一种乳杆菌组合物、益生菌制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一种乳杆菌组合物、益生菌制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

2.阴道炎和尿道炎是困扰众多女性的两类疾病。目前，阴道炎和尿路感染的药物常采用抗生素，其缺点是在杀死致病菌的同时也杀灭有益菌，破坏女性生殖系统和泌尿系统的微生态平衡，并且会使致病菌产生耐药性。而益生菌疗法是目前比较新型的阴道炎的手段。
3.(1)在阴道炎方面
4.复合益生菌的现有技术如：
①
cn107115364a公开一种复合益生菌，由十种以上的益生菌和两种以上益生元组成，能够对阴道炎有良好的抑制效果，其强调根据“君臣配伍”，活菌数增强，起效时间缩短，但是，添加十多种的菌粉的生产成本大大增加，且极大增加了对生产环境的严格控制程度，无疑也增加了转化生产中的难度，对于产业化生产来说，不是一种经济理想的益生菌组合物产品生产方法。
②
cn 109123295 a公开了“一种益生菌固体饮料及其制备方法”，其公开的固体饮料由如下重量份的原料组成：菊粉25-30份、蔓越莓提取物5-10份和益生菌1-5份，聚葡萄糖35-40份，和水果粉15-20 份；其中，每份所述益生菌由如下重量份的菌种组成：乳双歧杆菌15-20份、嗜酸乳杆菌13-18份、鼠李糖乳杆菌13-18份、干酪乳杆菌13-18份、罗伊氏乳杆菌11-16份、植物乳杆菌11-16份、长双歧杆菌1-6份。通过饮用上述固体饮料，能够调节肠胃，缓解便秘、腹泻和便秘，但是由于专利文件中缺少实验结果，难以知晓其对妇科病是否具有作用，效果如何。
5.可见，目前采用的上述益生菌疗法方案，多使用包含多种益生菌的复杂配方，其不仅生产成本高，且难以同时满足多种不同微生物对环境条件(温度湿度及有氧无氧)的不同要求，为了尽可能满足各种微生物的环境需求，极大地提高了生产环境的严格控制程度，加大了生产难度，同时，也难以使所有微生物充分发挥其最大作用。
6.此外，上述现有复杂复合益生菌配方中，并未考虑所有菌株在阴道的黏附定殖能力。而研究中发现，同种属的益生菌在不同环境中的黏附定殖都不同，而黏附是益生菌在所述环境中起作用的首要条件，若在阴道内不能够很好的黏附定殖，则其对阴道致病菌的抑制效果及其炎症的改善效果不能准确被评估。
7.(2)在尿道炎方面
8.尿路感染(uti)不成比例地影响女性，大约50％的女性在其一生中经历uti。尿路感染可由多种细菌和真菌引起，但最常见的病原体是尿路致病性大肠杆菌(upec)，其次是肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和奇异变形杆菌。尿路感染(uti)容易复发，成为延长的感染周期，被称为复发性uti(ruti)，这会显着降低生活质量。上行至肾脏的尿路感染可导致肾盂肾炎和危及生命的尿毒症。一些ruti病例可持续数十年，当抗生素无效时，最终可能需要切除膀胱。
9.目前uti和ruti的主要依靠抗生素来消除病原体，但抗生素的副作用大，也有研究用中药材类成分来作为泌尿感染的方法，如， cn113730539a“一种泌尿系统疾病的中药组合物及其制备方法”的专利公布了一种中药组合物，可有效泌尿系统疾病，但是，中药成分的副作用无从得知。其制备工艺流程较为复杂，涉及多次乙醇回流提取、减压浓缩、干燥等步骤，生产条件严苛，从转化生产的易得性、产品的稳定性及安全性、成本层面，都是存在一定缺点的。
10.由此可见，现有技术的益生菌产品的配方复杂，成本高且严格控制程度高；此外，现有产品中能同时改善阴道炎和尿路感染的较少，因此，现有技术有待进一步改进。

技术实现要素：

11.针对上述问题，本发明提供了一种乳杆菌组合物、益生菌制剂及其制备方法和应用，该乳杆菌组合物中，通过卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230 这两种乳杆菌的协同配合，对阴道炎和尿路感染均起到较好的改善效果。
12.基于考虑到，阴道黏膜内定殖的阴道原籍菌应是对于阴道中致病菌的抑制及改善女性阴道炎的最理想的益生菌，因为其本身来源为阴道中，故其适合于阴道环境，能够在阴道中黏附定殖生长，并且具有抑制阴道环境中病原菌繁殖的作用，对生殖系统的微生态平衡起到关键作用。
13.因此，申请人从女性阴道分泌物中进行益生菌的分离和筛选，最终分离得到了2株卷曲乳杆菌(卷曲乳杆菌dh200，其保藏编号为：cgmcc no.16193；卷曲乳杆菌dh201，其保藏编号为cgmcc no.13137)、1株植物乳杆菌 dh230(其保藏编号为cgmcc no.16194)以及1株植物乳杆菌(植物乳杆菌dh118，其保藏编号为：cgmcc no.12727)。通过细胞黏附实验验证了分离的上述菌株都具有良好的细胞粘附效果，并通过小鼠实验验证了所分离的卷曲乳杆菌及植物乳杆菌不论对细菌性阴道炎还是真菌性阴道炎均有较好的改善效果。
14.本技术具体对以下方案进行保护：
15.第一方面，本发明提供一种乳杆菌组合物，其包括保藏号为cgmcc no. 16193的卷曲乳杆菌dh200和保藏号为cgmcc no.16194的植物乳杆菌 dh230。
16.通过实验发现，卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230的单株对阴道炎的改善效果优于其他卷曲乳杆菌和植物乳杆菌，并且，这两个菌株的组合物对阴道炎的改善效果最佳，其不仅优于单株的效果，甚至优于其他多菌株的联合效果，具有较好的应用前景。因此，本技术对这两株菌的组合物方案进行保护。
17.本技术中涉及的多株菌株的菌种保藏信息如下：
18.卷曲乳杆菌(lactobacillus crispatus)dh200是从妇女阴道分泌物中分离得来，已于2018年8月1日保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.16193。
19.植物乳杆菌dh230(lactobacillus plantarum)是从妇女阴道分泌物中分离得来，已于2018年8月1日保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.16194。
20.卷曲乳杆菌dh201分离自女性阴道分泌物，于2016年10月21日保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.13137。
21.植物乳杆菌dh118分离自人体粪便，于2016年6月30日保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为 cgmcc no.12727。
22.优选地，卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230的菌体数量之比为： 1/4～3/2。
23.第二方面，本发明提供一种益生菌制剂，其包前述的乳杆菌组合物。
24.可将前述的卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230与一定载体和助剂进行组合，制成具有一定剂型的益生菌制剂。在上述基础上，所述益生菌制剂中还包括助剂，如羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁等。
25.通过实验发现：卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230这两株菌制成的益生菌制剂，不仅能够对阴道炎有改善效果，而且对尿路感染也有明显的改善效果。
26.可选地，所述益生菌制剂的剂型为粉剂、液体剂、片剂、胶囊剂、软膏剂和栓剂。后续实施例中，本发明的益生菌制剂的剂型以粉剂为例进行说明，但其剂型不限于此。
27.优选地，所述益生菌制剂包括以下各成分：卷曲乳杆菌dh200、植物乳杆菌dh230、木葡聚糖、乳糖和二氧化硅。
28.其中，卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230作为抑菌活性成分发挥作用。二氧化硅的作用是：作为助流剂发挥作用。乳糖的作用是：作为益生元对菌株发挥保护作用。
29.木葡聚糖是一种具有保护屏障特性的天然植物聚合物，也称为“粘膜保护剂”，目前已公开在胃肠道疾病中的作用，但还未见关于其在阴道炎及尿道炎方面的应用。本技术的益生菌制剂中引入木葡聚糖，不仅作为粘稠剂，提高益生菌制剂在阴道或尿道的黏膜粘附性，使其更好的发挥作用，提高缓释效果。
30.通过动物实验证实，上述益生菌制剂对阴道黏膜无刺激性，非常安全，且对阴道炎症及尿路感染症状均有较理想的改善效果。
31.优选地，所述益生菌制剂包括以下质量份数的各成分：卷曲乳杆菌dh200 菌粉1～5份、植物乳杆菌dh230菌粉1～5份、二氧化硅1～3份、乳糖5～10 份和木葡聚糖1～5份。上述优选配方的益生菌制剂对女性泌尿系统和生殖系统感染具有较好的改善效果。实施例中，上述制剂以粉剂为示例。在此配方基础上，可将益生菌制剂改进为其他不同的剂型。
32.第三方面，本发明还提供上述益生菌制剂的制备方法，其包括以下步骤：
33.称取相应质量分数的卷曲乳杆菌dh200菌粉、植物乳杆菌dh230菌粉、木葡聚糖、乳糖、二氧化硅进行混料，再进行剂型加工，得到特定剂型的益生菌制剂。
34.例如，将上述混料通过对应的剂型加工工艺，制备成益生菌粉剂、片剂或胶囊剂等。
35.第四方面，本发明还提供上述乳杆菌组合物在制备抑制泌尿系统致病菌和女性生殖系统致病菌的药物中的应用。
36.具体地，所述应用包括在制备阴道致病菌和/或尿路致病菌的药物中的应用。
37.可选地，所述阴道致病菌包括：阴道致病性大肠杆菌、金黄葡萄球菌、白念珠菌等。所述尿道致病菌包括：尿路致病性大肠杆菌(upec)，肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和奇异
变形杆菌等。
38.第五方面，本发明还提供上述乳杆菌组合物在制备预防和/或泌尿生殖系统感染的药物中的应用。
39.本发明具有以下有益效果：
40.1、本发明中，申请人筛选到卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230这两种细胞粘附性好且对阴道炎具有良好改善效果的乳杆菌，并发现这两株乳杆菌之间的协同配合作用好，这两株的组合物不仅细胞粘附效果好，对阴道炎的改善效果远优于单株乳杆菌及多株乳杆菌的实验组，最大程度简化配方的同时最大程度的提高了其对阴道炎的改善效果。进一步的，将这两株益生菌与木葡聚糖、乳糖等辅料进行组合制备得到的组合物，对阴道炎及尿路感染均表现出有良好的防治效果。
41.2、所述益生菌制剂的配方简单，由于使用乳杆菌少，生产条件易满足和控制，生产成本低，使用安全，对阴道炎症及尿路感染两种症状均良好的改善效果。
附图说明
42.图1a为卷曲乳杆菌dh200的电镜照片；图1b为植物乳杆菌dh230的的电镜照片；
43.图2a为实施例3的健康组阴道组织；图2b为实施例3中的模型组阴道组织；
44.图3a为实施例3中阴道组织好转的电镜照片；图3b为实施例3中阴道组织痊愈的电镜照片；
45.图4为阴道组织中促炎细胞因子tnf-α变化图；
46.图5为阴道组织中促炎细胞因子il-1β的变化图；
47.图6为阴道组织中促炎细胞因子il-6的变化图；
48.图7为尿路感染及干预实验的存活小鼠精神状态分布结果；
49.图8为尿路感染及干预实验的小鼠尿液中致病性大肠杆菌的细菌数变化；
50.图9a为实施例8中uti尿液细胞因mcp-1的变化；
51.图9b为实施例8中uti尿液细胞因il-1β的变化；
52.图10a为实施例9的各实验组的尿液中致病性大肠杆菌细菌滴度结果；
53.图10b为阴道组织中促炎细胞因子tnf-α检测结果；
54.图10c为阴道组织中促炎细胞因子il-1β的检测结果；
具体实施方式
55.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
56.实施例1：菌株的分离和鉴定
57.(1)卷曲乳杆菌
58.采取女性阴道分泌物等样品，然后将样品置于灭菌瓶内，从中取2克样品加入18ml灭菌的稀释液中，充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1
、10-2
、 10-3
、10-4
，10-5
，10-6
，10-7
梯度
稀释，取10-5
，10-6
，10-7
三个稀释梯度，涂布于mrs固体培养基上，置于培养箱，37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落接种到mrs液体培养基中，37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1
×
10
10
cfu/g以上，然后进行菌种鉴定。
59.对菌株展开生理生化特征鉴定。通过对分离获得的菌株分别进行接触酶实验及凝乳实验，去除接触酶阳性及无凝乳现象之菌株，排除非目的菌株后，对其余的菌株继续通过biolog及api 50ch(梅里埃碳水化合物鉴定试剂盒) 进行生理生化特征鉴定，最后通过提取dna测序，进一步明确菌株的分类地位。最后，经中国科学院微生物检定所鉴定其为卷曲乳杆菌dh200，保藏编号为：cgmcc no.16193。其电镜图见图1a。
60.(2)植物乳杆菌
61.采取女性阴道分泌物等样品，然后将样品置于灭菌瓶内，从中取2克样品加入18ml灭菌的稀释液中，充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1
、10-2
、 10-3
、10-4
，10-5
，10-6
，10-7
梯度稀释，取10-5
，10-6
，10-7
三个稀释梯度，涂布于mrs固体培养基上，置于培养箱，37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落接种到mrs液体培养基中，37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1
×
10
10
cfu/g以上，然后进行菌种鉴定。
62.经生理生化和16s rrna序列对比分析鉴定为植物乳杆菌，为植物乳杆菌 dh230，保藏编号cgmcc no.16194。该菌的电镜图见图1b。
63.实施例2：细胞粘附效果实验
64.2.1实验方法
65.2.1.1hela细胞的复苏
66.从液氮中取出冻存hela细胞的冻存管，迅速放入盛有37℃水浴箱中，然后在细胞操作室中将冻存的细胞接种到盛有37℃预温的含20％小牛血清的 rpm-1640细胞培养液中，置于37℃含5％co2培养箱中培养。每天更换细胞培养液一次。
67.2.1.2转接hela细胞
68.待hela细胞长满细胞培养瓶后，倒掉培养液并用无菌pbs洗涤，用1ml 0.25％胰蛋白酶消化2min，使细胞脱离培养瓶，低速离心收集细胞，并用5ml 细胞培养液吹打均匀。取六孔细胞培养扳，每孔加入一个无菌盖玻片以及l ml 上述细胞悬浮液。将细胞培养板置于37℃，5％co2培养箱中培养。
69.2.1.3粘附用细胞的前处理
70.待细胞培养板中盖玻片上的hela细胞长满80％时，准备开展粘附实验，用pbs洗涤细胞三次。
71.2.1.4粘附用乳酸杆菌的制备
72.将筛选获得的有抑菌能力的乳酸菌接种于mrs液体培养基，37℃好氧培养18-24h后收集菌体，重悬于pbs中并用pbs洗涤三遍(8000rpm，离心 10min)。用细胞培养液悬浮菌体并调整细菌浓度为5
×
108/ml。
73.2.1.5粘附
74.在细胞培养板中按每孔加入l ml乳酸杆菌悬浮液。轻柔晃动细胞培养板，使乳酸杆菌分散均匀。将细胞培养板置于37℃，5％co2培养箱中培养2.5h。
75.2.1.6粘附效果观察
76.从细胞培养板中取出盖玻片，用冷pbs洗涤三遍，置于室温下自然干燥，甲醇固定10min，革兰氏染，油镜下观察细菌在hela细胞上的黏附情况。随机计数20个细胞粘附的细菌数，计算平均数。
77.2.2实验结果及分析
78.表1细胞粘附结果
[0079] 菌株粘附数量(个)1卷曲乳杆菌dh2004392卷曲乳杆菌dh2013553植物乳杆菌dh2304264植物乳杆菌dh118294
[0080]
从表1的结果可知，卷曲乳杆菌dh200、卷曲乳杆菌dh201、植物乳杆菌dh230和植物乳杆菌dh118这四株的细胞粘附能力都较好，其中，卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230的细胞黏附性最好，这两株菌的细胞粘附细菌数都高于400个。
[0081]
实施例3：小鼠阴道炎模型构建及干预效果验证
[0082]
3.1细菌性阴道炎小鼠模型构建
[0083]
取114只spf级别小鼠，6-8周龄，体重22
±
2g，随机分为用小鼠阴道内接种白念珠菌悬液的方法建立白念珠菌阴道炎小鼠模型，即小鼠隔日皮下注射苯甲酸雌二醇注射液(0.1ml
·
d-1
)，使小鼠处于假发情状态，6d后用加样器将密度为每毫升1
×
107个孢子的菌悬液注入小鼠阴道内(20μl)，每只小鼠接种后倒置5min。于接种第5天进行阴道分泌物镜检，若有大量脱落细胞和真菌孢子或菌丝生成，即造模成功。
[0084]
3.2菌株干预
[0085]
3.2.1菌悬液的准备
[0086]
将实验筛选出的卷曲乳杆菌dh200和dh201、植物乳杆菌菌株dh230 和dh118分别接种于mrs液体培养基中，37℃培养18-24h后收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次后将菌液浓度调至109cfu/ml备用。
[0087]
3.2.2干预
[0088]
3.2.2.1分组及
[0089]
将造模成功的114只小鼠分13组：组(12组，即a～l组)、模型组 (1组)，每组8只；另取8只健康小鼠作为正常对照组。
[0090]
给予各组中造模成功的小鼠阴道内分别注入20μl的菌液，菌液浓度为109cfu/ml，而对模型组和正常对照组的小鼠阴道注入相同量的生理盐水，每天1次，连续2周，各组注入情况具体见下表2：
[0091]
表2阴道鼠模型构建及
[0092][0093][0094]
3.2.2.2检测方法
[0095]
停止后第4天，对各组的小鼠进行下述检测。
[0096]
(1)阴道清洁度分级
[0097]
评分标准：5分：死亡；4分：外阴、阴道有明显红肿，出现溃疡，并伴分泌物增多；3分：外阴、阴道有明显红肿伴分泌物增多；2分：外阴、阴道有轻微红肿，分泌物不增多；1分：外阴、阴道均无红肿和分泌物增多。
[0098]
将后阴道清洁度为1分的视为痊愈，2分的视为好转。
[0099]
治愈率(％)＝痊愈的动物只数/各组的动物总数
×
100％
[0100]
有效率(％)＝好转+治愈的动物只数/各组的动物总数
×
100％。
[0101]
(2)阴道分泌物致病菌载量及评分方法
[0102]
用50μl无菌生理盐水灌洗阴道8-10次，置灌洗液于清洁无菌管中。加一定量的无菌生理盐水充分震荡混均后，依次进行梯度稀释，选择适宜的梯度取20μl分别滴种于大肠杆菌选择培养基及金黄葡萄球菌选择培养基，每个稀释度滴3滴。37℃培养48小时后，选择菌落中适中的稀释度，计数同一稀释度平均菌落数x，计算出每ml阴道分泌物中大肠杆菌及金黄葡萄球菌的活菌数。
[0103]
cfu/ml标本＝x
×
1/0.020
×
稀释度
×
1/标本体积
[0104]
将致病菌载量按照下列方法评分：菌落数在0-10个/ml的为1分，11-100 个/ml的
为2分，101-1000个/ml的为3分，1001个/ml以上的为4分，并将 1分的确定为痊愈，2分的确定为好转，3分和4分的为无效，同样计算治愈率和有效率。
[0105]
(3)病理切片检查
[0106]
疗程结束后，将所有动物处死，取其阴道组织用10％的中性甲醛固定，石蜡包埋、切片、he染进行病理学检查。观察炎性细胞浸润和阴道黏膜完整情况。
[0107]
3.2.2.3数据处理
[0108]
所有数据采用spss10.0软件进行统计学处理分析，数据均以平均数
±
标准差表示，组间比较采用方差分析，以p﹤0.05为有显著性意义。
[0109]
3.3实验结果及分析
[0110]
(1)阴道清洁度
[0111]
阴道清洁度检测结果具体见表3，从中可看出：
[0112]
①
单菌株中对阴道清洁度的治愈率和有效率最好的是卷曲乳杆菌dh200 和植物乳杆菌dh230；
[0113]
②
卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230两菌株联用对阴道清洁度的治愈率和有效率最高，其有效率达到100％，治愈率高达83.3％，明显高于单株以及其他两株联用的效果；
[0114]
③
三菌株联用和四菌株联用的对阴道清洁度的治愈效果远不如卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230这两菌株联用的效果，可能是因为多菌株之间的竞争抑制作用或者无协同配合作用。
[0115]
表3阴道清洁度结果
[0116]
[0117][0118]
(2)阴道分泌物致病菌载量及评分
[0119]
小鼠的阴道分泌物致病菌载量具体见下表4，从中可以看出：对阴道致病菌抑制效果最佳的是卷曲dh200和植物dh230的组合，其致病菌载菌量最低，平均得分为1.17，说明该菌株组合对致病菌的抑制效果最高；而不论单株菌或是三株菌联合及四菌株联合后对阴道致病菌的抑制效果均不如两株菌卷曲 dh200和植物dh230的组合，这说明菌卷曲dh200和植物dh230的协同增效作用最佳。
[0120]
表4各组大鼠阴道分泌物致病菌载量及评分
[0121][0122]
(3)病理切片检查结果及分析
[0123]
对各组的小鼠阴道组织的病理切片进行观察，不同状态下大鼠阴道组织的病理切片具体见图2和图3。具体结果及分析如下：
[0124]
①
单菌株各组、三菌株联用组中，后小鼠的阴道黏膜组织有一定程度的好转(见图3a)，但仍还有轻微的缺损，但黏膜下组织无炎性细胞浸润。
[0125]
②
只有卷曲dh200和植物dh230这两菌株的联用组的小鼠阴道黏膜组织基本痊愈(见图3b)，恢复完整性。
[0126]
③
其他两菌株联用组的阴道黏膜的恢复效果要么与单菌株组效果相同，要么与三菌株联用组效果相同，都低于卷曲dh200和植物dh230这两菌株的联用组的效果。
[0127]
④
四菌株联用后的阴道黏膜的恢复效果也远不如两菌株联用(卷曲 dh200+植物dh230)组。
[0128]
综合以上实验结果，可以确定卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230 为最佳组合的益生菌组合物，能够对阴道炎有较好的改善效果。
[0129]
实施例4：益生菌粉剂制备
[0130]
4.1益生菌粉剂配方
[0131]
将菌粉同辅料经一系列工序后得到各配方组益生菌制剂，各配方组的配方见下表5：
[0132]
表5益生菌制剂配方一
[0133][0134]
4.2制备方法
[0135]
4.2.1称量、粉碎、过筛、混料
[0136]
根据最佳配方组的比例，称取检验合格的物料，将检查无误的物料(除菌粉外)逐一投入hda-800型多向运动混合机中，对物料进行预混合，再加入菌粉后，设定电机主轴转速6rpm，混合20分钟。混合结束后，将混合粉用套有两层塑料袋的中转桶盛装，扎紧袋口，称重、存放。
[0137]
4.2.2内包
[0138]
对自动内包装机设备进行安装调试，更换打码批号、流水小号，安装复合膜、带，开机预热，进行空载调机无误后，将中转桶中的混合粉加入到料斗内，进行内包，控制装量符合要求。
[0139]
4.2.3外包
[0140]
对内包的成品进行装箱。
[0141]
实施例5：阴道抑菌实验
[0142]
将实施例4制备的益生菌粉剂产品，检测不同组方益生菌产品的抑菌效果。
[0143]
5.1实验内容：
[0144]
(1)试验菌株：大肠杆菌(8099)，取其第5代新鲜斜面培养物进行试验；金黄葡萄球菌(atcc 6538)，取其第5代新鲜斜面培养物进行试验；白念珠菌(atcc 10231)取其第7代新鲜斜面培养物进行试验。以上菌种均由广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心提供。
[0145]
(2)实验方法：
[0146]
抑菌试验步骤具体如下：
[0147]
a、抑菌片的制备:对液体抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液20μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱(37℃)中烤干，或置室温下自然干燥后备用。
[0148]
b、阴性对照样片的制备:取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水 20μl，干燥后备用。
[0149]
c、试验菌的接种:用无菌棉拭子蘸取浓度为5
×
105cfu/ml～5
×
106cfu/ml 试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60
°
，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。
[0150]
d、抑菌剂样片贴放:每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1片阴性对照样片，共5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37℃温箱，培养16h～18h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片) 并记录。试验重复3次。测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。
[0151]
5.2.仪器设备：kc-sp-yq-221游标卡尺(0-150mm)、kc-sp-yq-178 电热恒温培养箱(dhp-9272)、kc-sp-yq-586生物安全柜(hr50-ii a2)、 kc-sp-yq-207压力蒸汽灭菌锅(yxq-75sii)。
[0152]
1.检验依据：《消毒技术规范》(2002年版)2.1.8.2。
[0153]
2.检验条件：温度20-21℃，相对湿度51-54％。
[0154]
3.样品的制备：原样。
[0155]
4.接种菌浓度：5
×
105～5
×
106cf
[0156]
5.3实验结果及结论
[0157]
(1)益生菌粉剂产品对大肠杆菌(8099)、金黄葡萄球菌(atcc 6538)、白念珠菌(atcc 10231)的抑菌环数据分别如表6、表7、表8所示。
[0158]
(2)表6-8的结果说明，四个配方组的益生菌组合物粉剂产品对大肠杆菌(8099)、金黄葡萄球菌(atcc 6538)、白念珠菌(atcc 10231)均有较好的抑菌作用，其中，整体而言，配方组d对大肠杆菌(8099)、金黄葡萄球菌(atcc 6538)、白念珠菌(atcc 10231)的抑制效果优于其余各配方组。
[0159]
因此，配方组d为最佳配方，按上述相同工序制备配方组d的益生菌粉剂产品来继续开展后续实验，验证其对尿路感染情况的改善效果。
[0160]
表6样品原样对大肠杆菌(8099)的抑菌效果
[0161][0162]
[0163]
表7样品原样对金黄葡萄球菌(atcc 6538)的抑菌效果
[0164][0165]
表8样品原样对白念珠菌(atcc 10231)的抑菌效果
[0166][0167]
实施例6：最佳配方组的益生菌粉对小鼠阴道黏膜中炎症因子的影响 6.1实验方法
[0168]
采用前述的实施例3中的阴道造模方法，并对造模成功的小鼠采用配方组d的益生菌粉进行干预处理，在14天后，实验结束后处死小鼠取阴道，从阴道组织裂解物中收集的上清液中测量炎性细胞因子的水平。即：将阴道组织裂解物在含有1％蛋白酶抑制剂混合物和1％磷酸酶抑制剂混合物的冰冷ripa裂解缓冲液中匀浆。裂解物在4℃下离心20分钟，并使用商业 elisa试剂盒测量上清液中tnf-α、il-6、il-1β的水平。
[0169]
6.2实验结果及分析
[0170]
检测结果见下图4、图5、图6，具体分析如下：
[0171]
(1)如图4所示：在本益生菌组干预3天后，小鼠阴道组织中促炎细胞因子tnf-α相比于模型组有明显降低趋势，两组有显著性差异(p＜0.01)，在7天后，促炎因子tnf-α明显降低，与模型组相比有差异性(p＜0.05)。
[0172]
(2)如图5所示：在本益生菌组干预后，促炎因子il-1β也有明显的降低趋势，尤其在7天后，小鼠阴道组织中促炎因子il-1β相比于模型组有差异性。
[0173]
(3)如图6所示：在本益生菌组干预后，促炎因子il-6也有一定程度降低，但是相比于促炎因子tnf-α和il-1β，其降低幅度不明显。这可能是因为，本益生菌组对阴道炎干
预的机制中更倾向于调控tnf-α和il-1β参与的免疫细胞的表达，而对分泌il-6的免疫细胞的影响程度较弱。
[0174]
实施例7：益生菌粉剂的安全性
[0175]
7.1实验方法
[0176]
对本发明前述实施例制备的益生菌粉剂进行了阴道黏膜刺激试验，以评估我们的益生菌粉剂产品的安全性。具体实验方案如下：
[0177]
7.1.1受试物的制备：取1.6g样品加0.9％氯化钠注射液配制成10ml样品溶液，混合均匀，标识备用，连续制备5天。
[0178]
7.1.2动物准备：以新西兰兔为实验动物，试验前检查动物阴道口，未见分泌物、充血、水肿和其它损伤情况，可以用于试验。将动物分为染毒组和对照组，每组3只。
[0179]
7.2操作程序
[0180]
(1)对于实验组动物，将长度为8cm左右的钝头软管与2ml的注射器连接。注射器和导管注满受试液备用。每只动物各准备一套。将动物仰面固定，暴露出会阴和阴道口，将导管用受试液湿润后轻柔地插入阴道(4cm～ 5cm)，并用注射器缓慢注入2ml受试物，抽出导管，完成染毒。每隔24h重复染毒一次，连续5天。对照组动物用生理盐水作同样处理。
[0181]
(2)末次染毒后24h，采用气栓法处死动物，解剖取出完整的阴道，纵向切开，肉眼观察无充血、水肿等表现。然后将阴道放入10％中性缓冲福尔马林溶液中固定24h以上，选取阴道的两端和中央3个部位的组织制片，he 染后，进行组织病理学检查。
[0182]
7.3评价方法
[0183]
(1)组织病理学检查结果按照《消毒技术规范》(2002年版)2.3.5中表 2-16规定对阴道黏膜的刺激反应进行评分。
[0184]
(2)将试验组3只动物3个部位的刺激反应积分相加后，再除以观察总数(动物数
×
3)，得出试验组阴道黏膜刺激反应的平均积分。对照组评分方法同上。
[0185]
(3)将试验组平均积分减去对照组平均积分得出刺激指数后，按照《消毒技术规范》(2002年版)2.3.5中表2-17进行刺激强度分级。
[0186]
7.4实验结果及分析
[0187]
染毒组和对照组的刺激反应平分、平均积分和刺激指数如下表9所示。
[0188]
从表9的实验结果可知，我们的益生菌粉制备液对新西兰兔的阴道黏膜刺激指数为0.00，对新西兰兔多次阴道黏膜刺激试验的反应强度为无刺激性，这说明本发明的益生菌粉剂的安全性极高。
[0189]
表9新西兰兔阴道黏膜刺激试验病理检查记录表
[0190]
[0191][0192]
注：在评分栏中，刺激反应评分为每只动物阴道三个部位刺激反应评分之和。
[0193]
实施例8：小鼠尿路感染及干预实验
[0194]
8.1实验方法：
[0195]
将提前饲养一周的8至10周龄的雌性c57bl/6小鼠(jacksonlaboratories)随机分为模型组、益生菌干预组、市售组，每组各8只。其中，市售组采用的是舒茵特活性因子(妇用)抑菌粉，生产企业为扬州东辉医药科技发展有限公司。
[0196]
将模型组、益生菌干预组(即乳杆菌组)和市售组小鼠均用盐酸 (100mg/kg腹腔内)和甲苯噻嗪(10mg/kg腹腔内)进行麻醉处理，轻压小鼠腹部将膀胱内的余尿排空后对泌尿道进行酒精消毒，随后，将内径0.28 毫米的无菌聚乙烯导管缓慢插入膀胱内，并将连有0.5ml注射器的套管针内芯插入到套管中，缓慢注入80ul致病性大肠杆菌菌悬液(约107cfu/只)，接种菌液感染完成后，小鼠禁食4h，4h后恢复正常饮食和进水。在感染后的第1天、2天、4天收集小鼠尿液，涂板计数，观察尿液中细菌菌落数的变化。
[0197]
在造模的第3天给予实验组小鼠前述最佳配方组的益生菌组合物粉剂产品配制成的溶液(0.3g产品溶解在150ml水中)进行注射处理，连续注射7 天(20ml/天)，对模型组的小鼠注射相同量的生理盐水；对市售组的小鼠注射事先备好的舒茵特活性因子(妇用)抑菌粉溶液，其浓度与益生菌干预组小鼠注射的浓度和用量一致。在过程中观察各组小鼠的精神状态，并打分；并统计检测尿液和膀胱中致病菌数，此外，还检测了典型的uti尿液细胞因子mcp-1(人单核细胞趋化蛋白1)、炎症因子il-1β(白细胞介素)的变化情况。
[0198]
8.2实验结果及分析：
[0199]
(1)精神状态：
[0200]
将精神状态分为4个级别，级别数值越低表示精神状态越不好。从图7 的结果可看出，经益生菌组后，小鼠的精神状态恢复得较好，在的第5天后小鼠恢复到与正常小鼠相同的精神状态。
[0201]
(2)致病性大肠杆菌细菌数变化：
[0202]
通过图8的结果可看出：在经过本发明的益生菌组后，小鼠尿液中致病性大肠杆菌的细菌数数明显降低，其对小鼠尿路的致病性大肠杆菌的抑制效果高于市售组产品的抑制效果，是具有市场竞争力的潜力产品。
[0203]
(3)尿细胞因子的情况：
[0204]
根据图9a和图9b的结果可知，模型组的mcp-1含量及il-1β的含量高；而经本技术
的乳杆菌产品后，炎症因子il-1β及趋化因子mcp-1的含量得到大幅度地降低，有显著性差异，且其效果远优于市售产品组的效果。该结果说明，本技术的乳杆菌组合物产品能够抑制尿路感染引起的细胞因子和趋化因子的升高，也再次说明，本技术的乳杆菌产品(益生菌制剂)通过抑制炎症因子的表达而起到对尿路感染良好的改善效果。
[0205]
实施例9探究木葡聚糖与植物乳杆菌dh230、卷曲乳杆菌dh200之间配方效果差异
[0206]
为进一步研究上述两种益生菌与木葡聚糖之间在配方上的协同效果，以及分析单一成分及最佳配方d对于阴道炎症的改善效果及尿路致病性大肠杆菌的抑制效果，设置了本实施例。
[0207]
(1)按照下表10的配方制备五组不同配方的益生菌粉剂，配方具体如下：
[0208]
表10益生菌制剂配方二
[0209][0210]
(2)实验方法：
[0211]
具体方法参照实施例6和实施例8的对应方法进行操作。
[0212]
(3)实验结果及分析
[0213]
从图10a、图10b、图10c的结果可得到以下结论：
[0214]
①
对于尿液中致病性大肠杆菌和阴道促炎因子tnf-α及il-1β的抑制效果中，配方i的抑制效果最佳。
[0215]
②
其余各配方组，因缺少植物乳杆菌dh230或卷曲乳杆菌dh200或木葡聚糖，对尿路致病性大肠杆菌的抑制效果远不如配方i组(即前述最佳配方 d)。
[0216]
因此，可得出结论：只有植物乳杆菌dh230、卷曲乳杆菌dh200和木葡聚糖相互协同配合，赋予益生菌制剂方案以更优的技术效果，这三种成分有机组合并在一定配比下能够起到对阴道炎症及尿路感染的良好的改善效果。
[0217]
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

技术特征：

1.一种乳杆菌组合物，其特征在于，包括保藏号为cgmcc no.16193的卷曲乳杆菌dh200和保藏号为cgmcc no.16194的植物乳杆菌dh230。2.根据权利要求1所述的乳杆菌组合物，其特征在于，卷曲乳杆菌dh200和植物乳杆菌dh230的菌体数量之比为：1/4～3/2。3.一种益生菌制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的乳杆菌组合物。4.根据权利要求3所述的益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂的剂型为粉剂、液体剂、片剂、软膏剂和栓剂。5.根据权利要求3所述的益生菌制剂，其特征在于，包括以下各成分：卷曲乳杆菌dh200、植物乳杆菌dh230、木葡聚糖、乳糖和二氧化硅。6.根据权利要求5所述的益生菌制剂，其特征在于，包括以下质量份数的各成分：卷曲乳杆菌dh200菌粉1～5份、植物乳杆菌dh230菌粉1～5份、二氧化硅1～3份、乳糖5～10份和木葡聚糖1～5份。7.如权利要求3所述的益生菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：称取相应质量分数的卷曲乳杆菌dh200菌粉、植物乳杆菌dh230菌粉、木葡聚糖、乳糖、二氧化硅进行混料，再进行剂型加工，得到益生菌制剂。8.如权利要求1所述的乳杆菌组合物或如权利要求3所述的益生菌制剂在制备抑制泌尿系统致病菌和女性生殖系统致病菌的药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述女性生殖系统致病菌包括：阴道致病性大肠杆菌、金黄葡萄球菌和白念珠菌；泌尿系统致病菌包括：尿路致病性大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和奇异变形杆菌。10.如权利要求1所述的乳杆菌组合物或如权利要求3所述的益生菌制剂在制备预防和/或泌尿生殖系统感染的药物中的应用。

技术总结

本发明公开了一种乳杆菌组合物、益生菌制剂及其制备方法和应用，该乳杆菌组合物包括保藏号为CGMCC NO.16193的卷曲乳杆菌DH200和保藏号为CGMCC No.16194的植物乳杆菌DH230。所述乳杆菌组合物通过卷曲乳杆菌DH200和植物乳杆菌DH230这两种乳杆菌的协同配合，对阴道炎和尿路感染均起到较好的改善效果。通过上述乳杆菌组合物制备的益生菌制剂的配方简单，生产条件易控制，生产成本低，使用安全，且对阴道炎症及尿路感染症状均良好的改善效果。症及尿路感染症状均良好的改善效果。症及尿路感染症状均良好的改善效果。