DEPC处理水：在ddH2O中加入DEPC，使浓度为0.1%，充分摇匀，再在
37℃放置12 h以上，然后高压灭菌；（DEPC可破坏各种蛋白，是Rnase的强抑制剂）
4%多聚甲醛-MOPS固定液：该溶液含4%（质量体积比）多聚甲醛，0.5 M
NaCl，2 mM EGTA，0.1 M MOPS，DEPC处理水新鲜配制；
NaPBS溶液：称取6.57 g Na2HPO4.12H2O，0.235 g NaH2PO4.2H2O，9 g NaCl，
加ddH2O至1L，调pH至7.4，0.1%终浓度DEPC处理，高压灭菌；
NaPBSTw：NaPBS溶液加Tween-20，使Tween-20的浓度为0.1%，新鲜配制；
4%多聚甲醛-NaPBSTw纱窗角码溶液：将固体多聚甲醛溶于NaPBSTw至终浓度为4%
（质量体积比）新鲜配制；
5mg/mL 景区拍照蛋白酶K：将蛋白酶K溶于PBST，配成终浓度为5 mg/mL溶液，-20℃保存； （储存浓度为5mg/ml,用时只需取1ul加入1mlPBST）
10%甘氨酸：用DEPC处理水配制，使终浓度为10%（质量体积比），-20℃
保存；(甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂)
2 mg/mL甘氨酸-NaPBSTw：用NaPBSTw溶液配制，使终浓度为2 mg/mL，-20℃保存；（20ul 10%甘氨酸加入1mlPBST）
0.1 M三乙醇胺：用DEPC处理水配制，使终浓度为0.1 M，调pH至8.0，-20℃保存；（135ul加入10mlDEPC处理水）
20×SSC：该溶液用DEPC处理水配制，含0.3 M柠檬酸三钠，3 M NaCl，调pH至7.0，4℃保存；(SSC划线仪
缓冲液中的盐离子Na+ 可中和RNA/DNA主链上的负电荷，使其呈电中性，这样可以使探针和把序列的结合比较容易进行。)
50×Denhardt's溶液：购于Sigama公司,-20℃保存；
杂交缓冲液：该缓冲液中含有50%去离子甲酰胺，100 mg/L肝素，5×SSC， 0.1% Tween-20，5 mM EDTA，1×Denhardt's，l mg/mL酵母总RNA，用DEPC处理水配制，然后分装1 mL/支，-20℃保存（一般采用去离子甲酰胺调节孵育温度,有报道反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。但是不同的实验条件与实验室需要确定自己的杂交条件。肝素是一种由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，具有强酸性，并高度带负电荷）
杂交缓冲液配方如下：
Content | quantity | Final concentration |
100% deionized formamide | 50ml | 50% |
10mg/ml Heparin（肝素） | 1ml | 100µg/ml |
20X SSC | 25ml | 5X |
100% Tween | 100µl | 0.1% |
0.5M EDTA | 1ml | 5mM |
50x Denhardt’s | 2ml | 1X |
100mg /ml Yeast total RNA | 1ml | 1mg/ml |
DEPC H2O | To 100ml地籍测量 | |
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Wash Buffer:
Wash solution Ⅰ (Total 50ml) | 小麦磨粉机component | volume | final concentration |
deionized formamide | 25ml | 50% |
20X SSC | 12.5ml | 5X |
10% SDS | 5ml | 1% |
DEPC H2O | 7.5ml | |
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Wash solution Ⅱ (Total 50ml) | component | volume | final concentration |
deionized formamide | 25ml | 50% |
20X SSC | 5ml | 2X |
10% SDS | 5ml | 1% |
DEPC H2O | 15ml | |
| | | |
Wash solution Ⅲ (Total 50ml)顾婷婷是什么梗 | component | volume | final concentration |
20X SSC | 5ml | 2X |
Tween-20 | 50µl | 0.1% |
DEPC H2O | 45ml | |
| | | |
Wash solution Ⅳ (Total 50ml) | component | volume | final concentration |
20X SSC | 0.5ml | 0.2X |
Tween-20 | 50µl | 0.1% |
DEPC H2O | 49.5ml | |
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Wash solution V：1mg/ml blocking reagent用1X NaPBS配置，0.1% Tween-20，4℃保存；(用50ml离心管称取0.05g blocking reagent，加PBST至50ml,65℃水浴至溶解，4℃保存)
羊血清：新购买的羊血清需置55℃预处理30 min以灭火补体，然后1 mL/管分装，-20℃保存；
杂交封闭阻断液：溶液含10%羊血清，1mg/ml blocking reagent，NaPBS配制；（100ul羊血清+900ul洗液V）
1:3000碱性磷酸酶偶联抗DIG抗体液(6ml)：秤取6mg blocking reagent 于800uL NaPBS/0.1%TritonX-100中70℃加热30min溶解后再加入200uL 20mg/ml BSA、200uL羊血清和2uL抗抗体混匀并放震荡器上在室温震荡1小时以上，或者4℃震荡过夜。然后再加入4ml NaPBS/0.1%TritonX-100、400uL 20mg/ml BSA和400uL羊血清混匀，4℃保存。
120mg/ml Levamisole ：1.2g Levamisole（左旋咪唑），10 ml 灭菌水配制而成；
显缓冲液（10ml）：该缓冲液由1 ml 1 M Tris pH9.6，500 µl 1M MgCl2，200 µl 5M NaCl，40µl 120mg/ml Levamisole，再加水补足10ml。
BM purple AP substrate显液：购于Roche公司，4℃保存。
第一天：
1. 胚胎和幼体：一般每个时期20个，未孵化胚胎要用昆虫针去除受精膜。胚胎置于漏网中，于4孔板中换液。(使用前注意检查漏网是否损坏)
2. 用500ulNaPBSTw(重新水化)洗2-3次，每次5 min，置摇床上，缓慢摇动。过程中可配置以后步骤所需的蛋白酶K（PK）（）和2 mg/mL甘氨酸，PK置于37℃预热。（除第三天显液每孔加300ul溶液外，其余每孔均加500ul）
3. 换液至预热的5 μg/mL的PK（消化增加胚胎通透性）中，在37℃杂交炉中消化。消化时间参照：出膜前胚胎不消化，出膜神经胚消化5min，开口幼体消化8-10min，三鳃裂幼体消化15min。（消化的目的是增加胚胎的通透性，使探针能够顺利进入胚胎内部，提高探针的特异性结合。如果消化不够会出现探针非特异性结合，如果消化太过会使胚胎组织破碎） 1ul——1mlPBST 4. 在每个孔中加入10 μL 10%甘氨酸，轻轻晃匀以终止消化。
5. 迅速换液至2 mg/mL甘氨酸（终止消化），缓慢摇动5min. 20ul—1mlPBST
6. 换液至NaPBSTw中，室温洗5 min，置摇床上，缓慢摇动。
7. 换液至4%多聚甲醛-NaPBSTw（固定），室温l h，不要摇动。（若时间紧迫，可只固定30min）
8. 换液至0.1 M三乙醇胺，静置1 min。 135ul——10mlDEPC水
9. 换液至0.1 M三乙醇胺，摇动5 min。
10. 于无菌离心管中加1 mL 0.1 M三乙醇胺，2.5 μL乙酸酐，混匀，每孔加500 μL混匀液，静置5 min。
11. 于无菌离心管中加 1 mL 0.1M三乙醇胺，5 μL乙酸酐，混匀，每孔加500 μL混匀液，静置5 min。
12. 换液至NaPBSTw ，摇动5 min。将杂交缓冲液放入杂交炉预热。
13. 换液至预热的杂交缓冲液1（预杂交），立即进行下一步。
14. 迅速换液至预热的杂交缓冲液2（预杂交），用保鲜膜将四孔板包紧再放进有湿纸巾的测序袋中防止缓冲液蒸发,杂交炉中65℃缓慢摇动3-4h。回收杂交缓冲液1。
15. 将含探针杂交缓冲液置于72℃水浴5min。加入预热的含探针杂交缓冲液（杂交），于杂交炉中65℃轻摇过夜。
第二天：
(SSC缓冲液中的盐离子Na+ 可中和RNA/DNA主链上的负电荷，使其呈电中性，这样可以使探针和把序列的结合比较容易进行。去离子甲酰胺调节孵育温度。肝素具有强酸性，并高度带负电荷)
1. 预热wash solution A(WS A) 、wash solution B（WS B）至65℃。
2. 回收含探针杂交缓冲液，换为WS A在65℃洗3次，时间分别为5min，15min，15 min。
3. 换为WS B（将WS B转移到室温放置），65℃轻摇5 min（时间需精确），然后转移到室温轻摇10min
4. 更换新的WS B室温轻摇15min（时间需精确）。
5. 换液到WS C，并马上换到新的WS C，在室温轻摇5min。
6. 再用WS C在室温轻摇洗2次，每次30min。
7. 换液至WS D,室温轻摇20min。
8. 换至WS E，室温摇动5 min。并配置杂交阻断液（与非特异性位点结合，防止非特异性杂交）：在1mL WS E中加入100µl的羊血清。
9. 换液到杂交阻断液中，在室温阻断3-4h。
10. 新配制的抗体不需要离心，用过几次的需10000g室温离心3~5min,换液至抗体（抗抗体与结合），4℃过夜。
第三天：
1. 洗去多余的抗体：室温下，回收抗体，用NaPBSTw置换，轻摇20-30 min；重复4次（均放在摇床上轻摇）。
2. 置换成显缓冲液1（AP Buffer1），室温轻摇 10 min。
3.换液至AP buffer 2，室温轻摇20min。过程中要将胚胎从网兜中吸出，因为染不方便在网兜中进行。在这步也可洗久一点，要尽量将胚胎清洗干净，不要有杂质附着，以免造成非特异染。
4. 吸取适宜体积BM Purple AP substrate显液室温1000g离心1min,每孔加300ul,室温下显。
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