⽬录
1、透明质酸的简介 (2)
2、透明质酸的结构及理化性质 (2)
csi lv2.1透明质酸的结构 (2)
2.2透明质酸理化性质 (2)
2.3 透明质酸⽣理功能 (3)
3透明质酸的制备⽅法 (3)
3.1 动物组织提取法 (3)
3.2 酶聚⼈⼯合成法 (4)
3.3 微⽣物发酵法 (4)
3.3.1 透明质酸⽣产菌株的选育 (5)
3.3.2 透明质酸发酵条件的优化 (5)
3.3.3 透明质酸的提取 (6)
4 透明质酸的改性 (11)
4.1 酯化改性 (11)
4.2 酰胺化改性 (12)
4.3 交联改性 (13)
4.4 疏⽔改性 (14)
4.5 接枝改性 (15)
4.6 还原末端改性 (16)
5 透明质酸的应⽤ (17)
5.1 在化妆品中的应⽤ (17)
5.2在临床医学中的应⽤ (18)
5.3 在保健⾷品中的应⽤ (18)
6 透明质酸的国内外⽣产研究现状及常见产品 (18)
6.1透明质酸的国内外⽣产研究现状 (18)
6.2常见产品 (20)
7 我的设计⽅案 (20)
参考⽂献： (22)
透明质酸简介
1、透明质酸的简介
透明质酸(Hyaluronic Acid，简称 HA)，⼜名“玻璃酸”，是⼀种不含硫酸基团的天然粘多糖，⼴泛分布
于动物和⼈体的细胞外基质中，在⽪肤、肺和肠中含量较⾼(⼤于50%)，同时也存在于滑液、脐带和⾎液中。透明质酸另⼀名称为玻尿酸，但是玻尿酸与尿酸没有任何关系。
透明质酸因其独特的理化性质和⽣物学功能，被⼴泛应⽤于临床医学、⾼级化妆品、美容整形和保健⾷品等领域。但天然透明质酸存在稳定性较差、易发⽣降解和亲⽔性过强等缺点，限制了其应⽤，因此通过对透明质酸修饰改性，从⽽开拓具有新的⽣物活性和功能性的透明质酸衍⽣物成为⽬前研究的热点[1]。
2、透明质酸的结构及理化性质
网络收集2.1透明质酸的结构
透明质酸是⼀种⾼分⼦的聚合物。是由单位D-葡萄糖醛酸及N-⼄酰葡糖胺组成的⾼级直链粘多糖。D-葡萄糖醛酸及N-⼄酰葡糖胺之间由β-1，3-配糖键相连，双糖单位之间由β-1，4-配糖键相连。分⼦中两种单糖按1:1的摩尔⽐组成。双糖单位可达25000之多。在体内透明质酸的分⼦量从5千到2千万道尔顿[2,3]。
2.2透明质酸理化性质
电⼦显微镜下观察证实 HA 为⼀线性单链, 分⼦量为 4×106, 链长约为10µm。由于直链链轴上单糖之间氢键的作⽤,HA 分⼦在空间呈刚性的螺旋柱型 , 其半径为200nm, 柱内侧因有⼤量羟基⽽产⽣强亲⽔性。在溶优化训练
液中 HA 结合的⽔分可达其本⾝重量的 1000倍, 且这些⽔在螺旋柱内固定不动, 不易流失[4]。
HA ⽔溶液是⼀种⾮⽜顿型流体, 有着良好的粘弹性和应变性。⼀般来说, 溶液浓度和分⼦量的增加会使溶液粘度增加。低浓度的 HA 溶液主要表现为粘性, ⽽⾼浓度溶液则主要显⽰其弹性[5]。
2.3 透明质酸⽣理功能
在⽣物组织中，HA 以游离形式⼴泛分布于结缔组织的细胞外基质中，是细胞外基质（ECM）的主要成分之⼀，在保持组织抗压缩性及张⼒和维持组织形态⽅⾯具有重要作⽤。⽽ HA 在体内不仅是通过其粘弹性、⼤分⼦⽹状结构等发挥细胞连接、物理屏障、渗透压调节和机械离缓冲等功能，⽽且具有灭活⾃由基、调节细胞功能等⽣理活性，在肿瘤扩散、伤⼝愈合、胚胎形成、抑制疼痛和炎症反应中具有重要的作⽤[6]。
HA 为关节滑液的主要成分之⼀，因其独特的润滑特性，对维持关节功能具有重要意义（杨⼩⽴，2006；王国⾦，2009；Gaston et al.，2007）。据研究表明（郭学平等，2002）HA 具有抗⽪肤衰⽼和防⽌⽪肤皱纹形成功能，阳光中紫外线照射所产⽣的活性氧⾃由基能被表⽪中的 HA 可清除，保护⽪肤免受其害，被称为⾼效的⾃由基“清道夫”。HA 在⽪肤中表现的⽣理功能还有保⽔作⽤，维持细胞外的空间，参与⾓蛋⽩细胞的变化过程和受体结合作⽤等。
3透明质酸的制备⽅法
3.1 动物组织提取法
HA ⼏乎存在于所有的动物组织中，分布⼴泛。提取 HA 的传统⽅法是以动物组织为原料，从⼈脐带（Lagoa G et
al.，2005；沈渤江等，1985）、鸡冠（颜延宁，2006）、⽜⽺眼珠的玻璃体（Tadashi Y et al.，2004）、鲸鱼软⾻中
（E.Yu.Ignatova et al.，1990）来提取 HA。动物组织提取法对原料要求较⾼，原料必须是新鲜采集的，并经过冷冻处理。动物原料组织价格昂贵、来源困难，并这些动物原料组织中 HA 纯度低、收率低。在提取过程中，要消耗⼤量的有机溶剂和酶，并且操作单元多、⼯艺复杂，会⼤⼤增加制备 HA 的成本。此外，从动物组织中提取的 HA 杂质含量⾼，产品精制困难。总之，由于该⽅法制备 HA ⽣产成本⾼，原料来源有限，HA 纯化⼯艺复杂，动物原料组织提取法已不能满⾜云朵制造机
⽬前市场的需要，已逐渐被发酵法所取代。
3.2 酶聚⼈⼯合成法
通过研究表明, 在⽣物体内 HA 是通过透明质酸合成酶催化 UDP-G1cA 和UDP-G1cNAc合成[7]利⽤单体酶催化在体外聚合合成透明质酸, ⾸先使⽤多糖类聚合物合成透明质酸氧氮杂环戊烯衍⽣物, 然后添加透明质酸分解酶制造出衍⽣物和酶的复合体，接着在 90℃反应液中清除其中的酶合成透明质酸, 然后再对其进⾏沉淀、分离即可得到透明质酸精品。凌敏等[8]根据从 Streptococcus equi 扩增出透明质酸合成酶(sqHAS)基因 , 构建表达质粒 pSE-sqHAS 并转化⼤肠杆菌
DHSa, 诱导培养后在细胞膜中检测到 sqHAS 蛋⽩及活性。利⽤携带该酶的细胞膜以 UDP-G1cA 和UDP-G1cNAc 为底物在体外合成了分⼦量为
3.6×106Da 的HA, 分别是发酵法⽣产和提取法⽣产的HA 的分⼦量的 2.5 倍和 5 倍左右。但是 HA 体外合成的前体物质价格昂贵, 难于应⽤于实际⼯业化⽣产中, 因此这种⽅法仅适⽤于⽣产⾼分⼦量、⾼纯度具有特殊⽤途的HA。
3.3 微⽣物发酵法
发酵法制备透明质酸可以最早可以追溯到70年代，但⼀直没有⼤量开发，直到1985年，⽇本资⽣堂⾸次报道了⽤链球菌⽣产透明质酸的⽅法后，发酵法制备透明质酸才有了长⾜的进展。已报道的产透明质酸菌主要为伯杰⽒⼿册中链球菌的A组与C 组，如化脓链球菌(Strep tococcus pyogenes A )、兽疫链球菌(Streptococcus 200epidemicus () )、马疫链球菌( Streptococcus egui c ) 、类马链球菌(Streptococcus eguismilis c ) 、缺乳链球菌 ( c ) 、鸡杆菌等。A主要是化脓链球菌，系⼈体致病菌，不宜作为⽣产菌种，⽬前很少使⽤。C链球菌为⾮⼈体致病菌，相对来说适⽤于⼯业⽣产。国外近年来利⽤C链球菌⽣产透明质酸已达到产业化阶段。 利⽤发酵法制备透明质酸的品质主要取决于如下四个⽅⾯：菌种的筛选、培养基的选配、发酵⼯艺的优化和分离提纯过程。⽣物发酵法的优点是产品不受原料资源限制、⼯艺简单并且成本低，所以⽬前
对于透明质酸的制备多选⽤发酵法。发酵法制备透明质酸⽬前所⽤的菌种主要有兽疫链球菌、马疫链球菌和类马疫链球菌等。发酵法制备透明质酸分为需氧发酵和厌氧发酵，其中需氧发酵产率⾼且得到的透明质酸分⼦量⾼。在发酵过程中，温度通常为37℃，pH值需要控制在6.0-8.5范围内，过酸过碱的环境都会影响菌体⽣长，降低透明质酸的产率。也可在不同发酵阶段采⽤不同的溶氧量来提⾼透明质酸的产率。此外，发酵液黏度 可直观反映出透明质酸的产率，透明质酸的假塑性在⾼剪切速率作⽤溶液黏度下降，⾼搅拌速率能显著提⾼透明质酸的分⼦量，但过⾼的速度会破坏分⼦反⽽降低透明质酸的分⼦量，所以搅拌速度通常控制在100~800r/min。也可通过在发酵液中加⼊少量尿嘧啶、⾕氨酰胺和天冬氨酸，或加⼊溶菌酶来提⾼透明质酸产率[9-12]。
3.3.1 透明质酸⽣产菌株的选育
野⽣型的链球菌作为 HA 产⽣菌, ⾸先要经过诱变使其成为溶⾎素和透明质酸酶缺陷型菌株。链球菌多会产⽣溶⾎素( Streptolysin) , 溶⾎素有溶解红细胞、杀死⽩细胞和毒害⼼脏的作⽤。溶⾎素混⼊成品 HA, 还会使HA 的品质降低, 不能⽤于医药品和化妆品, 所以规模⽣产必须获得⾮溶⾎性的菌株。邓开野[13]从⾎琼脂平板上筛选出⼀株不具有溶⾎性的突变菌株, 其性能⽐原始菌株有很⼤提⾼。野⽣型的产⽣ HA 的链球菌在产⽣透明质酸的同时产⽣透明质酸酶, 透明质酸酶可将透明质酸降解或低分⼦量化,
miad530 因此透明质酸酶的产⽣对 HA 的发酵⾮常不利。虽可采⽤在发酵培养集中添加透明质酸酶的抑制剂, 如藻酸硫酸盐等的⽅式来提⾼ HA 的产量。但现在发酵⽣产上所采⽤的菌种, ⼀般都是经诱变处理得到的透明质酸酶的缺陷型。冯建成[14]对马疫链球菌 SH-0进⾏诱变，筛选出溶⾎素和透明质酸酶双缺陷型突变菌株 SH-2，使透明质酸产量提⾼ 5 倍。诱变菌种的⽬的是为了获得 HA 产量⾼、优良性状稳定的菌株。孙建[15]通过紫外线和 NTG 复合诱变处理得到溶⾎性弱的菌株，突变菌株⽐出发菌株透明质酸产量提⾼ 1 倍以上。张淑荣等[16]利⽤物理⽅法紫外线, γ射线及辅助磁场筛选诱变兽疫链球菌, 研究获得性状优良，产量相对稳定的透明质酸⾼产菌种, 透明质酸产量可稳定在 3～5g/L。罗强[17] 采⽤ NTG 诱变原⽣质体，选育了⼀株产透明质酸的兽疫链球菌( Streptococcus zooepidemicus) H235。化学诱变剂污染环境、操作不安全, 因此较为安全的物理诱变⽅法越来越受到⼈们的关注, 但诱变剂量的⼤⼩以及突变后菌株的回复突变是采⽤物理诱变剂所需进⼀步研究的⼯作。⽬前, HA 产⽣菌的诱变⽅法多为紫外线照射和化学诱变剂等常规⽅法。另外, 郝宁[18]等运⽤基因诱变育种将 vgb 基因导⼊兽疫链球菌以促进细胞在低氧状态下的⽣长, 同时 HA 合成基因的导⼊将增加HA 合成途径的前体供应, 使HA 产量增加 31%。此法⽣产的 HA 相对分⼦质量相对均⼀、分散性⼩，由于 2 个前体物 UDP-N-⼄酰氨基葡糖和 UDP-葡萄糖醛酸价格昂贵。因此, 此法⽣产 HA 成本⾼, ⽬前只⽤于实验室中。
3.3.2 透明质酸发酵条件的优化
链球菌的营养需求较为苛刻, 通常在含⾎清、脑⼼浸液等培养基上菌体才能较好地⽣长, 但这类营养物
质价格昂贵, ⼤规模⽣产成本太⾼, 所以通常以蛋⽩胨、酵母膏或浸出粉、⽜⾁浸膏等的复合氮源代替。另外, 有研究表明在发酵液中添加⼀定量的⾕氨酸和精氨酸, 可以提⾼ HA 的产率。国内外⽂献资料⼤多使⽤葡萄糖作为碳源, 也有⽤蔗糖、半乳糖等研究链球菌的利⽤情况，姚敏杰等[19]以不同碳源进⾏对⽐实验, 发现只有蔗糖不能被利⽤, ⽽⾼海军[20]等发现蔗糖仅⽐葡萄糖利⽤率低。考察兽疫链球菌对于常⽤碳源的利⽤情况，发现可溶性淀粉作碳源其菌体量和透明质酸产量较⼤; 其次, 才为葡萄糖和蔗糖。产⽣如此⼤的差异的原因是因为菌种的差异还是⽅法所造成的仍需要深⼊的研究。氮源不仅为菌体长氮元素, ⽽且⼤多数有机氮源还能提供多种⽣长因⼦。国外有报道⽤化学合成培养( Chemical defined media) 与酵母粉为复合氮源培养基⽐较, 发现在化学合成培养基中兽疫链球菌⽣长速率降低, ⽽ HA 产率系数和⽐合成率却与复合氮源中的类似。国内⼤多采⽤有机物作为氮源, 包括胨、酵母膏、⼤⾖⽔解物等。不同的菌株对于氮源利⽤情况相差也⼤, ⾼海军[21]等发现酵母膏作为单⼀氮源时, HA 产量及菌体量均较⾼, 其次为酵母膏与蛋⽩胨的混合氮源以及⽟⽶浆。安海平[22]等发现对于马链球菌 N2506, 蛋⽩胨与酵母膏以 1: 1 ⽐例效果最好, ⽆机氮源对 HA 发酵过程作⽤不⼤。
Ogrodowski 等[23]发现添加溶菌酶能够提⾼透明质酸的产量, 这是因为透明质酸⽣产菌需分泌⼤量的透明质酸以保护其细胞壁免遭破坏；同时, 溶菌酶能诱导透明质酸合成酶的活性。在发酵过程中添加含有羟基的酚类化合物如苯酚、丹宁等能⼤幅提⾼透明质酸的产量；此外葡糖胺、丙酮酸、尿嘧啶等因为是 HA 合成的前体物质, 通过添加也可获得⾼分⼦量的 HA[24]。孟庆繁[25]添加⼗⼆烷基硫酸钠(
SDS) 能够⼤幅度提⾼ HA 产量。这是因为菌体在产⽣ HA 的同时会产⽣HA 酶, 该酶可以使 HA 分解，导致 HA 产量下降。⽽ SDS 作为 HA 酶活性抑制剂，保护 HA 不被降解。
3.3.3 透明质酸的提取
发酵法之所以没有得到⼴泛应⽤其原因是多⽅⾯的, 其中对发酵液中HA 产物的提取⼯艺不成熟是⼀个重要⽅⾯。具体表现在缺少⼀条被⼴泛认可和接受的可⽤于⼯业⽣产的下游分离⼯艺。分离纯化发酵液中的 HA 有多种报道, 如有机溶剂沉淀法、离⼦交换法等。沉淀HA 的有机溶剂有⼄醇、丙酮、⼄酸等, 有机溶剂的作⽤是通过降低⽔溶液的介电常数从⽽增加溶质分⼦异性电荷库仑⼒的引⼒达到沉淀的⽬的。
3.3.3.1 预处理
预处理是在分离纯化前对发酵液进⾏灭酶、灭菌、除菌的⼯艺。对于⼀些⾮透明质酸酶缺陷型菌株发酵所得的发酵液，通过预处理可以杀灭透明质酸酶，减少 HA 分⼦量的降低。史鹏等[26]采⽤两种预处理⽅式进⾏灭酶，热处理⽅式为发酵液在 70 ℃下保温 1 h，静置 5 h；酸处理⽅式为发酵液⽤三氯⼄酸调 pH 值⾄ 4.5，1 h 后回调⾄ 6.0，静置 5 h，两种预处理⽅式的蛋⽩质去除率、HA 得率很接近，但酸处理的分⼦量降低率要低于热处理，表明酸处理能更有效的抑制透明质酸酶的活性。
杀灭发酵液中的菌体通常加⼊杀菌剂，常⽤的杀菌剂包括三氯⼄酸、氯仿等。三氯⼄酸可以溶解细胞上的脂类物质，使细胞破坏，从⽽起到灭菌和抑制酶活⼒的作⽤。氯仿和三氯⼄酸的作⽤类似，能够使 HA 逐渐从细胞膜上脱落[27]，使蛋⽩质变性沉淀，并能渗⼊细胞膜，除去细菌内毒素等致炎物质，使 HA 产品安全性提⾼[28]。采⽤加热进⾏灭菌，灭菌温度⼀般为 75～80 ℃[29]，国外专利报道，将发酵液加热到 90 ℃，再除去菌体[30]。
通过有效除菌可以改善分离效果，使 HA 分离得率提⾼，同时也可以去除部分杂蛋⽩。除菌的⽅法较多，祝庆等[31]⽐较了微滤除菌和经盐酸、甲醛和三氯⼄酸分别处理后再离⼼除菌的效果，发现微滤除菌效果最好，但微滤过程中需要加压和不断稀释，在后期沉淀阶段需消耗⼤量有机溶剂，滤速慢也使得整个分离周期延长，因此⼯业化⽣产可⾏性不⼤。相对于盐酸法、甲醛法，三氯⼄酸除菌法HA产量和质量均有提⾼，这是由于三氯⼄酸的加⼊使HA 与蛋⽩质的络合有⼀定的解除。邓禹等[32]采⽤25 g/L 三氯⼄酸灭活菌体并使蛋⽩质变性沉淀，以混合硅藻⼟为过滤助剂，再配以特定的后处理⼯艺，所得成品透明质酸中蛋⽩质含量仅为 0.047%。周荣清等[33]⽐较了絮凝、离⼼、三氯⼄酸 3 种预处理⽅式对超滤膜污染的影响，所采⽤的絮凝剂为阴离⼦型聚丙烯酰胺（AN926），添加量为 100×10－3mg/mL，絮凝预处理的上清液经超滤后膜通量降低率仅为其它两种⽅法的1/10，表明絮凝法预处理可以有效除去菌体和杂蛋⽩，改善膜分离效果郭育涛等[27]采⽤发酵液中加⼊2倍体积的氯仿除菌体的⽅法，在 28 ℃、pH 值为 7.0 的条件下搅拌 60 min，离⼼后，HA 提取率达 97.5%，纯度达 97.3%。
国外专利报道了采⽤过滤除去菌体的⽅法[33,34]。盛瑞堂等[35]也采⽤过滤法除去菌体，并发现使⽤硅藻⼟作为吸附剂时的滤液浊度和终滤液 HA 收率优于活性炭。在 HA 发酵结束后，将发酵液加⼊⼯业⼄醇得到 HA 粗品沉淀，以 20 g/L 的浓度溶于去离⼦⽔，加⼊硅藻⼟，充分搅拌以吸附菌体杂质，在 pH 值4.6～4.8 的条件下过滤，滤液在 pH 值为 4.8 时浊度最⼩，在 pH 值为 4.6 时蛋⽩含量最低，蛋⽩含量和浊度变化趋势随 pH 值改变基本⼀致。过滤法除菌体是物理过程，操作简便，效果明显，并且容易在⼯业化⽣产中应⽤。
3.3.3.2 分离⼯艺
3.3.3.2.1⼄醇分离
除去发酵液中的菌体后，需要将 HA 分离出来，这是⼀个初步纯化的过程。⼄醇沉淀是分离各种多糖常⽤的⼀种⽅法，可以使HA 有效脱⽔、脱⾊，从⽽提⾼ HA 产品品质[26]。为了使 HA 完全沉淀，溶液中应有⾜够的离⼦强度，常加⼊浓度为 1%左右的 NaCl 或 NaAc 以达到适宜的离⼦强度。⼄醇添加量⼀般为发酵液体积的 2 倍[27]，如果⼄醇添加量⾜够⼤，HA 浓度低⾄0.1%也可沉淀完全[28]。HA溶液具有较⾼的黏度，⼄醇沉淀时如果 HA 浓度过⾼，沉淀趋向于糖浆状⽽难以分离；如果浓度过低，所需⼄醇量偏⼤，不利于降低成本[29]。预处理时由于发酵液黏度较⾼，离⼼或过滤前往往要对发酵液进⾏稀释，HA 常因稀释⽽浓度较低，直接采⽤⼄醇沉淀会消耗⼤量⼄醇，⽽浓缩可以减少⼄
醇⽤量。盛瑞堂等[35]采⽤超滤法对过滤后的发酵液进⾏浓缩，使 HA 溶液体积减少了 67.1%，相应的⼄醇⽤量降低了 67.1%。孙宏伟等[36]应⽤⽓隙式膜蒸馏分离技术对发酵液进⾏浓缩分离，使⽤膜孔径为0.2 µm 的聚四氟⼄烯（PTFE）微孔疏⽔平板膜组件，可使原料液的浓度提⾼ 1.6 倍以上。在浓缩发酵液的同时，超滤还可以去除⼀些⼩分⼦杂蛋⽩，有利于后期的纯化Bracke[37]及 Ellwood[38]采⽤ MWCO（截断相对分⼦质量）分别为 10 000、20 000、30 000 的超滤膜渗滤去除发酵液中的⼩分⼦物质，效果显著；盛瑞堂等[35]采⽤超滤除去杂蛋⽩总量的 53.9%。可见，在⼄醇沉淀前采⽤膜技术进⾏浓缩有利于降低成本和后期纯化。
3.3.3.2.2 膜技术分离
膜技术不仅可以⽤于发酵液的浓缩，将其作为⼀种主体技术分离、提纯发酵液中的 HA 也有⼀定可⾏性。周海东等[39]采⽤PVDF 材质的膜，对 HA发酵液进⾏错流微滤和超滤，HA 浓度在⼀定的范围内（微滤≤1.2 g/L，超滤≤1.5 g/L），膜⼯艺可稳定地运⾏。Zhou 等[40]采⽤先微滤后超滤的两步切向流过滤⼯艺对发酵液中 HA 进⾏分离，共进⾏两次，第⼀次微滤和超滤以纯⽔作为过滤洗液，第⼆次微滤时以第⼀次超滤所得的透过液作为过滤洗液，两次⾼效的分步分离纯化可使 HA 得率超过77%。可见，以膜分离技术为主体，采⽤微滤和超滤相结合的⼯艺，能够实现 HA 发酵液的分离提纯。但是，在微滤过程中HA 的透过率较低；在超滤过程中虽然蛋⽩质相对于 HA 的选择性较⾼，但蛋⽩质的透过率较低，因此，应针对溶液条件的变化进⾏研究，以提⾼ HA 在微滤膜中及蛋⽩质在超滤膜中的透过
率。
3.3.3.2.3 壳聚糖分离
近年来，利⽤壳聚糖带相反电荷的吸附作⽤将HA 分离下来的⽅法也见诸报道。德国专利[41]报道了将壳聚糖直接加⼊发酵液中以沉淀 HA。Yang等[42]通过沉
淀⽅法使壳聚糖与磁铁矿微粒共轭形成复合物微粒（壳-磁微粒），探讨了该复合物微粒通过电荷吸附作⽤从发酵液中分离 HA 的效果，发现通过调节 pH 值在6～8 之间，HA 在发酵液中并不能直接被分离下来。经⼄醇沉淀分离后的 HA 粗品，在 pH 值为 6 的条件下溶解，⽤壳-磁微粒进⾏吸附；在pH值为8的条件下进⾏洗提，只有30% HA被壳-磁微粒吸附结合，⼜只有⼤约30%壳-磁微粒结合的 HA 被洗提下来；通过降低 pH 值⾄ 4.0 来增加壳-磁复合物正电荷密度后，吸附作⽤显著提⾼，但⼜会出现壳聚糖与磁微粒易分散等问题。因此，这种分离与纯化⽅法在实际⽣产中的可⾏性尚有待进⼀步研究。
3.3.3.3 纯化⼯艺
3.3.3.3.1 季铵盐纯化
氯化⼗六烷基吡啶（CPC）是⼀种季铵盐类阳离⼦表⾯活性剂，它能与黏多糖分⼦中的聚阴离⼦形成
络合物，此络合物在低浓度盐溶液中产⽣沉淀，⽽在⾼浓度的盐溶液中逐渐解离，引起 HA 与 CPC复合物解离所需的盐浓度远⽐其它黏多糖与 CPC 复合物解离所需浓度要低，利⽤此性质可达到纯化HA 的⽬的。Cifonelli 等[43]早在 1957 年就对发酵液经浓缩后再⽤ CPC 纯化进⾏了研究。洪⽔声等[44]向 HA 粗品溶液中加⼊等体积的质量分数为 4%的CPC 溶液，形成絮状物后静置 1h，再离⼼分离，沉淀溶于 1.5 mol/L 的 NaCl 溶液中，离⼼除去不溶物。祝庆[45]将⼄醇沉淀得到的 HA 粗品溶于 0.05 mol/L的 NaCl 溶液中，加⼊ 1% CPC，搅拌 30 min 后静置 1 h，离⼼收集沉淀后溶于不同浓度 NaCl 溶液中，发现NaCl溶液浓度为0.35 mol/L时HA纯度和产量较⾼。丁霞[46]将 HA 粗品溶于 0.15 mo1/L NaCl 中得到0.25%的HA溶液，1倍体积10% CPC(溶在0.15mo1/L NaCl 中)加⼊ 8 倍体积的 0.25%的 HA 溶液中，通过离⼼分离 CPC 沉淀，⽤ 0.15 mol/L NaCl洗涤，得到较纯的 HA 溶液。采⽤ CPC 进⾏纯化的优点是操作简单，但 CPC 回收困难，单位价格较⾼，所以应⽤成本较⾼。⼗六烷基三甲基溴化铵（CTAB）纯化 HA 的作⽤机制与 CPC 相似，但成本相对较低。丁霞等[47]将初步除去菌体和不溶性杂质的提取液中加⼊CTAB，通过离⼼分离沉淀，并⽤ 0.15 mol/LNaCl 洗涤沉淀，浸泡在 1.5 mol/L NaCl 溶液中过夜，CTAB-HA 复合物可解离溶解，最终可得清亮、较纯的 HA 液体。盛瑞堂等[35]报道了⽤ CTAB 沉淀法从发酵液中分离HA 的⽅法，将发酵液稀释⾄4.5 倍，调节pH 值⾄6.5，加⼊发酵液体积 12%的 CTAB 溶液（体积分数为 10%），HA 的收率可⾼达 97.0%，与⼄醇法相⽐，CTAB 法 HA 的收率提⾼了 2.1%，HA 沉淀中杂蛋⽩的质量分数降低了 2.4%，与 CPC 法相⽐成本降低了45.2%。可见，采⽤CTAB 法对 HA 进⾏分离纯化具有明显优势和很好的应⽤前景。
3.3.3.3.2 酶解纯化
加⼊蛋⽩酶能够使 HA 与蛋⽩质的络合状态解除，HA 更多地游离于溶液中，使其易于纯化。常⽤的蛋⽩酶有胃蛋⽩酶、⽊⽠蛋⽩酶，链酶蛋⽩酶等，链酶蛋⽩酶对接近糖蛋⽩质链肽键上的作⽤效果优于⽊⽠蛋⽩酶，⽽胃蛋⽩酶的⽔解作⽤不够彻底，往往需要配以其它酶才能见效。祝庆等[31]将除菌体后的上清液加⼊链酶蛋⽩酶作⽤ 2 h，⼄醇沉淀后再经氯仿除蛋⽩，HA 产量得到了较⼤幅度的提⾼，杂蛋⽩的含量为 2.8%，与采⽤氯仿三次除蛋⽩后的纯度相当。
3.3.3.3.3 过滤法纯化
过滤法纯化易于实现⼯业化，能有效滤除菌体和蛋⽩质，对分⼦量影响相对要⼩。盛瑞堂等[35]报道了采⽤过滤法纯化 HA 的⼯艺：将 HA 粗品以 20g/L 的浓度溶于⽔中，加⼊硅藻⼟作为吸附剂，调节溶液 pH 值⾄ 4.6～4.8，在 HA 粗品溶液中加⼊10 g/L 粗硅藻⼟和 3.3 g/L 细硅藻⼟为助滤剂，⽤粗硅藻⼟和细硅藻⼟预涂层过滤，然后⽤ H ⼄-1 型滤板过滤，经过超滤后，将滤液⽤⼄醇沉淀并⼲燥，得到葡糖醛酸含量达 44.2%的 HA。邓禹等[32]将发酵液经过前处理后，以发酵液质量 1.2%的混合硅藻⼟（粗细硅藻⼟⽐为 1.5∶1）作为过滤助剂，过滤温度为 60 ℃，pH 值为 7.0，再配以酒精沉淀、⽓浮、酒精造粒的后处理⼯艺，得到的成品透明质酸中葡萄糖醛酸含量达 46.39%，蛋⽩质含量仅为0.047%，相对分⼦质量为 1.9×106Da。
3.3.3.3.4 离⼦交换层析纯化
在进⼊ HA 纯化阶段后，离⼦交换层析等具有选择性吸附特点的层析技术往往被采⽤。与化学⽅法相⽐，离⼦交换层析分离条件温和，不引起分⼦结构的变化，⼰经成为分离提取⽣物⼤分⼦的有效⽅法。离⼦交换法⽤于纯化 HA 的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件[46]。Poli 等[47]将粗滤后的滤液先后流经阳离⼦交换树脂和 Amberlite IRA900 强碱型阴离⼦交换树脂，杂质吸附在树脂上，HA 不被吸附⽽流出，流出液直接冷冻⼲燥或减压⼲燥可得纯度在 98%以上的 HA，其蛋⽩质含量为 0.3%。Gerard等[48]曾报道了采⽤ DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖分离 HA 的研究，但由于这两种层析剂价格昂贵，限制了在⼯业上的应⽤。选择经组氨酸修饰的强碱型阴离⼦树脂作为离⼦交换剂，以增⼤ HA 及其所含蛋⽩质、核酸等各组分与交换剂相互作⽤的差异，选择氯化钠为洗脱剂，对 HA 粗品进⾏离⼦交换层析，纯化质量收率为 58%～61%，相对分⼦质量近1.0×106Da，蛋⽩质含量为 0.075%。
3.3.3.3.5 凝胶过滤柱层析纯化
凝胶过滤层析常在纯化阶段的后期被采⽤，需要根据不同分离纯化⽬的和HA 分⼦量⼤⼩选择合适的分⼦筛。采⽤ Sephadex G-25 凝胶过滤柱层析分离
HA 溶液中残留的 CPC 及其它杂质。将发酵液经过氯仿与正丁醇混合液除蛋⽩、季铵盐（CPC）复合
物沉淀、DEAE-纤维素柱层析后制得的样品，配成质量分数为0.5%的溶液，
采⽤ Sephadex G-75 凝胶过滤柱进⾏层析纯化，进样量为 2.0 mL，⽤蒸馏⽔进⾏洗脱，洗脱速度为 6mL/h ，收集洗脱峰并冷冻⼲燥， HA 总收率为59.65%，蛋⽩质含量为 0.075%。车载mp3播放器
4 透明质酸的改性
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