1溶液配制
1.1PBS：磷酸盐缓冲呀（10X）
高温瞬时灭菌
加入双蒸水900ml左右，调节PH7.4，定容至1000ml。 1.2PBST：磷酸盐吐温缓冲液
Tween-20为一种非离子表面活性剂，一种去污剂，能够在不破坏蛋白质的情况下，洗脱非特异性结合的抗体。Tween-20既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是：借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的。 洗涤缓冲液：含0.05% Tween-20 的中性PBS（即1*PBST）
配置：100ml 10*PBS; 2.5ml 20% Tween-20，定容至1L
调节PH7.4
1.320% Tween-20
10g Tween-20, 加蒸馏水约30ml, 可4℃过夜，溶解均匀后定容至50ml。
0.05mol/L碳酸缓冲液（PH9.6）
配制：
碳酸钠0.75g，碳酸氢钠1.46g，定容至500ml，测PH9.6.
1.5封闭液
同时率要求：用4℃预冷的1*PBST配置成2%的BSA溶液
配制：10ml 2%BSA封闭液：0.2g BSA粉末，溶解于10ml PBST中，摇晃溶解，后放入4℃冰箱（最好提前一天配制，防止泡沫过多）。
保存：4℃
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1.7血样稀释液
A.小肽标签稀释液母液：60mg/ml（-80℃保存）
配制：1ml 60ug/ml的小肽：1ml 4℃2% BSA 1*PBST+1ul小肽母液，混匀，4℃保存
B.血清稀释液
血清稀释液：5ug/ml（溶质是小肽，溶剂是封闭液）
一块96孔板需要12ml血清稀释液，即11ml的封闭液，1ml 60ug/ml的小肽
1.8显液
TMB，是辣根过氧化物酶的常用底物。
在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生蓝产物。蓝产物在370nm/620-650nm测定吸光度（A）
1.9终止液
2M H2SO4一次性滴管吸取，慢慢加入水中。(M=mol/L)
定位片
配制：
180ml H2O：20ml H2SO4=9:1（浓硫酸加入水中，并搅拌散热）
2实验流程
2.1PDA铺板
DA母液：
一级母液：
二级母液：80ug/ml（溶剂是蒸馏水）
梯度稀释：（溶剂是pH：8.8 tris）
1.按照梯度稀释表进行倍比稀释。
2.（铺板条件）按100ul/孔加至96孔酶标板凹孔里，常温（25℃）过夜。
2.2洗涤
1.铺板结束后弃掉铺板液，用蒸馏水清洗3次。
2.最后拍干净96孔酶标板。
2.3包被
取出包被物质，根据设计方案，计算包被物质的量、包被缓冲液稀释液的体积。
1.包被稀释液稀释样品至10ug/ml。
2.（包被条件）按100ul/孔加至96孔酶标板凹孔里，4℃过夜（方案2：先置于37℃孵
育2h后再转入4℃过夜）。
2.4洗涤
1.包被结束后弃掉包被液，用300ul PBS清洗3-6次，每次5-10min
2.最后拍干净96孔酶标板。
2.5封闭
1.加入300ul封闭液（2%BSA），体积至少为包被液的2倍
2.（封闭条件）室温至少2（2-4）小时（方案2：置于4℃过夜）。
2.6洗涤
1.包被结束后弃掉包被液，用300ul PBS清洗3-6次，每次5-10min
2.最后拍干净96孔酶标板。
2.7加入一抗
1.准备血清样品，1:30稀释，稀释液为含5ug/ml His-Flag小肽的2%BSA-1*PBST，配置后
室温放置30min。
2.加入稀释好的血清样品100ul，室温孵育90min。
2.8洗涤
1.结束后，用PBST洗涤3次，300ul PBS清洗3-6次。
2.最后拍干净96孔酶标板。
2.9加入二抗
二抗是羊抗人IgG，-20℃保存，使用时候冰上溶解，1:1000用封闭液稀释
加入二抗工作液100ul（1:500稀释，稀释液含5ug/ml His-Flag小肽的2%BSA-PBST），室温孵育1h。
配制：一块96孔板需要10ml，即10ml封闭液，10ul羊抗人IgG母液，混匀，4℃保存2.10洗涤
1.结束后，用300ul PBST洗涤3次，PBS清洗3-6次。
2.最后拍干净96孔酶标板。石瓜子莲
2.11显
TMB，是辣根过氧化物酶的常用底物。
在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生蓝产物。蓝产物在370nm/620-650nm 测定吸光度（A）
加入显液200ul，室温10（3-30）分钟。
2.12终止
2M H2SO4硫酸终止，溶液呈现黄，在450nm处测定吸光度园林垃圾桶
TMB显终止液，溶液保持蓝不变，在620-650nm测定吸光度
加入终止液50ul，测定OD450。
396孔ELISA板加样示例
注：阴性对照：2%BSA包被；阳性对照：5ug/ml的人血球蛋白包被。
4注意事项
1.正式实验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制实验条件，待检样品应做一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA 等封闭。 ①固相载体的选择。许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显反应是否均一，据此判明其吸附性能是否良好。
②包被抗体(或抗原)的选择。将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时-般要求pH在9.0-9.6之间。吸附温度、时间及其蛋白量也有一定的影响，一般多采用4℃18-24h。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.lμg/mL、1.0μg/mL和10μg/mL等)进行包被后，在其他实验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而
蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说，通常为1-10μg/ mL。
③酶标记抗体工作浓度的选择。首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部分)。然后再固定其他条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
④酶的底物及供氢体的选择。对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显的显反应，而本身无。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护，有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间以10-30min为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H
2O2在临用前加入。
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