PCR操作流程
科室必备仪器：一次性头，，加样器，干燥恒温器，高速离心器（>10000R/MIN），无菌操作箱，PCR仪，冰箱
HBV-DNA定量测试说明书
www.daangene/default02.asp达安
www.snibe/docc/Aboutus/about.html深圳新产业
试剂盒的组成
DNA浓缩液DNA提取液HBV PCR反应液Tap酶 临界阳性质控品阴性质控品HBV阳性定量参考品104 105 106 107 各一
标本：血清或者血浆。血浆需用EDTA或枸橼酸钠抗凝
（如UU,CT,6,11,16,18时标本的处理可放入生理盐水中处理，需要做的时候，弃去上清液，用提取液加入后混匀然后再加入离心管内。
另附：HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV，低危险型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变（CIN I），高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变（CIN II/III）的发生相关，尤其是HPV16和18型）甘薯苗
方法步骤:
一．D NA提取
1.取100ul血清加入等量的DNA浓缩液，振荡器震荡混匀5S
2.12000r/min离心10min
3.去上清，沉淀加入30ulDNA提取液，震荡混匀5-10S，瞬时离心数秒，100C°恒温处理10 min
4.12000r/min5分钟后备用
5.阴性及阳性质控品的处理，8000rpm离心后，吸50ul至离心管中，加入50ulDNA提取液，100C°
处理10分钟，12000r/min离心5min后备用。
磨光片离心备用
1.试剂准备：按比例，HBV PCR 反应液40ul+Tap酶液3ul/人份充分混匀后按43ul管分装至0.2ml 离心管中后备用。
2.加样：向0.2离心管里分别加入处理后的样品，质控品上清液2ul，8000rpm离心数秒后放入仪器样品漕。
过氧化氢灭菌器检测
3.编辑：ABI prism 75007000 7300 DA7600仪器等。此步略
打开instrument设置循环条件
93C°2分钟
93C°45秒→55C°60秒→10个循环
93C°30秒→55C°45秒→30个循环
结果分析：
阴性质控品：增长的曲线不呈S型曲线或Ct值=30
阳性质控品：增长的曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考在1.0×106~~~~2.0×107，临界参考值在2.0×102~~~~2.0×104范围内
阳性定量参考品：全部阳性，0.97≤|r|≤1
以上要求在同一实验中同时满足，否则，本次实验无效。
附：百度上对PCR的解释
1.生物学的聚合酶链式反应
定义
聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction），
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。由美国科学家PE（Perkin Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。 技术原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在
聚合酶链式反应
实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
工作原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 聚合酶链式反应
间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，
引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在T aqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10～100pmol
模板DNA0.1～2ug
TaqDNA聚合酶2.5u
Mg2+1.5mmol/L
加双或三蒸水至100ul
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)多媒体教学讲台
工作步骤
标准的PCR过程分为三步：
1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如图所示：
现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
反应特点
特异性强
PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较
选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个R FU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
循环参数
1、预变性（Initial denaturation）．
模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。
2、引物退火（Primer annealing）
退火温度一般需要凭实验（经验）决定。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
3、引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。延时阀
延伸时间随扩增片段长短而定。
4、循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：
毛豆剥壳机
变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
5、循环数
大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
PCR-PCR常见问题
临床意义
1、了解乙肝病毒在体内存在的数量。
2、是否复制。
3、是否传染，传染性有多强。
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