食品安全国家标准
食品中黄曲霉毒素M族的测定
归元胶囊
1 范围
本标准规定了食品中黄曲霉毒素M1和M2（以下简称AFT M1和AFT M2）的测定方法。
本标准第一法为液相谱-质谱联用法，适用于乳、乳制品和特殊膳食用食品中AFT M1和AFT M2的测定。
本标准第二法为免疫亲和层析净化高效液相谱法，适用于乳、乳制品和特殊膳食用食品中AFT M1和AFT M2的测定。
本标准第三法为试纸条法，适用于生鲜乳中AFT M1的测定。
第一法同位素稀释液相谱-串联质谱法
2 原理
试样中的AFT M1和AFT M2用水和乙腈的混合溶液提取，上清液的浓缩液用磷酸盐缓冲液稀释后，经免 疫亲和柱净化，去除脂肪、蛋白质、素及碳水化合物等干扰物质。净化液经液相谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。 3 试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为优级纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 乙腈（CH3CN）：谱纯。
3.1.2 甲醇（CH3OH）：谱纯。
3.1.3 醋酸铵（CH3COONH4）。
3.1.4 氯化钠（NaCl）。
3.1.5 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。
3.1.6 磷酸二氢钾（KH2PO4）。
3.1.7 氯化钾（KCl）。
3.1.8 浓盐酸（HCl）。
3.1.9 氮气（N2）：纯度≥ 99.9 %。
3.1.10 石油醚（C2H2n+2）：沸程为30-60℃
3.2 试剂配制
3.2.1 5 mmol/L醋酸铵水溶液：称取0.39 g醋酸铵，溶于1000 mL水中。
3.2.2 乙腈-水溶液（25+75）：取250 mL乙腈加入750 mL水。
3.2.3 乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL甲醇。
3.2.4 磷酸盐缓冲溶液（以下简称PBS）：称取8.00 g氯化钠，1.20 g磷酸氢二钠（或2.92 g十二水磷酸氢二钠），0.20 g磷酸二氢钾，0.20 g氯化钾，用900 mL水溶解，用盐酸调节pH值至7.4，再加水至1000 mL。
3.3 标准品
3.3.1 AFT M1标准品（C17H12O7，CAS：6795-23-9）：纯度≥ 98 %。
3.3.2 AFT M2标准品（C17H14O7，CAS：6885-57-0）：纯度≥ 98 %。
3.3.3 13C17- AFT M1同位素溶液（C17H14O7）：0.5 µg/mL。
注：在测定AFT M2含量时，可通过13C17- AFT M1同位素内标进行定量。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 标准储备溶液（10 μg/mL）：分别称取AFT M1 和AFT M2 1 mg（准确至0.01 mg），分别用乙腈溶解并定容至100 mL。将溶液转移至棕试剂瓶中，在- 20 ℃下避光密封保存。临用前进行浓度校准（校准方法参见附录A.1）。
3.4.2混合标准储备溶液（1.0 μg/mL）：分别准确吸取10 μg/mLAFT M1 和AFT M2标准贮
备液1.00 mL于同一10 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，得到1.0 μg/mL的混合标准液。
此溶液密封后避光4 ℃保存，三个月有效。
简易过滤器3.4.3 混合标准工作液（100 ng /mL）：准确移取混合标准储备溶液（1.0 μg/mL）1.00mL 至10 mL容量瓶中，乙腈定容。此溶液密封后避光4 ℃下保存，三个月内有效。
3.4.4 50 ng /mL同位素内标工作液1（13C17- AFT M1）：取AFT M1同位素内标（0.5 µg/mL）1 mL, 用乙腈稀释至10 mL。在-20 ℃下保存，供测定液体样品时使用。
3.4.5 5 ng /mL同位素内标工作液2（13C17- AFT M1）：取AFT M1同位素内标（0.5 µg/mL）100 µL，用乙腈稀释至10 mL。在-20 ℃下保存，供测定固体样品时使用。
3.4.6 标准系列工作溶液：
分别准确移取标准工作液（3.4.3）50、100、200、500、800、1000µL至10 mL容量瓶中，加入100 μL 50 ng/mL的同位素内标工作液（3.4.4），用初始流动相定容至刻度，配制AFT M1和AFT M2的浓度均为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 ng /mL的系列标准溶液。
4 仪器和设备
4.1 天平：感量0.01 g、0.001g和0.00001 g。
4.2 水浴锅：温控50 ℃±2 ℃。
4.3 涡旋混合器。
4.4 超声波清洗器。
鸭皂树根4.5 离心机：≥ 6000转/分。
4.6 旋转蒸发仪。
4.7 真空泵。
4.8 氮吹仪。
4.10 圆孔筛：20目。
4.11 50 mL具塞PVC离心管。
4.12 玻璃纤维滤纸：GF/A 110 mm。
4.13 250 mL玻璃分液漏斗。
4.14 带刻度的磨口玻璃试管：10 mL。
4.15 刻度移液管：1.0 mL，
abs0825.0 mL。
4.16 100 mL圆底烧瓶。
ppzhus4.17 50 mL一次性注射器（使用注射器筒部分）。
4.18 一次性微孔滤头：带0.22 μm微孔滤膜。
4.19 免疫亲和柱※：柱容量≥ 100 ng。（柱容量验证方法参见附录A.2)
注※：对于每个批次的亲和柱在使用前需质量验证。
5 分析步骤
使用不同厂商的免疫亲和柱，在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同，应该按照说明书要求进行操作。
5.1 样品提取
5.1.1 液态乳、酸奶
在50 mL离心管中称取10 g经混合均匀的试样（精确到0.01 g），加入100 μL 13C17- AFT M1内标溶液（3.4.4）振荡混匀后静置30min，加入5 mL乙腈，涡旋1 min，继续加入10 mL乙腈，涡旋1 min，再加入10 mL乙腈，涡旋1 min。置于4 ℃、6000 转/min下离心10 min或经玻璃纤维滤纸过滤，将全部上清液或滤液转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发至10 mL以下，用PBS稀释至30 mL。
5.1.2 乳粉、特殊膳食用食品
在50 mL离心管中称取1 g样品（精确到0.001 g），加入100 μL 13C17- AFT M1内标溶液（3.4.5）振荡混匀后静置30min，加入10 mL 50 ℃热水，涡旋混匀。如果乳粉不能完全溶解，将离心管置于50 ℃的水浴中，将乳粉完全溶解后取出。待样液冷却至20 ℃后，加入5 mL乙腈，涡旋1 min，继续加入5 mL乙腈，涡旋1 min，再加入10 mL乙腈，涡旋1 min，置于4 ℃、6000 转/min下离心10 min或经玻璃纤维滤纸过滤，将全部上清液转或滤液移至圆底烧瓶中，
旋转蒸发至10 mL以下，用PBS稀释至30 mL。
5.1.3 奶油
在50 mL离心管（4.21）中称取1 g样品（精确到0.001 g），加入100 μL 13C17- AFT M1内标溶液（3.4.5）振荡混匀后静置30min，加入8 mL石油醚，待奶油溶解，再加9 mL水和11 mL甲醇，振荡30
min，将全部液体移至分液漏斗中。加入0.3 g氯化钠充分摇动溶解，静置分层后，将下层移到圆底烧瓶中，旋转蒸发至10 mL以下，用PBS稀释至30 mL。
5.1.4 奶酪
在50 mL离心管（4.11）中称取1 g已切细、过10目圆孔筛混匀样品（精确到0.001 g），
加100 μL 13C17- AFT M1内标溶液（3.4.5）振荡混匀后静置30min，加入1 mL水和18 mL甲醇，振荡30 min，置于4 ℃、6000 转/min下离心10 min或经玻璃纤维滤纸过滤，将全部上清液或滤液转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发至2 mL以下，用PBS稀释至30 mL。
5.2 净化
5.2.1 免疫亲和柱的准备
将50 mL注射器筒与亲和柱的顶部相连。
5.2.2 净化
免疫亲和柱内的液体放弃后，将上述样液移至50 mL注射器筒中，调节下滴流速为1-3 mL/min。待样
液滴完后，往注射器筒内加入10 mL水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统，在亲和柱下放置10 mL刻度试管，取下50 mL 的注射器筒，加入2×2 mL乙腈（或甲醇）洗脱亲和柱，控制1-3 mL/min下滴速度，收集全部洗脱液至刻度试管中，用真空泵抽干亲和柱。在50 ℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用初始流动相定容至1.0 mL，涡旋30 s溶解残留物，0.22 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。
注※：全自动（在线）或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用.
5.3 液相谱参考条件
液相谱柱：C18柱（柱长100 mm，柱内径2.1 mm，填料粒径1.7 μm），或相当者。
流动相：A相，5 mmol/L醋酸铵水溶液；B相，乙腈-甲醇（50+50）。
梯度洗脱：参见附录A中的A.3。
流速：0.3 mL/min。
谱柱柱温：40 ℃。
进样体积：10 µL。
5.4 质谱参考条件
检测方式：多离子反应监测（MRM）。
离子源控制条件：参见附录A.4。
离子选择参数见表1。
液相谱-质谱图和子离子扫描图见附录A.5。
表1 质谱条件参数
5.5 定性测定
试样中目标化合物谱峰的保留时间与相应标准谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5 ％之内。
待测化合物的定性离子的重构离子谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥ 3），定量离子的重构离子谱峰的信噪比应大于等于10（S/N≥ 10）。
每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。
表2 定性时相对离子丰度的最大允许偏差
各检测目标化合物以保留时间和两对离子（特征离子对/定量离子对）所对应的LC-MS/MS谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于20 %），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子对应LC-MS/MS谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致。
煮面炉
5.6 定量测定
在 5.3、5.4项液相谱-三重四极杆质谱联用分析条件下，用系列浓度标准工作溶液
（3.4.6）分别进样，以目标物质和内标的系列浓度为横坐标，目标物质和内标的峰面积为纵
坐标，进行线性回归，建立线性回归方程，其线性相关系数应大于0.99。取5.2项下处理得
到的待测溶液进样，内标法计算待测液中目标物质的质量浓度，按6项计算样品中待测物的
含量。 5.7 空白试验
不称取试样，按5.1和5.2的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。 5.8 标准曲线绘制
将标准系列溶液（3.4.6）由低到高浓度依次进样检测，以相对峰面积-浓度作图，得到相应的标准曲线回归方程。
6 分析结果的表述
按式（1）计算AFT M 1或AFT M 2的残留量。
m
f V A X 1⨯
⨯⨯=·····················（1） 式中：
X ——试样中AFT M 1或AFT M 2的含量，单位为微克每千克，µg/kg ；
A ——根据试样中AFT M 1或AFT M 2的谱峰与对应内标谱峰的峰面积关系，经计算所得的浓度，单位为纳克每毫升，ng/mL ；
V ——样品洗脱液的最终定容体积，单位毫升，mL ； f ——样液稀释因子；
m ——试样的称样量，单位克，g ；
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示。 计算结果保留三位有效数字。 7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 8 其他
本方法AFT M 1检出限为0.017 µg/kg ，定量限为0.05 µg/kg ；AFT M 2检出限为0.017 µg/kg ，定量限为0.05 µg/kg 。
第二法 免疫亲和层析净化高效液相谱法
9 原理
试样中的AFT M 1和AFT M 2用水和乙腈的混合溶液提取，上清液的浓缩液用磷酸盐缓
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