五仁参芪汤鲎试验检查细菌内毒素应注意的问题发布时间02年09月05日 09时18分方法：通过对干扰鲎试验准确性干扰因素的分析(包括鲎试剂本身、操作条 件、配制原料等)，提出了鲎试验中应注意的问题。结果：只要克服了检查中的干扰因素，鲎法具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。
鲎试验是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断供试品中细菌内毒素限量是否符合规定的一种方法[1]。它具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。中国药典1995年版已收载细菌内毒素检查法(简称鲎试验)，但只用于几种输液的检查。根据现有的实验证明，凡不干扰细菌内毒素检查或虽有干扰，但可以克服的药品注射剂，将能够全部以鲎法代替家兔热原检查法。但是该法受到许多因素的影响，故在做鲎试验检查时，应注意下列问题。
1鲎试剂本身
1.1鲎试剂灵敏度 为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，用于试验的鲎试剂应首先核对灵敏度。因为在我们的实际工作中，发现鲎试剂均符合药典规定标准前提下，由于生产厂家不同，部分鲎试剂的实测灵敏度与标示值有差异而导致检测同一检品时，用相同标示值的鲎试剂，出现不同结果。因而先核对灵敏度可避免因鲎试剂本身造成的判断失误。建议法定部门和生产单位应注意鲎试剂的质量检查。
1.2供试品稀释 在取样品时，一定要熟悉中国药典的内容，不能直接取大输液原液0.1ml进行检查，这是排除干扰因素的简单有效的方法。因药典已明确规定试验中鲎试剂的灵敏度不超过0.5EU/ml，根据供试品的稀释公式： 供试品稀释倍数= L/λυL ：供试品的内毒素限量(1EU/ml)λυ：鲎试剂灵敏度的标示值(EU/ml)故检测大输液均应稀释后才能进行试验，如选用更高灵敏度的鲎试剂，则应增加样品的稀释倍数。稀释用的细菌内毒素检查用水药典作了规定。在4h内不得与鲎试剂产生凝集反应。
如果直接用供试品原液试验，就会使供试品的内毒素提高到0.5EU/ml或0.5EU/ml以下，这样，根据目前大输液的生产和贮藏条件，有些就会达不到，鲎法检出的阳性率会提高，兔法复核的机遇也将增多，势必会浪费人力物力。
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2操作条件
2.1 操作熟练程度 操作时严格按无菌操作法进行，安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，防止碎玻屑掉入安瓿内及有一个比较整齐的颈口。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均
应准确量取。操作时，双手避免在安瓿或试管的上方来回移动，加样后迅速封闭管口，并立即放入恒温水浴箱中，且整个操作过程中时间应紧凑，防止微生物的污染，否则易致假阳性的出现。
2.2 混合液的pH值 供试液与鲎试剂混合液的pH值对鲎试验的影响较大，根据国内外资料的报道，试验的最适pH为6.25～7.25才能形成最佳凝胶[2]。而药典规定各种葡萄糖注射液的pH为
3.2～5.5，我院控制在3.7～42之间。我们曾对pH值小于
4.0的多批次葡萄糖注射液作了调pH和不调pH的比较试验，结果发现在该pH范围内两者无显著差异，不调pH者阴性抑制试验仍可得到坚实的凝胶，说明不影响反应灵敏度，且鲎试剂本身具有一定的缓冲能力。但pH值过大或过小均可抑制鲎试剂与细菌内毒素的反应，其原因可能是pH值过大或过小均可破坏极微量的内毒素。
薄页纸2.3保温温度 将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成1EU/ml，进行鲎试验，然后分别放置于25、28、31、34、37、40、43、46、49℃水浴保温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升高而加快，但到达49℃保温
90min也未出现凝胶。
从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，保温温度在25～40℃之间，随着温度的升高，鲎试剂的灵敏度亦增大，在40～46℃之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响，达到49℃或更高温度时，则会破坏鲎试剂。故应严格按照药典的要求，温度控制在(37±1)℃之间，才可获得理想的结果。
火筒式加热炉2.4保温时间 将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成1EU/ml，进行鲎试验，37℃水浴保温，分别在10、20、30、40、50、70min时观察，发现凝胶形成的坚实状态随着时间的延长而坚固。
从上述实验可以看出，延长保温时间，可以提高鲎试剂的灵敏度，增加假阳性。故应遵守我国药典规定的保温(60±2)min时间。
2.5 在鲎试验过程中应防止试管受到振动鲎试剂与细菌内毒素形成的凝胶受到振动后易变形而误判为阴性。因此，在鲎试验过程中，不宜进行容易引起试管振动的实验操作，试验用的试管架的眼孔直径应与安瓿或试管直径相接近，避免安瓿或试管左右晃动。水浴箱要放置在固定不易受到振动的地方，保温过程中不可随时取出观察。
3其它
3.1 配制的原料 在鲎试验检测中，0.9%氯化钠注射液多次出现假阳性反应，对此进行了实验工作，查原因，发现阳性率高与厂家原料有关。 笔者把不同厂家生产的氯化钠原料配制的0.9%氯化钠注射液，对不能通过鲎法检查的送药检所用兔法检查，结果为阴性，其中个别厂家的阳性率高于其它厂家，为此将不同厂家的氯化的原料分别在230℃烘焙1h后进行比较，发现个别产品泽明显变黄。按中国药典1995年版附录规定的易炭化物检查，分别将不同厂家的氯化钠原料进行易炭化物相对照检查，
结果上述明显变黄厂家的氯化钠泽较深。因
此认为个别厂家的注射用氯化钠原料含有较多的有机杂质，希望厂家要控制好质量。 另外，在葡萄糖原料中偶有存在着β-D聚葡糖的现象，它与鲎试剂发生凝集反应，但注入兔体内不能使其升温，故造成假阳性，所以最好是使用定点厂家合格的葡萄糖原料。地磁指数预报
3.2所用器皿均应彻底洗净和灭菌安全 实验用器皿均应充分洗涤并冲洗干净，特别是接触酸碱或用洗衣粉、洗液等洗涤后，更应冲洗干净，以免残留物破坏极微量的内毒素。灭菌应按药典中的有关方法处理，防止引入外源性内毒素。如有条件的话可用合格的细菌内毒素快检盒。
3.3阳性对照 我国药典规定鲎试验必须做阳性对照，其目的就是证实实验条件下鲎试剂的活性，所以在实验过程中，阳性对照如为阴性，此次试验无效，应重新复做。另外细菌内毒素工作标准品应现用现稀释，不可放置后再用。
动态浊度鲎试剂使用说明
概述：
鲎试验是一种最灵敏和专一的内毒素检查方法，它是革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，通常称为热原。鲎试验的原理是内毒素与LAL反应可形成易于分辨的凝胶。简单、经济的的鲎试验使得它已广泛应用
于半成品、原材料以及药品、医疗器械和生物制品等产品的检查。美国药典的细菌内毒素检查法和美国FDA指南为有效验证鲎试验法代替兔热原法提供了标准方法。
借助电脑和微孔平板仪或试管仪，可以进行动态比浊法试验，可精确地检测出已设定的浊度。设定浊度的反应时间与检品中的内毒素的量成反比，因此未知检品中的内毒素水平是通过与标准曲线的比较来确定的。用动态测量，λ是标准曲线中的最低点。
生物原理
Frederick Bang观察到细菌导致美洲鲎血管内的血液凝结。在协作研究中，Levin 和Bang发现导致凝结现象的因素存在于鲎的阿米巴细胞中或循环血液细胞中，热原（细菌内毒素）触发浊度和凝胶形成酶促反应。
美国FDA终产品检测指南：
美国食品与药品管理局在1987年发布了一份准则，通知生产人用药品和生物制品、兽用药品和医疗器械的厂商，FDA认为有必要用于验证鲎试验作为终产品的内毒素检测方法的程序，那些遵照鲎试验准则的厂商将被认为符合CGMPs有关规定。非经肠道药品的通用内毒素限值是5个内毒素单位（EU）每公斤剂量，但鞘内药品的限值是0.2EU/Kg医疗器械浸取液不得超过0.5EU/ml；与脑脊髓接触的器械的
限值为0.06EU/ml。必须根据FDA的鲎试验指南（1987）的补充规定（1991）“临时指导原则”进行动态浊度分析。
鲎试剂：冻干的浊度试剂含有用单价和二价阳离子加以稳定的缓冲过的鲎阿米巴细胞溶解物。灵敏度，λ是参考美国标准内毒素EC-5标定的，用EU/ml标示。它是EU/ml表示的RSE的最低浓度并在标准条件下产生凝胶。
复溶：将试剂瓶在一坚固的表面轻弹使瓶中的鲎试剂粉末落到瓶底。小心地移开盖子释放真空，避免接触污染。残留在胶塞上的少量试剂是无关紧要的。在使用前立即用5.2毫升的无热原水复溶试剂，用移液棒将水直接加入瓶中，不立即使用时用无热原封口膜盖住瓶口，轻轻搅动直到鲎试剂溶解于无溶液中。如果封口破损或出现颜或混浊则将它们丢弃。
贮存：冻干的鲎试剂在热的条件下还是相对稳定的，但还是应存放在2-8℃下；避免长时间放置在高于25℃的温度条件下。已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放在一冰冷的表面上或2-8℃的冰箱里存放24小时以内，否则在复溶并冻结后将其存放在-20℃以下，可存放28天，鲎试剂只能冻融一次。
ACC可提供E.coli内毒素工作标准品（CSE）用于复核试剂的灵敏度、验证产品检测方法和制备抑制对照管（阳性水和阳性产品对照），参考每一批CSE的分析证明中关于效价、复溶和贮存的信息。该批产品必须另外订购合适的CSE。
硬盘马达必须用LAL检查用水（无LAL活性）复溶鲎试剂和制备样品、对照管和内毒素标准品，该批产品必须另外订购合适的LAL检查用水。
警告和预防
警告：浊度法试剂只用于体内诊断，使用时须小心因为其毒性仍不为人所知。
正确应用该检测方法要求严格遵守推荐程序中的所有项目，LAL原始记录中必须包括阳性对照以检测抑制条件。所有与样品接触的材料或检测材料必须是无热原的，玻璃器皿必须经有效除热原，（我们的经验是标示已灭菌和处理的塑料制品是无热原的。那些不能经高温灭菌的材料或销售时没有无热原标签的材料应小心检测其是否含内毒素）。
样品的采集和制备
所有与样品或检测试剂接触的材料必须是无热原的，在任何时候都要使用无菌技术。由于鲎试剂-内毒素的反应是与pH值有关的，样品-鲎试剂的混合物应产生6.5-8.0的pH值。如果需要调节pH值，使用无内毒素TRIS缓冲液，不要随便调节未缓冲溶液的pH值因为ACC配方已经缓冲过。
产品干扰
每一样品的检测方法必须经过验证证明无明显的干扰，抑制通常与浓度有关，可用LAL检查用水稀释来克服干扰。抑制的普遍来源包括1）干扰酶介反应的和2）改变内毒素（阳性）对照的分散性。
最大有效稀释：美国食品和药品管理局规定经静脉给药的药品的内毒素限值为
5EU/kg，鞘内药品为0.2EU/ml。但对于一些简单的药品也采用特殊限值，这些限值可以用来确定稀释的范围以克服干扰问题而不会超过限定的内毒素浓度，最大有效稀释（MVD）是按照以前提到的文件和其它药典中提供的公式来计算的。
对于有公布限值的药品，MVD可按下列公式计算：
MVD＝内毒素限值×产品效价
灵敏度
例如，环磷酰胺的内毒素限值是0.17EU/mg，如果使用最低内毒素水平为
0.05EU/ml的标准曲线来检测效价为20 mg/ml的产品，MVD等于1:68，这样, 环磷酰胺可最大稀释到1:68以解决潜在的抑制(一份样品比68份无热原水)
用动态法进行干扰（抑制/增强）检测试验是用已知浓度的内毒素强化或稀释样品并根据供应商的说明重复两管检测其峰值回收率，这个试验要求用RSE或CSE 制备的标准曲线（参阅CSE的分析化验证明），标准曲线至少应包括三个RSE
或CSE浓度，还应包括另一标准品以分辨在标准曲线范围内的每一个10倍稀释的增长。曲线必须符合“试验特征”中所述的标准。
选择标准曲线的中点做干扰检测，例，范围为5至0.05EU/ml的标准曲线的阳性产品对照浓度是0.5EU/ml。（见日常检测）
强化的药品的内毒素含量均值，参考标准曲线时，如果在±50%以内则认为无干扰，回收率不在
±50%以内表明样品受到干扰，用无热原水继续稀释样品直到获得有效的回收率，但不能超过MVD。另一种检测干扰的方法是4λ内毒素回收率在±50%以内。
动态浊度检测程序
可在有以下功能的试管或微孔平板仪上用KTA2作动态浊度分析：A）可测量相对于时间的光密度值的变化的检测系统B）微电脑和相应的软件通过线性回归分析信息。
每个试验应包括样品或稀释的样品或产品、阳性产品对照管，包含设定的标准曲线的一系列稀释或阳性水对照管和一阴性对照管，至少重复两管检测，按照自动内毒素测量系统提供的指导进行操作。
方法：无菌地将0.1ml的每个样品移到微孔平板的每个孔底，在准备鲎试剂的添加的同时将平板至少预热10分钟；否则遵照仪器供应商的说明。然后用配量器快速将0.1ml的鲎试剂加入每个孔中，先加阴性对照，最后加最高的内毒素浓度。如果平板仪不能自动混合溶液，轻拍平板侧面几次并及时启动定时观察，期望的监控阶段结束后，启动结果的分析程序。
要求的试剂/材料但不供应：
豫公网安备41160202000603
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