CMV、PVY 、TMV、3种植物病毒ELISA检测实验步骤

以下斜体部分均为1块96孔ELISA板试剂用量

1. 磨样：在2mL离心管中加如10粒钢珠后，加入0.25-0.30g叶片（1.5cm打孔器9片叶子的重量），再加入800μL抽提缓冲液（1*GEB）。样品经组织研磨器磨碎处理后，1200转离心2min，将上清液转入新的离心管，编号后4℃保存，作为待测样本。

2．稀释包被抗体：10mL包被缓冲液+50μL包被抗体浓缩液；

(一般下午或晚上做2，3，4步骤)

3.包被ELISA板：（用排加样）每孔加入100μL上述包被抗体稀释液；

4孵育：加样完成后，将ELISA板放入冰箱冷藏室，4℃过夜。

5.洗板：

(1).将包被好的ELISA板废液倒掉,在吸水纸上拍干；

(2).每孔加入1*PBST,静置1min，倒掉并拍干。连续洗3次，拍干。

6.加待测样本：（用单道加样，每加一个样换一次头）每孔加100μL待测样本，阳性对照孔加100μL阳性对照液（按阳性质控小瓶上说明加适量抽提缓冲液（1*GEB）稀释），阴性对照孔加100μL抽提缓冲液（1*GEB）。阳性对照和阴性对照均设双孔。

（注意：严格对照实验设计图表仔细加样，不可加错样。）

7.孵育：加样完成后，将ELISA板放入生化培养箱，25℃放置2h；

8.洗板：同5，重复4次，最后一次洗板结束后，彻底拍干。

（注意：洗板结束前20min，完成第9步制备酶标抗体稀释液。）

9.制备酶标抗体稀释液：

TMV:10mL ECI缓冲液+50μL TMV酶标记物，混匀（TMV只有一种酶标记物）；

CMV:10mL ECI缓冲液+50μL A酶标抗体+50μL B酶标抗体，混匀；

PVY:10mL ECI缓冲液+50μL A酶标抗体+50μL B酶标抗体，混匀。

10.加酶标抗体稀释液：（用排加样）每孔加100μL上述相应的酶标抗体稀释液。

11.孵育：加样完成后，将ELISA板放入生化培养箱，25℃放置2h；

12.制备PNPP底物：称取10mg PNP固体粉末，加入10mLPNP缓冲液，使其完全溶解。

(注意：1、PNPP有毒，不可直接接触皮肤；2、PNPP粉末和溶液均不可暴露在强光下。)

13.洗板：同5，重复6次。最后一次洗板结束后，彻底拍干，并且确定孔中没有小气泡。

14.加PNP底物:(用排加)每孔加入100μL PNP底物；

15.显：加样完成后，将ELISA板放入生化培养箱，25℃放置1h；

(注意：孵育显时，ELISA板避免光线照射。)

16.读数：将显后的ELISA板置于酶标仪中，405nm条件下读数；

(注意：只有在阳性质控孔明显显，且阴性对照孔不显时，实验结果才是可靠的。)

毛刷制作

溶液制备

1. 包被缓冲液（需2000mL）

2.1*PBST(洗涤液)（需200L）

	500mL	1000mL	5L
氯化钠NaCl	4.0g	8.0g	40g
磷酸二氢钠NaH2PO4	0.575g	1.15g	5.75g
磷酸氢二钾K2HPO4	0.1g	pc104总线0.2g	1.0g
吐温-20	250μL	500μL	2.5mL
	加400mL蒸馏水溶解，用1mol/L NaOH调节pH值到7.4，再定容至500mL，室温贮存。	加800mL蒸馏水溶解，用1mol/L NaOH调节pH值到7.4，再定容至1000mL，室温贮存。	加4L蒸馏水溶解，用1mol/L NaOH调节pH值到7.4，再定容至5L，室温贮存。

3.抽提缓冲液（1*GEB）（需5000mL）

	500mL	调漆设备1000mL
亚硫酸钠Na2SO3	0.65g	1.3g
聚乙烯吡咯烷酮PVP	5.0g	10g
吐温-20	10.0mL	20mL
	加400mL 1PBST溶解，用1mol/L NaOH调节pH值到7.4，再加1PBST定容至500mL,4℃贮存。	加800mL 1PBST溶解，用1mol/L NaOH调节pH值到7.4，再加1PBST定容至1000mL,4℃贮存。

4.ECI缓冲液（现配）（需2000mL）

	500mL	1000mL
牛血清蛋白BSA	1.0g	2.0g
聚乙烯吡咯烷酮PVP	5.0g	10g
	加400mL 1PBST溶解，用1mol/L NaOH调节pH值到7.4，再加1PBST定容至500mL,4℃贮存。	加700mL 1PBST溶解，用1mol/L NaOH调节pH值到7.4，再加1PBST导电碳油定容至1000mL,4℃贮存。

5.PNPP（4-硝基苯基磷酸二钠盐）缓冲液（现配）（需2000mL）

野葛根提取物

	500mL	1000mL
MgCl2·6H2O	0.05g	0.10g
二乙醇胺	48.5mL	97.0mL
	加400mL蒸馏水溶解，用1mol/L HCl调节pH值到9.8，再加蒸馏水定容至500mL，现配现用。	加700mL蒸馏水溶解，用1mol/L HCl调节pH值到9.8，再加蒸馏水定容至1000mL，现配现用。