龚怡1，钱平2，余坚勇2，卢蓉蓉1
5 10 15 20 25 30 35 40 45
2. 中国人民解放军总后勤部军需装备研究所，北京100010）
摘要：【目的】为保证超高压对耐压革兰氏阳性细菌的杀菌强度，期望可以通过压力与中温的协同杀菌达到 6 个对数值的商业无菌要求。本文从分子水平揭示二者协同作用下的细胞致死机理，为超高压杀菌在食品中的应用奠定理论基础。【方法】采用pH 7.0 的缓冲液体系，100-500 MPa 的超高压处理15min，温度条件为40、50、60°C。通过荧光染法和紫外吸收法检测细胞膜通透性，傅里叶转换红外光谱法结合数学拟合方法检测细菌胞内蛋白二级结构的变化。【结果】结果发现：中性条件下，超高压与中温协同杀菌作用可达到 3 个对数值，协同作用使细菌细胞膜通透性增加了10%-89%；同时在温度较高时细胞物质交换速度加快，膜内物质外流和膜外物质渗入的速度加速，导致核酸泄漏量的增多。蛋白质二级结构发生变化，α-螺旋含量降低，无规卷曲含量增大，导致蛋白变性。【结论】结果证实，超高压与中温协同是有效的杀菌手段，温度超过40°C 时，不高于500 MPa 的压力条件即能使细菌获得6 个对数值的致死率。 实物展台
关键词：超高压；枯草芽孢杆菌；中温协同杀菌；细胞膜通透性；蛋白质二级结构
中图分类号：TS205.9
过线槽Synergistic inactivation of Bacillus subtilis by high
hydrostatic pressure and mild heat
GONG Yi1, QIAN Ping2, YU Jianyong2, LU Rongrong1
(1. School of Food Science and Technology,Jiangnan University, JiangSu WuXi 214122;
2. The Quartermaster Research Institute of the General Logistic Department, Beijing 100010) Abstract: [Objective] High hydrostatic pressure (HHP) could be synergized with mild heat to kill Gram positive bacterial which was pressure resistant to achieve commercial sterilization. The mechanis m of synergistic inactivation by HHP treatment and mild heat was investigated at molecular level, which forms the theoretical base on the application of HHP. [Methods]Bacillus subtilis strain was pressure treated at 100-500 MPa for 15 min at 40、50、60°C in PBS (pH 7.0). Membrane permeability was studied by fluorescent dye and Ultraviolet absorption methods. Fourier transform infrared spectroscopy combined with mathematical fitting methods was used to detect the secondary structur
e of bacterial intracellular protein. [Results]The results showed that, under neutral conditions, the combination of mild heat and HHP exhibited a synergistic effect over 3 log10 on the inactivation of Bacillus subtilis, and increased the membrane permeability by
10%-89%. At higher temperatures, the amount of nucleic acid leakage was higher. The secondary struc ture of cell protein was changed by the synergistic effect. HHP decreased the α-helix while increased the random coil content, which resulted in protein denaturation. [Conclusion] The
results confirmed that mild heat is an important factor in high pressure inactivation of Bacillus subtilis. While the temperature exceeds 40°C, 6 log10 counts reduction could be achieved under
the pressure which was lower than 500MPa.
Keywords: high hydrostatic pressure; mild heat; synergistic inactivation; membrane permeability; secondary structure
0引言
超高压杀菌是将食品原料置于100-1000 MPa 的静高压下加工适当的时间，引起食品成分非共价键的破坏[1]，使食品中的酶、蛋白质、淀粉等生物高分子物质失活、变性或糊化，
作者简介：龚怡，（1989-），女，硕士研究生，食品生物技术。
通信联系人：卢蓉蓉，（1970-），女，教授，食品生物技术。*****************
，几乎不会引起营养物质如维生素的流失[1,3]，有效克服传统热加工法处理食品时带来的
并杀死食品中的细菌等微生物，从而达到食品灭菌、保藏和加工的目的。
超高压杀菌是一种冷杀菌，能更好地保持食品的自然风味，对质构和颜的破坏较小
[2,3]
50
55
60
65
70
75
80
弊端。同时超高压杀菌存在着一些不足之处，超高压处理对革兰氏阳性菌及其芽孢致死效果 较差。前期研究结果显示，常温下施加 500 MPa 的处理压力仍不能使中性食品中的耐压菌 达到商业无菌要求，即菌落下降数高于 6 个对数值[4]。于是一系列的栅栏技术被开发应用于 超高压杀菌领域，以此来增强超高压的致死效果。其中温度是影响超高压灭菌的一个重要因 素，主动地采取温度控制手段协同超高压提高灭菌效果，是目前高压食品加工研究的重要方
向。
超高压与温度协同对不同介质中的细菌营养体细胞的致死效果已有广泛的研究[5,6,7]，对 不同的微生物，施加大小不同的温度和压力，其灭菌效果是不同的，这需要通过实验和经验 摸索灭菌参数。微生物对温度敏感，低温或高温下对食品进行高压处理具有更好的杀菌效果， 而室温施压可能会影响杀菌效果。
超高压与中温产生协同杀菌作用的机理一直是一个理论空白。前期研究表明，超高压主 要影响细菌的细胞膜渗透性、细胞膜脂质的流动性[8,9]，导致细菌蛋白变性、酶失活、核酸 变性以及核糖体的构造
改变[10]。然而，二者的共同作用对细菌的生理指标产生的影响，目 前尚不确定，亟需深入研究二者协同杀菌的机理，为超高压与中温在食品体系中的应用提供 理论依据。
本文以中性食品中的耐压菌枯草芽孢杆菌作为研究对象，通过研究超高压和中温对枯草 芽孢杆菌细胞膜通透性、胞内核酸物质泄漏、蛋白质二级结构等指标的影响，初步探讨超高 压与中温协同杀菌的机理，为协同手段在超高压食品中的应用提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ），江南大学食品生物技术研究中心提供。
1.2 培养基
营养肉汤培养基（蛋白胨 10 g/L ，牛肉膏 3 g/L ，氯化钠 5 g/L ，pH 7.2-7.4）；营养琼脂 培养基（蛋白胨 10 g/L ，牛肉膏 3 g/L ，氯化钠 5 g/L ，琼脂粉 15 g/L ，pH7.2-7.4）
1.3 荧光染料碘化丙啶的配制
碘化丙啶（Propidium iodide ，PI ）购自 Sigma-Aldrich 公司，使用无菌水溶解 PI ，至浓 度为 300 μmol/L ，保存至 4 °C 中备用。
1.4 仪器与设备
FPG5740 超高压设备，英国 STANSTED FLUID POW ER 公司；GPR-9160 型 隔水式恒 温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；DKY-11 恒温调速回转式摇床，上海杜科自动化设 备有限公司；MLS-3750 高压灭菌锅，日本三洋（SA NYO ）公司；SW-CJ-ICV 超净工作台， 苏州安泰空气技术有限公司；1610 型冷冻离心机，德国 Hettich 公司；F-7000 荧光分光光度 计，日本 HITA CHI 公司；UV-2450 紫外可见分光光度计，日本 SHIMADZU 公司；NICOLET NEXUS 470 傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared ，FT-IR ），美国 Thermo Electron
致死率 = lg
公司。
85
1.5 实验方法
1.5.1
细菌菌悬液的制备
枯草芽孢杆菌菌悬液的制备：将活化好的菌株接种到营养肉汤培养基中 37°C 培养 18 h ， 6000 r/min 离心 15 min ，弃去上清液，收集沉淀的菌体，重悬于磷酸缓冲溶液（0.1 mol/L ，
127刀网
pH 7.0）中，4°C 保存备用。
90
1.5.2
细菌菌悬液的超高压处理
用磷酸缓冲溶液(0.1 mol/L ，pH 7.0)将菌悬液浓度调整至 108-109 CFU/mL ，然后在无菌 操作条件下将其分装于 Corning 管中，不留顶隙，拧紧封口。将样品置于超高压容器，压力 选取 100-500 MPa ，温度条件为 40、50、60°C ，保压时间 15 min ，每个样品重复 3 次。
1.5.3
微生物计数
95
超高压处理之后的菌悬液立即进行菌落计数，以生理盐水作为梯度稀释液，对样品进行 梯度稀释计数，37°C 培养 48 h ，进行菌落计数。
No
N
1.5.4
细菌荧光染
参考 Moussa M 的方法[11]。将菌悬液浓度调整至 108-109 CFU/mL ，加入荧光染剂 PI
100
105 至终染浓度为 2.9 μmol/L 。将荧光染的样品放入超高压装置进行超高压处理。处理过的 样品放入 37°C 暗处孵化 10 min ，样品使用 PBS 离心重悬洗涤两次。处理完成的样品使用荧 光分光光度计进行检测，激发光波长 495 nm ，发射光波长 615 nm ，狭缝宽度 10 nm 。检测 指标为荧光强度。
使用热处理(90°C,10 min)过的菌悬液的荧光强度作为阳性对照，设定其荧光强度为
100℅，其它样品的细胞膜通透率在 0-100%之间。
1.5.5
细菌上清液的紫外检测
将压力处理过的样品使用 10,000×g 离心 10 min ，取上清液 1 mL ，置于石英比皿中，
使用紫外分光光度计进行检测，检测波长 260 nm [12]。
110
1.5.6
细菌全细胞傅里叶变换红外（FTIR ）光谱检测
采用 Santivarangkna C [13]的样品处理方法，并做适当改进。将处理前的样品和处理后的 样品悬浮于 PBS 中，样品离心分离（10,000 g ，5 min ），使用无菌水洗涤二次，除去 PBS 的杂质影响；最后重悬浮于无菌水中。取 200 μL 样品平铺于 ZnSe 晶体片上，在常温烘干水 分，除去水峰的影响。烘干的样品直接使用 FT-IR 光谱检测仪进行检测。检测方法为衰减全
115
人脸识别门
反射法（Attenuated Total Reflection, ATR ），操作参数如下：检测波数范围为 4000-500 cm -1， 分辨率：4 cm -1，扫描次数：64 次。红外光谱采用 OMNIC V6.2 和 Peakfit V4.12 软件进行分 析。
1.6 数据处理方法
文中数据为三次平行测定值的平均值。显著性分析采用 SPSS 16.0 （美国 SPSS 公司）
120 125
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135
140
145
的单因素方差分析（One-Way ANOVA ，Tukey ）在显著性水平 P =0.05 下进行数据分析与统 计。a ，b ，c ，d 或 A ，B ，C ，D 不同字母代表差异显著，P <0.05。
2 结果和讨论
2.1 超高压-中温协同作用对细菌致死率的影响
超高压对微生物的作用效果取决于处理条件的不同，包括压力、温度和保压时间等。微
生物对温度很敏感，低温或高温下加压对微生物影响加剧。已有研究观察到，细菌的营养体 细胞在温度范围 20-30°C 之间，对超高压表现出最大的耐受性[14]。本研究旨在通过施加高于 室温的温度来达到革兰氏阳性细菌在常温受压时难以获得的 6 个对数值的致死率，故实验采 取 40、50、60°C 三个不同温度条件。枯草芽孢杆菌经不同超高压-温度条件作用，处理前后 的样品进行菌落计数，得到各条件下的致死率见图 1。
图 1 超高压处理对枯草芽孢杆菌致死曲线 Fig. 1. HHP sterilization curve of B. subtilis strain
由图 1 可以看出，随着压力的升高，枯草芽孢杆菌的致死率大幅提高，说明压力对于其
营养体的致死效果是明显的。在常压下，40°C 、50°C 、60°C 这三个中温条件对于枯草芽孢 杆菌的致死几乎没有贡献。而当中温与超高压同时施加于菌悬液时，在相同的高压条件下， 温度越高，致死率明显提高，说明温度与超高压之间产生了协同作用。这种协同作用在 300 MPa 时尤其显著，温度从 40°C 升高到 50°C 时，能获得约 1.8 个对数值的协同效果。若温度 继续升高至 60°C ，则能获得约 3 个对数值的协同效果。40°C 时，压力条件 500 MPa 也没有
使得致死率达到 6 个对数值，而当温度至 60°C 时，只需 300 MPa 的压力强度就能达到商业 灭菌的标准，即菌落下降数高于 6 个对数值。
当微生物处于较高温度时，细胞膜的磷脂双层结构更具有流动性，原生质膜更脆弱，而 且在温度较高时物质交换速度加快，膜内物质外流和膜外物质渗入的速度加速，从而导致微 生物对超高压更敏感，超高压杀菌效果增加。可见中温能够降低超高压杀菌过程所需的压力，
对于超高压技术的推广，具有积极作用。
0.254±0.04 0.419±0.02 0.491±0.01 0.748±0.04 0.408±0.03 0.561±0.03 0.587±0.01 0.748±0.04
2.2超高压-中温协同作用对细菌内核酸物质流出的影响
细菌细胞内核酸物质的泄漏情况可作为考察细胞膜破损情况的指标之一。核酸最大吸收值在260 nm 处，在此波长范围内吸光值与核酸的浓度成正比，即吸光值越大，泄漏的核酸物质越多，细胞膜损坏越严重。超高压-中温处理前后的枯草芽孢杆菌菌悬液上清液在260nm 150 处的吸光度值见表1。
表1 枯草芽孢杆菌细胞紫外吸收物质的泄露
Table 1. Relative amount of UV-absorbing substances leaking of B. subtilis strain
温度40°C 50°C 60°C
常压对照组超高压处理组热处理对照组0.1MPa
100MPa
200MPa
300MPa
400MPa
500MPa
95°C,10min
0.119±0.03a,A
0.242±0.03a,A
a,b,A
b,c,A
acck0.464±0.02c,A
qsc6270
c,A
d
0.106±0.03a,A
0.290±0.01b,A
b,c,A,B
c,d,B
0.575±0.01c,d,B
d,B
e
0.179±0.01a,A
0.323±0.02b,A
0.485±0.01c,B
0.578±0.02c,d,B
0.671±0.02d,e,B
0.703±0.01e,C
0.748±0.04e
a，b，c，d不同字母代表同列的数据显著差异，P<0.05；
155 160 165
A，B，C不同字母代表同行的数据的显著差异，P<0.05。
由表 1 可见，处理条件越强烈导致越多的核酸物质的泄漏，即表现为吸光度值越高。协同40°C 处理条件下，压力达到300 MPa 时，核酸物质的泄漏量与低压力强度比较，开始显示出具有显著性差异（P<0.05），表明此时细菌细胞膜完整性受到损坏。温度越高，这种显著性差异在更低的压力条件下即能观察到，可能是由于在温度较高时物质交换速度加快，膜内物质外流和膜外物质渗入的速度加速，使得微生物对超高压处理更敏感。
2.3超高压-中温协同作用对细胞膜通透性的影响
PI 是大分子的核酸染料，几乎无法穿过完整的细胞膜，只有在细胞膜通透性变大的时
候才能穿过，并与核酸结合发出荧光。通过对超高压与温度协同作用前后细菌的荧光强度的检测，可以反映细菌细胞膜通透率的变化情况。不同超高压-中温条件处理后的枯草芽孢杆
菌菌悬液的细胞膜通透性见图2。
图 2 枯草芽孢杆菌细胞膜通透性变化
Fig. 2. The change of membrane permeabilization of B. subtilis strain
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