管内皮细胞核数非常少，为0.38±0.21个/片/眼，而模型组小鼠有大量血管内皮细胞核突破内界膜，为48.65±6.24个/片/眼，差异具有显著统计学意义（P<0.01）。
本实验选择的氧诱导视网膜缺血小鼠模型具有制作方法简便、重复性好、制作周期短、动物来源方便、价格低廉等优点，可作为理想的视网膜新生血管模型。另外实验中还发现在氧诱导的新生血管模型中，左右眼视网膜新生血管的严重程度具有较好的一致性[12]，这方便我们在观察研究中可把一眼作为实验观察对照组，另一眼作为实验组，客观对比反应出目的研究的效果。
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