第一章 绪论
第二章 植物组织培养实验室组成、仪器设备及无菌操作技术
第三章 植物组织培养基本原理
第四章 器官培养技术
第五章 植物胚胎培养
第六章 花粉及花药培养
第七章 细胞及原生质体培养
第八章 组培培养技术在中药学上的应用
第一章微安表 绪 论
一、植物组织培养的概念
1. 概 念
植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。 2.主要特征
（1）在培养容器中进行；
（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；
（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；
（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：
根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：
（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。 2、根据再生途径分为：
（1）器官发生途径（Organogenesis）：
直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。如茎尖培养。
间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。如叶片培养。
（2）体细胞胚胎发生（Somatic embryogenesis）：
体胚发生途径是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件下．未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。经体胚发生形成类似合子胚的结构称为胚状体（embryoid）或体细胞胚(somatic embryo).
人工种子（Artificial seed，SyntheticSeed）：是指植物离体培养产生的胚状体或不定芽被包裹在含有营养和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。作为繁殖材料。
3、根据培养基的类型分为:
（1）固体培养（Solid culture）: 琼脂、卡拉胶等固化。
（2）半液半固体培养(Semisolid Culture)：固液双层。
（3）液体培养(Liquid Culture)：震荡、旋转或静置培养。
液体培养的优点：
A 不使用凝固剂，节约生产成本
B 营养吸收充分；
C 操作过程简化。
三、植物组织培养技术的理论基础
植物细胞的全能性(Plant cellular totipotency）
从理论上讲，植物体的每个生活细胞都具有该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。
分化、脱分化与再分化：分化是指个体发育过程中，不同部位的细胞形态结构和生理功能
虚拟数据线发生改变，形成不同组织或器官。 脱分化也称去分化，是指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生能力，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。再分化是由脱分化形成的愈伤组织重新分化出特定细胞、组织和器官的过程。细胞全能性的表达：尽管理论上每个细胞都具有全能性，但实际表达难易程度却随植物种类、组织和细胞的不同而异。
四． 植物组织培养技术的发展历史
1、 早期探索阶段 （1930年以前）
1893年，Schwann和Scheiden提出细胞学说及植物细胞全能性理论。1902年，德国植物生理学家Haberlandt第一次尝试采用植物组织培养技术对小野芝麻、风眼兰叶肉组织及万年青属植物的表皮细胞进行培养，但未能培养成活。1904年，Hanning首次对十字花科的萝卜和辣根的胚培养成功。1922年，Knudson将兰花种子在离体的条件下非共生萌发。同年，Knotte和Robbins对离体根尖进行了培养。Robbins还对豌豆、玉米及棉花的茎尖进行了培养，只形成一些缺绿的叶和根。1925年，Laibach利用胚培养技术对亚麻的种间胚进行了培养，并于1929年利用亚麻的胚培养来克服杂交不亲和性。
2、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）
1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取液可促进离体胚的生长。1937年，White发现B族维生素对离体根培养的重要性。并指出IAA对植物生长发育的控制起重要作用。1937,1938点子通年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层诱导形成的愈伤组织连续生长。Nobecomt对烟草种间茎段的形成层细胞培养也得到了类似的结果。1948年，Skoog等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生由生长素/腺嘌呤的比例决定。1950年，Ball从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。
1952年，Morel和Martin通过分生组织培养获得大丽花的脱毒植株，同年，首次应用微型嫁接技术。1953年，Tuleche首次从花粉培养中获得银杏的单倍体愈伤组织。1955年，防爆节能灯Miller等发现了一种促进细胞分裂的植物激素—激动素，后来发现激动素可用来代替腺嘌呤促进芽的形成，而且其效力比后者高3万倍。1957年，Skoog和Miller发现改变细胞分裂素/生长素比例，可以控制根和芽的发生。1958年，Maheshwari和Rangaswamy从柑橘胚珠的珠心组织培养中再生获得体细胞胚；同年，Reinert 和Steward分别从胡萝卜的愈伤组织和细胞培养中再生得到原胚，为以后的组织培养中器官发生和体细胞胚胎发生奠定了基础，也为植物细胞全能性理论提供了证据。
3、植物组织培养技术的发展（1960年以后）
1960年，Morel利用兰花茎尖培养对兰花进行营养繁殖； 1962年，Murashige和Skoog开发出最著名的Murashige和Skoog培养基（MS基本培养基），并被后来广泛采用的基本培养基。1964年，印度人Guha和Maheshwari利用曼陀罗花粉培养获得第一例单倍体植株。从而开辟了单倍体育种技术。1971年，Takebe等获得第一例原生质体培养的再生植株。
1972年，Carlson等利用原生质体融合在两个烟草属中进行种间杂交。1974年，Murashige等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。Zaenen和Larebeke分别发现土壤农杆菌（Agribacterium）中的根瘤诱导的主要成分是Ti质粒。1978年，Melchers等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交。1979年，Marton提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共培养的方法进行转化。1981年，柿子削皮机Larkin和Scowcroft引入“体细胞无性系变异（Somaclonal variation）”这一术语。1982年，Krens等的工作证明，原生质体可以摄入裸露的DNA，表明可以用外源DNA对原生质体进行遗传转化。1982年，Zimmermann利用电刺激进行原生质体融合。1985年，Horsch等用土壤农杆菌对叶盘进行感染和转化，并得到再生的转化植株。
五、植物组织培养技术的应用
1、优质种苗的快速无性繁殖：
（1）无性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖
（2）通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、 甘蔗、马铃薯、大蒜等。
2、用于植物遗传育种
包括种质资源离体保存；花粉花药培养产生单倍体；胚乳培养产生三倍体；胚培养拯救胚克服远缘杂交障碍；原生质体培养进行体细胞杂交；植物体细胞无性系变异诱导和筛选；用于植物基因转移操作等。
3、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次生代谢物质；
4、用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。
第二章 植物组织培养的基本技术
第一节 实验室结构、仪器设备及操作技术
一、植物组织培养实验室的结构及设计要求：
完整的植物组织培养室通常包括洗涤室、化学实验室、接种室、培养室、细胞学实验室等部分。可以根据实际需要和条件进行设计。但从功能上至少包括化学实验室或准备室、接种室以及培养室三部分，并且按顺序排列。 在化学实验室与接种室之间应留有缓冲空间。
（一）化学实验室（准备室）：
1. 主要功能：
用于培养器皿的清洗、培养基的配制、分装和灭菌、试管苗的出瓶及整理等工作。
2. 主要仪器设备及用品：
冰箱、天平、高压灭菌锅、自动平开门pH计、干燥箱、实验台、水槽、凉干架、药品柜、离心机、水浴锅、微波炉、电炉、磁力搅拌器、蠕动泵、移液器、各种玻璃器皿（烧杯、量筒、容
量瓶、试剂瓶、三角瓶等）及培养基分装用品等。
（二）接种室（无菌操作室）：
1、功能：植物材料的灭菌、接种以及培养物的继代转接等。接种室要求保持洁净，与化学实验室之间应设置缓冲室。
2、仪器设备及用品：
超净工作台、紫外灯、小推车、搁架、磁盘、接种工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌过滤器等）等。
（三）培养室：
1、功能：主要用于植物材料的培养。要求室内洁净并能保持一定的温度、光照以及湿度以适合植物材料的生长和分化。
2、仪器设备及用品：
培养架及灯管、摇床（振荡器）、空调、自动定时器、加湿及除湿器、光照培养箱、温湿度计灯等。
（四）细胞学实验
1、功能：主要用于培养材料的显微观察及照相等。
2、仪式设备及用品：
体视显微镜、普通显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜、配套显微照相装置、普通相机或数码相机、切片机及配套制片及染用品等。
二、实验室基本操作：
（一）洗涤：
1. 普通器皿：采用洗衣粉、洗洁精等中性洗涤剂洗涤。
2. 难清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重铬酸钾洗液浸泡，最后清水冲洗，或用超声波仪清洗。
（二）灭菌：
1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。
（1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150 ℃保温2小时，成本较高。
（2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120 ℃ 15－20分钟 。
（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。
2、培养基灭菌：
采用高压蒸汽灭菌。120℃ 15－20分钟。培养基体积越大，灭菌时间越长。
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