一、实验目的
1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；
2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。
二、实验原理
酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定
单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。 三、实验试剂与器材
1.试剂
（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）
（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）
取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6～0.7之间。
（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯
精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。
（4）0.3mol/LNaOH溶液
2．器材
恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。
四、操作步骤
1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备
称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d。长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/
L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。
2.酶促反应
取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热2min。然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH终止反应。冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP后保温25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光度计上测定各管A405值。
3.数据处理
以反应时间为横坐标，A405值为纵坐标绘制进程曲线。由进程曲线中直线部分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。
表1.1 制作酶促反应进程曲线时各物质加入量
试管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 0 |
NPP（mL） 稀释酶液(mL) 反应时间（min） 0．3M NaOH(mL) | 黑陶工艺品1.0 1.0 3 3.0 | 1.0 1.0 5 3.0 | 1.0 1.0 7 3.0 | 1.0 1.0 10 3.0 | 1.0 1.0 12 3.0 | 1.0 1.0 15 3.0 | 1.0 1.0 20 3.0 | 1.0 1.0 25 3.0 | 1.0 1.0 30 3.0 | 1.0 小型振动器1.0 40 3.0 | 1.0 1.0 50 3.0 | 1.0 1.0 25 3.0 |
| | | | | | | | | | | | |
五、实验报告
绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。
实验二 过氧化氢酶米氏常数的测定
一、目的
了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理
H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν-1/[S]作图求Km
三、实验器材
1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂
1、0.02mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）
取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、web前端性能优化酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4 ：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4 ：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅
拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红）。
6、25% H2SO4
五、操作
取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：
表一 过氧化氢酶米氏常数的测定
管号 母液试剂 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
0.05mol/L H2O2/ml 蒸馏水/ml 酶液/ml | 0 9.5 0.5 | 1.00 8.50 0.5 | 1.25 8.25 0.5 | 1.67 7.83 0.5 | 2.5 7.0 0.5 | 5.00 4.50 0.5 |
| | | | | | |
先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0ml 25%硫酸终止反应，充分混匀。用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红，记录消耗的KMnO4体积。
六、计算
分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。
[S]=c1烟饼V1/10
式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）；
c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；
V1：H2O2体积（ml）；
10：反应的总体积（ml）；
瓦斯抽放系统υ：反应速度（m mol/min）；
c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；
V2：KMnO4体积（ml）；
以1/υ对1/[S]作图求出Km。
实验三 尼龙固定化木瓜蛋白酶
一、目的：
了解共价交联法固定酶的原理和步骤
二、原理
尼龙是聚酰胺物质，经HCl水解后暴露出游离NH2，NH2与戊二醛反应，尼龙即成活化载体，可与酶表面NH2反应，把酶连在尼龙上。
三、实验材料、仪器和试剂
1、材料
尼龙布(86或66)，140目，剪成3cm×3cm
2、仪器
(1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱
3、试剂
(1)18.6%CaCl2溶液
(2)甲醇溶液
(3)3.65mol/LHCl溶液
(4)0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)
(5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5
(6)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8)
(7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液
(8)0.5mol/LNaCl溶液
(9)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议