论著
王晓川 韩清韶 梁标
【摘要】 目的 探讨过氧化氢酶活性、KatG基因及其突变与结核分支杆菌(INH)耐药性的相关关系。方法 对58株结核分支杆菌临床分离株进行过氧化氢酶活性测定，并采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法进一步分析结核分支杆菌中KatG基因及其突变的情况。结果所有26株敏感菌均有KatG基因及过氧化氢酶的表达；32株耐药菌中，8株(25%)缺乏过氧化氢酶活性，3株(10%)KatG基因完全缺失，且主要发生于高度耐药菌中。进一步对8株耐药菌进行PCR-SSCP分析，发现均存在KatG 基因突变。结论 过氧化氢酶活性缺乏及KatG基因的完全缺失主要与INH高度耐药性有关，而KatG基因突变可能是INH耐药性更为重要的原因。
【关键词】 分支杆菌，结核 药物耐受性 KatG基因 聚合酶链反应 多态现象，单链构象
变压器油箱
Relationship between catalase activity, KatG gene and isoniazid-resistance
in M.tuberculosis
四技术透镜体Wang Xiaochuan, Han Qingshao, Liang Biao. Shenzheng Municipal Longgang Central
Hospital, Shenzhen 518116
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between catalase activity, KatG gene, gene mutation and INH-resistance in M.tuberculosis.Method Catalase activities in 58 M.tuberculosis isolates were tested, and KatG gene mutations were detected futher by PCR-SSCP. Result None of INH-sensitive isolates lacked KatG sequences and all expressed catalase. 8(25%) INH-resistant isolates did not express catalase and 3(10%) lacked KatG gene, most of which were strains of high levels of resistance (MIC>50 μg/ml).
8 INH-resistant isolates were analyzed futher by PCR-SSCP and all were found to have KatG gene mutation. Conclusion These findings indicated that lacking of catalase activity and KatG gene deletion occured mainly in those highly INH-resistant strains, gene mutation other than complete deletion of KatG gene may be the major mechanism of INH-resistance. 【Key words】 Mycoba
cterium tuberculosis Isoniazid Drug tolerance KatG gene Polymerase chain reaction Polymorphism, single-stranded conformational
长期以来，(INH)作为抗结核的首选药物，对结核病的有效控制发挥了重要作用。但近年来，结核分支杆菌的INH耐药性及耐多药性导致了结核病的严重暴发，已引起了公众对结核分支杆菌耐药性以及结核病快速诊断和有效控制的广泛关注。
早年的研究［1～3］就已发现INH耐药菌中过氧化氢酶活性的缺乏与INH耐药性之间有密切关系。直到1992年，Zhang等［4］才克隆出过氧化氢酶的编码基因(KatG基因)，并发现INH高度耐药菌中有2/3完全缺失KatG基因，从而首次从基因水平上对结核分支杆菌的INH耐药性进行了研究。但近年来国外学者应用多种基因检测技术对KatG 基因结构进行了更为精确的分析，结果表明：引起INH耐药性的主要原因是KatG基因中更为精细的变异——点突变、部分缺失或碱基对的插入，而非单纯的KatG基因的完全缺失。
本研究中采用酶学方法和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对结核分支杆菌过氧化氢酶活性、KatG基因及基因突变进行检测，从而探讨其与INH耐药性之间的相关关系。
材料与方法
1.菌种来源及药敏试验：标准株H37Rv由中山医科大学微生物室提供；58株INH耐药及敏感的临床分离株由湛江市港区医院和结核病防治所细菌室提供，其中敏感株26株，耐药株32株。药敏试验：采用改良罗式培养基绝对浓度法的间接法。耐药标准：INH敏感：≤0.2 μg/ml；低度耐药：>0.2 μg/ml； 中度耐药：>1 μg/ml；中高度耐药：>10 μg/ml；高度耐药：>50 μg/ml。具体操作参照结核病诊断细菌学检验规程进行。
2.过氧化氢酶活性测定：刮取细菌一环加入盛有0.5 ml磷酸盐溶液(0.041 mol/L，Na2HPO4；0.026 mol/L，KH2PO4［pH7.0］)的Eppendorf管中，再加入0.5 ml等量混合的10% Tween80和30%H2O2，观察5分钟。若出现气泡则为阳性，气泡产生多提示酶活性高，气泡产生少提示酶活性低；若无气泡产生则为阴性。
3.DNA提取：采用蛋白酶K法。
4.PCR：(1)引物：采用Stoeckle等［5］设计的一对引物，其序列为：KatG1：5′-GCGATCACATCCGTGATCACA-3′；KatG2：5′-GTCAGGGCGTCAAGTCGACTG-3′。由中科院上海生物工程研究中心合成和纯化。(2)PCR扩增：采用25 μl反应体系，引物KatG1和KatG2终浓度各1 μmol/L；4×dNTP终浓度各200 μmol/L；Taq DNA 聚合酶1U。扩增程序为：93℃预变性2分钟，93℃变性45秒，55℃复性45秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸5分钟。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，紫外检测，若出现282 bp扩增带即为阳性。
5.SSCP：(1)主要仪器：自制的水平电泳板和低温循环仪。(2)主要试剂：丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED购于美国Sigma公司。(3)聚丙烯酰胺凝胶(PAG)浓度：12.5%分离胶及
6.25%浓缩胶。(4)SSCP分析法：2 μl PCR产物加3 μl甲酰胺染液(99%甲酰胺、0.01%溴酚兰)，96℃水浴变性5分钟，立即冰浴骤冷，取2 μl上样，然后进行低温水平板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。经银染后即可直接观察结果
并拍照。
结果
一、过氧化氢酶活性测定
26株敏感菌中，除1株过氧化氢酶活性低外，其余25株均有很高的过氧化氢酶活性。32株耐药菌中，7株(22%)过氧化氢酶活性低，8株(25%)完全缺乏过氧化氢酶活性(χ2检验，P<0.01)。13株中度耐药菌中，仅1株(8%)缺乏过氧化氢酶活性；7株中高度耐药菌中，有2株(29%)缺乏过氧化氢酶活性，而在MIC>50 μg/ml的6株高度耐药菌中，有5株(83%)完全缺乏过氧化氢酶活性(χ2检验，P<0.01)(见附表)。
二、KatG基因检测
所有26株敏感菌均有KatG的表达；在32株耐药菌中，29株(90%)有KatG基因表达，仅3株(10%)完全缺失KatG基因(χ2检验，P>0.05)。这3株菌均是MIC>50 μg/ml的高度耐药菌，占高度耐药菌的50%。而在MIC0.2～50 μg/ml的26株耐药菌中，却无一株完全缺失KatG基因(见附表)。
附表 结核分支杆菌过氧化氢酶活性和KatG基因检测结果调漆设备
压铆螺钉
MIC(μg/ml)菌株数
过氧化氢酶活性KatG基因高低无(+)(-)
≤0.2262510260
>0.2651060
>1131201130
>10705270
>50601533
合计584288553
三、SSCP分析
以结核分支杆菌标准株H37Rv作为对照，对8株不同程度的INH耐药菌(MIC1～>50 μg/ml)及2株敏感菌进一步作SSCP分析，结果发现：所有8株耐药菌均有一条单链带泳动异常，其单链带型与标准株单链带带型不同，而2株敏感菌的单链带泳动正常，其带型与标准株单链带带型完全一致(见附图)。
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A～H：临床分离耐药株；I、J：临床分离敏感株；标：标准株H37Rv；M：pBR322/HinfⅠ标志物
附图 结核分支杆菌KatG基因的PCR-SSCP图谱
讨论
早在1954年，Cohn等［1］就已发现：在INH耐药性结核分支杆菌中过氧化氢酶活
性缺乏或降低。随后，Wolinsky等［2］的研究也证实了这一点，认为过氧化氢酶活性
的缺乏主要发生于INH高度耐药菌(MIC≥10 μg/ml)中。而在中低度耐药菌(MIC 0.2～
5 μg/ml)中，则均有过氧化氢酶的表达［3］。本实验中，我们采用了4种不同浓度的
INH作药敏试验，以便对不同程度的INH耐药菌进行详细的研究。我们的研究结果也充
分证明了过氧化氢酶活性的缺乏与INH耐药菌，尤其是与高度耐药菌之间存在着密切
的关系。
1992年，Zhang等［4］首次从基因水平上对结核分支杆菌INH耐药性进行了研究，
发现在3株MIC>50 μg/ml的高度耐药菌中，有2株完全缺失KatG基因。认为结核分支
杆菌中KatG基因的完全缺失导致了过氧化氢酶不被表达，从而引起了结核分支杆菌的
INH耐药性。次年，Stoeckle等［5］研究显示：76%的耐药菌株都有完整的KatG基因，
而敏感菌株中却有10%无KatG基因。Brien等［6］从30株INH耐药菌中仅检测到2株(7%)
KatG基因完全缺失。总结近年来众多学者［5～7］的研究发现：即使在INH耐药菌株
中，绝大部分都存在KatG基因的表达，KatG基因的完全缺失仅占INH耐药菌株的7%～
24%。本实验研究发现：仅有10%的耐药菌完全缺失KatG基因，且均是MIC>50 μg/ml
的高度耐药菌。由此可见，KatG基因完全缺失仅与高度耐药菌之间存在着一定的关
系，而与中、低度耐药菌之间无明显相关性。因此，我们认为：KatG基因完全缺失不
无铬钝化液是INH耐药性的主要原因，在不同程度INH耐药性结核分支杆菌中，可能存在着不同的
耐药机制。
早年，Zhang等［8］将KatG基因的功能性拷贝导入2株INH耐药菌中，使之恢复了对INH的敏感性，经DNA探针杂交，这2株菌均呈阳性反应，但无过氧化氢酶的表达，说明其KatG基因中存在点突变。次年，Altamirano等［7］的研究第一次提供了KatG基因点突变、插入和缺失的直接证据。在他们研究的9株耐药菌中，仅1株(11%)的KatG 基因完全缺失而其余8株经DNA测序及SSCP分析存在点突变、部分缺失及碱基对插入。近年来，DNA杂交技术、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、PCR-SSCP技术、DNA测序等基因检测技术已广泛用于KatG基因及其突变的检测［9，10］。结果发现：INH耐药性结核分支杆菌中，KatG基因突变较其完全缺失更为普遍。Frank［10］的研究进一步发现：在MIC≥1 μg/ml的INH耐药菌株中，有44.2%存在KatG基因463位点上精氨酸→亮氨酸的突变。本实验中，我们采用PCR-SSCP技术对8株不同程度的INH耐药菌及2株敏感菌作了进一步的检测，结果发现8株耐药菌中均存在KatG基因的突变。其中，有4株完全缺乏过氧化氢酶活性，3株过氧化氢酶活性降低。这充分说明了KatG 基因突变导致过氧化氢酶活性降低或缺乏，从而引起结核分支杆菌的INH
耐药性。由此看来，KatG基因突变可能是引起结核分支杆菌INH耐药性更为重要、更为普遍的原因。但实验中发现有1株KatG基因突变的中度耐药菌有较高的过氧化氢酶活性，说明某些KatG基因突变并不影响其产物酶的表达。提示：在结核分支杆菌INH耐药性中，可能还存在着其它的耐药机制。
综上所述，结核分支杆菌的INH耐药性是相当复杂的，迄今为止的大量研究还不能对此作出完全解释，尚有许多领域需要进一步探索。近年来，另外两个INH耐药性相关基因——inhA基因和aphC基因的开发，也证实了这一点。今后的研究，应着重对这些INH耐药基因作进一步的DNA序列分析，以明确其突变位点、突变类型及发生频率，并探讨其与INH耐药性之间的相关关系。此外，尚需进一步开发更为特异的INH耐药性相关基因，从而建立一种快速、有效的INH耐药性诊断方法，为结核病的快速诊断和有效控制开辟广阔的前景。
作者单位：518116 深圳市龙岗中心医院呼吸内科(王晓川)；广东医学院呼吸疾病研究室(韩清韶、梁标)
参考文献
1 Cohn ML, Kovitz C, Oda U, et al. Studies on isoniazid and tubercle bacilli Ⅱ. The growth requirements catalase activities and pathogenic properties of isoniazid-resistant mutants. Am Rev Tuberc, 1954, 70:641-664.
2 Wolinsky E, Smith MM, Steenken W, et al. Isoniazid susceptibility, catalase activity, and guinea pig virulence of recently isolated cultures of tubercle bacilli. Am Rev Tuberc, 1956, 73:768-772.
3 Rastogi N. Mode of action of antituberculous drugs and mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Res Microbiol, 1993, 144:133-143.
4 Zhang Y, Heym B, Allen B, et al. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis. Nature, 1992, 358:591-593.
5 Stoeckle MY, Guan L, Riegle N, et al. Catalase-peroxidase gene sequences in isoniazid-
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