安徽科技学院
农学院 种子科学与工程 杨立平 1119120224
摘要：在适宜的条件下，将兰花植株的外植体在无菌环境中应用人工培养基，通过外植体的采集与处理、培养基的制作、外植体的接种、继代增殖以及驯化移栽等操作技术，可在短期内获得大量幼小的无病毒植株，从而达到增殖扩繁的目的。组织培养技术是经济有效快速繁殖优良品种的方法，也是产生脱毒苗的重要途径。 关键词：组织培养 兰花 外植体 试管苗
花属兰科多年生草本植物，中国兰花为兰科属中的地生兰。其香味怡人，花淡雅，品种丰富，素有“花中君子”之称。具有很强的观赏价值和经济价值，深受人们的喜爱。此外，其也是目前世界上栽培较广的切花材料之一，兰花的切花生产，需要大批量的种苗，要获得优质高产，兰花种苗必须具备种性一致，生长齐一，长势旺盛的特点。在种苗生产上运用最广泛的是组培快繁和分株。生产实践证明，运用组织培养快繁技术生产种苗，其长势旺盛，品种
复壮，抗病性强，切花质量好，对加快优良品种的培育，挽救珍惜濒危种类等起到十分重要的作用[1]。
兰科(Orchidaceae) 是有花植物中最大的一个科, 约有800 属, 25 000～30 000 种, 广泛分布于全球各地。兰花是整个兰科植物的总称, 常见的有春兰、蕙兰、建兰、蝴蝶兰、石斛、卡特兰, 文心等, 其花具有极高的欣赏价值和经济价值。有些种类如天麻等则具有极高的药用价值。兰花的组织培养始于20世纪60 年代。Morel[1]采用大花蕙兰的茎尖, 在含有细胞分裂素的KC 培养基上进行培养, 茎尖分生组织膨大形成原球茎, 并分化出根和叶, 首次获得兰花无病毒小植株。目前大约已有60 余属数百种兰花可以用组织培养的方法进行繁殖。 兰花在植物分类学上属于单子叶植物中的一个科，为多年生草本植物，附生、地生或腐生。兰花根呈圆柱状，属肉质组织，茎很短，高度约为2～3cm，兰叶大多叶边全缘，有的略有锯齿。其花属于不整齐花范畴，总状花序。兰属植物的果实为蒴果，呈三角或六角形，俗称“兰荪[8]。 传送侦测怎么做
一、无菌培养物的建立
（一）培养容器的洗涤及培养基的制作
1.培养容器的洗涤
容器的洗涤是否干净直接影响组织培养的成败，为保证培养材料在瓶内生长健壮，在培养前期一定要对容器进行彻底的洗涤与灭菌[7]。以达到“瓶壁锃亮、水膜均匀，不挂水珠”为标准。洗涤时用洗衣粉水洗刷，再用清水冲洗3～4次，干燥后备用。
2.培养基与激素
适量的提取物，如在培养基中添加番茄汁、蛋白胨、酵母提取液、水解蛋白、苹果汁、香蕉汁等可促进兰花种子的萌发。附加香蕉泥对原球茎的增殖有明显的促进作用。香蕉匀浆物在KC培养基和White培养基是最适合原球茎增殖的添加物。水解酪蛋白对于原球茎的增殖有明显的促进作用。81。另外，胰蛋A胨、酵母提取物和KC培养基一起使用对原球茎的增殖有促进作用，但酵母提取物在White培养基上使用，对原球茎的增殖却有抑制作用[9]。
用于兰花组织培养的培养基种类繁多, 常用培养基有: KC、MS、VW、BM及改良型。周俊辉等在对蝴蝶兰的研究中表明: 改良KC 对原球茎的增殖效果最好, 其次为1 /3MS, 原球茎增殖应以较低的无机盐浓度为好; 并且在培养中, 添加一定浓度( 2～3 g•L- 1) 活性炭时, 对原球茎的增殖有促进作用[2]。何松林指出: 蝴蝶兰在生根过程中对矿物质盐的需求量较小, 而在长苗过程中则对微量元素和有机成分的需求量稍高一些。目前常使用的外源激素主要是生长素类( 如
IAA、2, 4- D 和NAA) 和细胞分裂素类( 如BA、ZT 和KT) 。一种认为激素能够诱导胚发育形成原球茎, 还可大大加快个体发生和形态建成的速度; 在原球茎的诱导阶段, 加生长素如NAA 和细胞分裂素对原球茎的诱导有利, 加细胞分裂素对原球茎的分化有促进作用; 生根诱导时只需生长素即可。Seeni 等提出, BA 在兰花组织培养中对叶诱导与芽增殖起着重要作用[10]。何子育等则认为在增殖生根与壮苗阶段不需加任何激素。
3.培养基的制作
培养基是植物组织培养的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到外植体的生长于分
化。组培快繁中最常用的培养基主要是MS培养基[3]。母液要根据药剂的化学性质分别配置，一般配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素 类母液。其配置方法是先进行大量元素的配置，称量时应注意多余的药品不能回放在瓶中，应做其它处理。电子天平在使用时先对其进行调平，然后进行微量元素母液、有机物母液的配制。
当MS母液配好以后，则可进行培养基的制作，继之对琼脂和蔗糖进行称取、溶解，琼脂呈现半透明状时将糖加入容器中溶解，再加入事先吸取好的各类母液混合均匀后转入1L容量瓶中对其进行定容，然后根据培养基的要求对PH进行调整（PH值控制在5.6～5.8测定不得少于3～4次）。进行分装时，一般以培养瓶的1/4～1/3为宜，分装后立即进行灭菌。
培养基采用湿热灭菌法，把分装后的培养瓶置入高压锅中进行高温高压灭菌。当压力升至0.11MPa(温度121℃）时，维持15～30min,即可达到灭菌的目的。
（二）外植体的采集及接种
组织培养程序与外植体选择
牵引带种子、胚形态建成途径
用于兰花离体繁殖的外植体材料很多, 通常选择有新芽、幼叶、茎尖等。茎尖是最早用于兰花快速繁殖的外植体。大花蕙兰(Cymbidium) 、嘉德丽亚兰(Cattleya) 、石斛兰(Dendrobim) 恒温扩增仪蝴蝶兰( Phalaeanopsis) 、文心兰(Oncidium) 等首先在茎尖培养中取得成功[2]。侧芽的应用也很广泛, 一般认为带1～2 个叶原基的茎原椎成活率高, 中间部位侧芽成活率及生长率较高。但因为有的兰花只生一茎,摘取茎尖就有可能丧失母株, 因此, 人们在更大范围内寻外植体。用叶片作外植体可以减轻或避免对母株的伤害。大多数以叶片为外植体的成功报道是取试管苗的幼叶为培养材料, 从成熟植株上取幼叶为外植体培养成功的报道不多。有研究指出: 蝴蝶兰试管苗幼叶原球茎发生率可达90%, 而成熟叶对诱导反应极弱[。
这可能是由于成熟植物组织向培养基中释放高浓度的抑制生长物质, 严重影响兰花组织的存活。现已报道的蝴蝶兰外植体材料各异, 不同的外植体其诱导的效率也不同
原球茎( Protocorm-likebody) 是兰科植物组织培养产生的特有现象, 是兰花组织培养的重要形式之一。自1960 年Morel 由惠兰属的象牙惠兰、罗式惠兰、显花惠兰、达式惠兰等的茎尖培养获得无病毒兰花植株以来 , 多年来经过大量的试验与研究,得出影响原球茎诱导的原因有: ( 1) 不同外植体间的诱导差异。如以叶尖、根尖、花梗芽等不同外植体来诱导原球茎, 其诱导率有所不同; 即使是同一叶片,采自不同部位的诱导率也不同。( 2) 不同培养基和不同激素种类及配比的影响无心磨床自动上料机, 从MS 和KC 培养基上均能诱导出原球茎。由MS 培养基诱导出的原球茎生长迅速, 有利于增殖, 而KC 培养基则有利于芽的分化。供试外植体在无激素空白培养基上均未诱导出原球茎, 在其他培养基上亦存在着诱导差异。最适于叶片培养的搭配是MS+ 6-BA3. 0mg/ L, 适于根尖和茎尖的激素浓度是6-BA0. 5mg/ L。NAA 对蝴蝶兰原球茎的产生无促进作用。热轧卷( 3) 不同浓度的6-BA和NAA 组合对蝴蝶兰原球茎诱导率的影响。原球茎的诱导不仅取决于6-BA 和NAA 的绝对数量, 而且取决于二者的相对比例。在6-BA/ NAA 比值最大的条件下, 诱导率处于最低状态; 在6-BA/ NAA 比值最小的条件下, 诱导率也接近最低。当6-BA/NAA 比值接近10∶1 时诱导率较大。
1.外植体的采集
外植体的采集是依据不同的培养目标而异。通常选取一些生长健壮的当年生枝条、饱满而未萌芽的侧芽作为外植体。其取材季节对于大多数植物而言，都应在生长开始的季节采样，对于利用茎尖培养的植物一般材料越小成活率越低，所以茎尖培养成活的临界大小应为一个茎尖分生组织带1～2个叶原基，约为0.2～0.3mm,茎段长约0.5cm。
锁架 2.外植体的清洗
待外植体采回后，先用流水冲洗半小时左右，使其表面吸附物消除，在转入其他容器中加上洗涤剂进行清洗；在将易感染的各部分剥去、洗净，再切去上部幼叶[4]。
3.消毒与接种
接种是组织培养是否成功的关键因素。接种前必须对接种室、接种人员，接种材料进行彻底的消毒与灭菌。针对外植体的灭菌处理，则先将外植体在75%的酒精中浸10s，再用蒸馏水冲洗三次。再剥取2～3片叶，放入5%次氯酸钠水溶液5min，再用无菌水冲洗3～4次，剥至留下最后一枚叶片，以生长点为中心切去0.3～0.4cm的方块，将切下的外植体接
入准备好的培养瓶中进行培养。
外植体经消毒接入启动培养基或者诱导培养基中诱导出花芽，再转入继代培养基中，则诱导产生簇生的原球茎。
二、继代增殖
经适宜培养后，约4～6周后可在外植体周围形成许多球状物，即原球茎，将其分割接入培养基中，以促使嫩茎长出更多的原球茎，从而分化培养成苗。切取茎尖时要带两个左右叶原基，茎尖大小对增值速率也有影响，同时，继代周期对原球茎增殖也有影响原球茎随继代周期的延长而增加。
（一）试管苗生根壮苗培养
在生根培养基中，转入单株生长或单株丛生的无根小苗培养其生根。生根培养基多采用1/2MS培养基，加入适量生长素。当小植株生出3～5条水平根，每根长2～3cm时为最适宜的出瓶炼苗阶段。通常将其从根状茎基部切下转入壮苗培养基中培养，培养温度提升至28℃，当苗长至12cm高，具有3～4片真叶时就可以移栽。
（二）试管苗的驯化移植
试管苗驯化移植是组培快繁的重要环节[5]。移植前可将培养瓶在自然光下炼苗15～20d，以使其感受温差现象，之后再开瓶移植。
移植时洗去根部的琼脂，置于阴凉处，待苗木阴干后，就可以移植到通气、透水，保湿基质中[6]。移栽基质对成活率的影响很大，采用蛭石、珍珠岩和木屑混合物加入少量腐殖质含量高的土壤作为基质栽培建兰试管苗，成活率高，可以达到98%以上，植物生长茁壮。如果只用蛭石和珍珠岩作为兰花栽培基质，成活率虽高，但植物生长一般。此外移栽后2周内要采取一定的保温措施[11]。
三、影响兰花生根和移栽成活的因素
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