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试验记录

2000mL LB培养基的配制：10G的酵母提取物+20G的氯化钠+20G的

养菌一般先用50mL的LB培养基培养：配方同上，比例减少。

挑菌：用聂子取头，在固体培养菌板上挑选大小适中的单一菌体，连同头一起放到培养基中。

氨苄青霉素的配制：一瓶的氨苄青霉素加入5mL无菌水或LB培养基混均后放入冷冻保存。用时融化使用。

2000mL的培养基中加0.5mL氨苄青霉素。

摇菌：37菠萝去皮机度，摇2-3个小时。鉴定要点：将手放在培养瓶底部，当只看到手的模糊影像，有像棉花絮状的物品时即可(一半2小时左右)。后放入诱导剂（IPTG,如果是可溶性表达，IPTG窑链加的终浓度按0.1%），低温16度再摇12小时。

收菌：将摇好的带菌培养基，放在离心瓶中（注意要称重，重量配平），放入离心机离心，倒掉上清，收集固体物菌。离心设置为：5000转，15分钟。如果不裂解细菌，只需将细菌至4度放置即可，放置在冷库。

裂解：将固体物菌收置于塑料瓶中，并放入溶菌酶（一半放入DDT，不放亦可，因为DDT会影响后面蛋白纯化，如分子筛。如需放DDT，按8000mL菌收集菌泥中加100微升DDT）。

将冰盒置满冰，并在冰中注入一定的水，将盛有溶菌酶和菌的塑料盒放入冰水中，进行超声裂解（4-5秒裂解，间隔10-14秒。一共裂解99次），分别收集上清和沉淀（少许），通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达（判定是否可溶性表达，可溶表达蛋白在上清中有目的带，如是包涵体表达，在沉淀中能发现目的条带）。

亲和层析纯化：设计的引物中带有His标签，则目的蛋白中也含有His标签融合蛋白，利用His标签与金属镍离子（Ni2+ ）的亲和性，将含有His标签融合蛋白的裂解上清流经Ni-NTA金属螯合柱进行层析纯化。通过不同浓度的咪唑洗脱液竞争结合Ni2+位点，洗脱目的蛋白。步骤：首先将裂解上清与箅子一同放入收菌瓶中，并放置在摇动仪器上使之充分结合。其次，将裂解上清连同箅子一同倒入层析管中，并将从层析管中流出的液体，设置为“穿越”样本，随后用不同浓度的咪唑洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液冲洗后的液体，并进行电泳分析，确定洗脱所用咪唑浓度。

蛋白的纯度分析？蛋白纯度首先可以从PAGE电泳的条带可以判断。

咪唑的配制：20mM的咪唑500mL配方：0.68g咪唑+500mL的缓冲液（Tris）

300 mM的咪唑500mL配方：10.2g咪唑+500mL的缓冲液（Tris）

缓冲液的配制：1000mL。10mL 5M的NaCL+20mL 1M Tris+水至1000mL

使用0.22滤膜过滤后，置常温保存，使用时需降至4度使用。

蛋白的浓缩：将层析后收集的蛋白溶液置于浓缩管中，放入离心机，设置为4摄氏度，90分钟，2000-2500转/分。

分子筛：

测蛋白浓度：

过镍柱前的结合：

CD317的基因序列：

CD317的引物：

PCR扩增目的基因：

如何将CD317基因克隆至T-Easy载体并测序：

表达载体如何转化至GAMILL菌株:

如何将Tetherin基因克隆至x501pET21a表达载体：

aa183如何鉴定质粒是否正确：

如何图菌板（哪一步后）：

实验流程：

配培养基并高压；将菌株挑至小瓶培养基中，瓶中加入12.5UL氨苄；37度摇10-12小时；将摇好的菌液转化至大瓶中，2000ML培养基，0.5ML的氨苄，倒入25ML的菌液；37度摇2小时后加入诱导剂；12小时后离心收菌，若不收菌要放入冷库中保存；将离下的沉淀蛋白放入小瓶中进行裂解；裂解后过镍柱；进行浓缩；过分子筛；测浓度。

点晶体的准备工作：

单克隆抗体可以作为诊断试剂，准确识别各种抗原物质，与抗原的特异性结合具有准确、高效、简易、快速的特点。单克隆抗体还可以用于疾病和运载药物：主要用于癌症。单克隆抗体作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。

制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性──在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。

杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤：