农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(6):644~647
*基金项目：国家教委博士点基金项目（No.1998071232)资助。林亚秋：女,1976年生，硕士研究生。
**通讯作者。Author for correspondence.E-mail:<******************>.收稿日期：2003-12-31接受日期:2004-03-16
·研究论文·
林亚秋
李瑞文孙超陈国柱
杨永青孟德连杨公社**
（西北农林科技大学动物脂肪沉积与肌肉发育实验室，杨凌712100）
摘要：采用光学显微镜、DNA 琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术3种技术，检测了不同浓度肿瘤坏死因子α(TNF-α)对大鼠脂肪细胞凋亡的影响。结果表明，①TNF-α诱导脂肪细胞凋亡的形态学变化与浓度呈线性相关，在5~20ng/mL 范围内，浓度越大，凋亡特征越明显。②5ng/mLTNF-α处理有明显的形态学变化，但电泳结果未见梯状条带，说明细胞凋亡的形态学变化早于细胞凋亡的生化特征性改变。③TNF-α诱导脂肪细胞凋亡在5~20ng/mL 浓度范围内存在剂量-效应关系， 5，10，15和20ng/mL TNF-α处理组与对照组相比差异极显著（<0.01），10ng/mL 与15和20ng/mL 处理组之间差异不显著（>0.05），以10ng/mL 为最佳诱导浓度。
关键词：肿瘤坏死因子-α；脂肪细胞；凋亡
Rat Adipocyte Apoptosis Induced by Tumor Necrosis Factor-α
LIN Ya-Qiu LI Rui-Wen SUN Chao CHEN Guo-Zhu
YANG Yong-Qing MENG De-Lian YANG Gong-She**
(Laboratory of Animal Fat Deposition and Musle Development,Northwest Sci-tech University
of Agriculture and Forestry ，Yangling 712100，
黄军导航China)
The effects of tumor necrosis factor-α(TNF-α)at different concentration levels on rat adipocyte apoptosis were detect-ed by optical microscopy,agarose gel electrophoresis and flow cytometry methods.The morphologic changes of rat adipocyte apopto-sis induced by TNF-αwere correlated linearly with the concentrations of TNF-αwithin a range from 5to 20ng/mL,and the higher concentration of TNF-αcould induce more obvious apoptosis.The morphologic changes of rat adipocytes treated by 5ng/mL TNF-αwere clearly shown,but their DNA ladders didn't appear by the DNA electrophoresis analysis,indicating that the morphologic changes occurred earlier than the biochemical changes.TNF-αinduced the rat adipocyte apoptosis in a dose-dependent manner within a concentration range from 5ng/mL to 20ng/mL.Compared with the control,the apoptotic effect induced respectively by 5,10,15and 20ng/mL TNF-αwas significantly difference (<0.01),but the effect among 10,15and 20ng/mL TNF-αtreatments was not dif-ference (>0.05).Thus the optimum concentration of TNF-αinducing apoptosis was determined at the level of 10
ng/mL.
tumor necrosis factor-α；adipocyte ；apoptosis
Carwell 等[1]1975年发现了肿瘤坏死因子(tumor
消息队列实现necrosis factor,TNF)，以后把由单核巨噬细胞和淋巴细胞产生的细胞毒因子，分别命名为TNF-α和TNF-β。TNF-α作为一种多效细胞因子，最原始的作用是杀伤或抑制肿瘤，它在体内或体外均能杀伤某些肿瘤细胞或抑制其增殖作用，但它在脂代谢中所起的作用直到1993年才被人们所认识[2]。作为脂肪组织的主要调节因子之一，TNF-α在脂肪组织中可由前体脂肪细胞和脂肪细胞分泌产生，对脂肪细胞
分解、增殖与分化具有一定作用[3]。近几年研究显
示，TNF-α也是一种凋亡因子，可以诱导多种细胞凋亡[4]，但由于脂肪细胞自身的特点（核浆比较小，细胞内存在大量脂滴），所以对TNF-α诱导脂肪细胞凋亡的研究起步较晚。Prins 等[5]首次证明了TNF-α可以诱导人类白脂肪细胞凋亡，把脂肪细胞数目的减少同凋亡联系起来，以后有学者相继证明TNF-α还可以诱导大鼠棕脂肪细胞、鼠3T3脂肪细胞凋亡[4,6]。国内未见这方面报道。本实验采用光
第6期林亚秋等：肿瘤坏死因子-α诱导大鼠脂肪细胞凋亡
学显微镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术3种方法探讨TNF-α对脂肪细胞凋亡的影响，以期为肥胖症的提供新线索。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1实验材料SD（Sprague-Dawley）大鼠（白，雄性，20日龄），第四军医大学实验动物中心提供。将大鼠断颈处死，用75%（V/V）酒精浸泡消毒，无菌状态下取出腹股沟、附睾和肾脏周围的脂肪组织，除去血管和其它的结缔组织，剪成1mm3大小的碎块。
1.1.2主要试剂及其仪器重组大鼠TNF-α（PE-PRO TECH）；M199培养基（GIBCOBRL）；I型胶原酶（GIBCO）；牛血清白蛋白（华美生物工程公司）；胎牛血清（兰州民海）；台盼蓝（上海化学试剂）；光学显微镜(OLYMPNS)；流式细胞仪（Elite）。
1.2实验方法
1.2.1脂肪细胞培养将剪好的脂肪组织块加入I 型胶原酶消化液，消化60~70min（每5min振荡1次），然后依次过孔径为600目和150目的不锈钢细胞筛，1000r/min离心10min，弃上清液，加红细胞裂解液（154mmol/L NH4Cl+10mmol/L KHCO3+ 0.1mmol/L EDTA），室温放置10min，离心5min，然后无血清培养液洗3遍，再以5×104个/cm2密度分别接种于放有盖玻片和无盖玻片的六孔培养板中，再加适量培养液，每3d换液1次，直到8~10d 出现成熟脂肪细胞。
1.2.2脂肪细胞凋亡的诱导取培养至第8天的脂肪细胞随机分为实验组和对照组。实验组中分别加入TNF-α，终浓度分别为0、5、10、15和20 ng/mL，放入CO2培养箱中继续培养（37℃，5% CO2）24h。
1.2.3脂肪细胞形态学变化从六孔培养板中取出经TNF-α处理24h爬满细胞的盖玻片，PBS洗3次，用甲醇固定30min，0.4%台盼蓝染，光镜下观察细胞形态变化。
1.2.4脂肪细胞凋亡检测收集0、5、10、15和20 ng/mL TNF-α诱导24h的脂肪细胞（1×106），用冷PBS洗2次，加200μL细胞裂解液（50mmol/L trics,10mmol/L EDTA,0.5%SDS,100g/L蛋白酶K）55℃水浴3h，加入TE buffer使体积至500
μL；用等体积抽提液（酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1）抽提3次；加2倍体积冷无水乙醇-20℃过夜；加入RnaseA37至终浓度100μg/mL，50℃作用1h；将干燥后的DNA溶于100μL TE buffer中；1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察并照相。
1.2.5脂肪细胞凋亡率检测收集0、5、10、15和20ng/mL TNF-α诱导24h的脂肪细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，经Annexin V/PI双染，Elite流式细胞仪采集数据，并用Cell Quest专用软件分析，通过计数凋亡区细胞数量得出凋亡率。
1.2.6统计学处理采用SPSS软件进行方差分析与显著性分析。
2结果
2.1脂肪细胞的形态学观察心音传感器
死亡细胞即被台盼蓝着的细胞体积明显膨大，甚至崩解，以至轮廓不清，形成着较深的蓝黑不规则团块（图1）；正常细胞及凋亡细胞不被台盼蓝着，其中凋亡细胞多呈圆形，体积较正常同期发育的细胞小，核染质浓集于核膜下，成颗粒块状，个别细胞有核膜皱缩、卷曲、出泡现象，最后裂解为凋亡小体（图2）。浓度不同，凋亡细胞的形态学变化也不尽相同，5ng/mL处理组可见细胞首先收缩变圆，胞膜完整，随即与邻近细胞脱离，形成单个细胞；10ng/mL处理组不仅可见细胞收缩变圆，而且可见内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，但未见凋亡小体的出现；15和20ng/mL处理组中个别细胞的细胞核裂解成多个凋亡小体并从细胞表面出芽脱落。结果表明，用不同浓度的TNF-α处理脂肪细胞，凋亡细胞的形态学变化随着浓度的增加而呈现相应的凋亡特征，浓度越大，凋亡特征越明显。对照组细胞生长旺盛形态完整，胞体丰满，胞浆均匀，核圆，核仁清晰，细胞不表现出凋亡（图3）。
图1.死亡细胞
Fig1.Dead
adipocytes
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农业生物技术学报2004年
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图2.凋亡细胞Fig.2.Apoptotic adipocytes
图3.正常脂肪细胞Fig.3.Normal adipocytes
图4.DNA 凝胶电泳Fig.4.DNA agarose gel
electrophoresis
M,marker;1,control;2,5ng/mL TNF-α;3,10ng/mL TNF-α;4,15ng/mL TNF-α;5,20ng/mL TNF-α.
2.2脂肪细胞的DNA 凝胶电泳
电泳结果可见10、15和20ng/mLTNF-α处理
组出现典型的“梯状”条带（ladder patter ），对照组
和5ng/mL TNF-α处理组未见“梯状”条带（图4）。
2.3脂肪细胞的流式细胞仪检测
不同浓度的TNF-α作用24h 后出现不同的细
胞凋亡指数（表1）。由表1可见，
加入TNF-α后，细胞凋亡指数显著高于对照组（<0.01），且浓度
愈高，细胞凋亡指数愈高，但浓度为10ng/mL 处理
组与15和20ng/mL 处理组之间凋亡水平相似，
差异不显著（>0.05）
。结果表明TNF-α在5~20ng/mL 浓度范围内存在剂量-效应关系，且以10ng/mL 为最佳诱导浓度。
表1不同浓度TNF-α对大鼠脂肪细胞凋亡率影响Table 1Effects of different concentrations of TNF-αon rat
adipocytes apoptosis
表中字母不同者之间表示差异显著（<0.01），字母相同者表示差异不显著（>0.05）。Different letters show significantly differences
(
<0.01),same letters show no differences (>0.05).
3讨论
3.1脂肪细胞凋亡的形态学变化
本研究应用台盼蓝染法观察脂肪细胞凋亡的形态学变化，结果表明台盼蓝染法能快速、准确的
检测脂肪细胞凋亡。当细胞坏死时，
细胞体积变大，线粒体明显肿胀，失去排斥台盼蓝的能力，形成着
较深、轮廓模糊膨大的团块，
在光镜下易观察到。除去坏死的细胞，在光镜下从形态上很容易区分正常细胞和凋亡细胞。凋亡细胞的形态学变化与国外学者[7]描述的基本一致，首先表现在，细胞间连接疏
松，失去接触，细胞皱缩、
变圆，胞浆浓密，细胞器基本完好，核染质浓缩集中，而细胞膜仍保持完整，
进一步出现膜的气泡化、细胞裂解，
形成膜包裹的凋亡小体，最后凋亡小体被邻近细胞吞噬。脂肪细胞与
台盼蓝作用后，细胞各部分的阴暗对比增强，在光镜下能非常清晰地观察到凋亡细胞的特征，且所需仪
器简单，利于推广。冯春琼等[8]最近报道了MTT 染法可以很好的检测细胞凋亡，本实验也曾采用
MTT 染法检测脂肪细胞凋亡，
但没有观察到凋亡的形态学变化，作者认为可能是脂肪细胞的自身特点阻止了蓝紫结晶的形成，所以不能区分正常
细
解扰
TNF-α浓度/ng ·mL -1
凋亡率/%TNF-αconcentration
Apoptotsis 0(3.35±0.03)a 5(7.52±0.07)b 10(16.72±0.09)c 15(16.86±0.07)c 20
(17.12±
0.05)c
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第6期林亚秋等：肿瘤坏死因子-α诱导大鼠脂肪细胞凋亡
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胞、凋亡细胞和坏死细胞，因此用MTT染法检测脂肪细胞凋亡还有待于进一步研究证实。
3.2脂肪细胞凋亡的检测
细胞凋亡最明显的生化特征是Ca2+和Mg2+依赖的内源性核酸酶的激活，将细胞核染体从核小体间断裂，形成由大约180~200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段[9]，针对这些片段发展了琼脂糖凝胶电泳，凋亡细胞呈明显的梯状条带（DNA lad-ders）。本实验运用了该方法来检测5,10,15和20 ng/mL TNF-α诱导脂肪细胞凋亡的情况，并探讨与形态学的关系。结果显示，对照组和5ng/mLTNF-α处理组未见梯状条带，10、15和20ng/mL TNF-α处理组可见典型的梯状条带。5ng/mLTNF-α处理组未见梯状条带的原因可能是该组凋亡率低（7.52%），而DNA凝胶电泳是相对于体进行分析的，当凋亡细胞数少于细胞总数的10%时，难以出现明显的DNA ladder[10]。而此种情况用形态学检测却可观察到凋亡的变化，说明脂肪细胞凋亡的生化特征改变是继形态学变化之后发生的。琼脂糖凝胶电泳检测虽可准确的检测凋亡，但也存在一些缺点，例如操作繁琐、所需时间长、难以定量等。
3.3TNF-α与脂肪细胞凋亡
本实验运用Annexin V/PI双染、流式细胞仪检测筛选出本实验最佳诱导浓度为10ng/mL。Prins 等[5]证明用425ng/mLTNF-α可以诱导人类白脂肪细胞凋亡，被认为是超出了正常生理浓度，可能与外周条件有关，如在患恶性肿瘤时，TNF-α的水平很高。因此本实验设计了一系列浓度梯度来诱导大鼠白
脂肪细胞凋亡，结果发现TNF-α在一定范围内以剂量依赖的方式促进脂肪细胞凋亡，这与Hao Qian[3]的研究结果一致。TNF-α诱导凋亡的机制在其它组织如神经组织被广泛研究，但却没有应用到脂肪组织上。作者认为TNF-α诱导脂肪细胞凋亡的机制可能是通过以下两个途径来实现的：（1）TNF-α与TNFR1结合并使TNFR1胞内三聚化，后者与TRADD（TNF-receptor-assosiated death do-main）相连接。TRADD的死亡结构域同时与FADD （fas-associated death domain）下游的连接分子相连接（FLICE/MACH，即：caspase8），caspase8以级联的形式激活ICE家族其它成员，裂解它们的死亡底物，引起DNA断裂和凋亡的形态学改变。（2）TNF-α激活TNFR1，TNFR1在胞内三聚化，激活细胞膜上的中性鞘磷脂酶nSMase，其水解鞘磷脂（SM）生成CM，后者通过激活另一种蛋白激酶而激活MAPK级联和PLA2，发挥其诱导凋亡的功能[11]。但确切机制有待于进一步研究。
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