甲基化特异性PCR过程中的影响因素分析

甲基化特异性ＰＣＲ过程中的影响因素分析

DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一。它是指在DNA甲基转移酶的作用下，将甲基添加在DNA分子中的碱基上，常见的DNA甲基化发生在DNA链上的胞嘧啶第五位碳原子和甲基间的共价结合，即形成5甲基胞嘧啶（5mC），哺乳动物基因组中约70%的5mC存在于CpG二联核苷。DNA甲基化影响着基因的转录表达，因此它在基因的表达调控、细胞增殖、分化发育等方面起着重要作用，并与肿瘤的发生密切相关。但DNA甲基化的检测比较困难，近年来随着技术的进步，检测甲基化的方法也逐渐多起来，甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MS-PCR）就是其中一种快速敏感的甲基化检测方法。其特异性高，操作相对简便，费用和耗时都较小，可以进行超微量分析和同源基因分析。但在实验过程中也有很多因素可影响甲基化特异性PCR的分析结果。触指

进行MS-PCR的第一步是提取目的DNA，这一步的关键是提取的基因组DNA应是完整的，纯度要尽量高，要求A260/A280在1.8~2.0之间，并且要准确测定DNA的浓度以利于下一步的修饰。

放气阀MS-PCR的第二步是进行亚硫酸氢钠（Sodium bisulfite）修饰。亚硫酸氢钠对甲基化和非甲17ps8

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基化胞嘧啶的化学活性不同，它可将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，尿嘧啶经PCR扩增克隆转变为胸腺嘧啶，而产生A-T配对，但亚硫酸氢钠不能转变甲基化的胞嘧啶，这样甲基化状态不同的DNA片段就可转化为有碱基序列差异的2个片段，从而能被鉴别出来。亚硫酸氢钠修饰过程中的许多因素都可能影响MSP。主要应注意以下几方面：（1）所有试剂需在使用前新鲜配制。（2）亚硫酸氢钠溶液的pH值须用3MNaOH精确调至5.0，否则会影响后续的纯化吸收，使用亚硫酸氢钠处理DNA时还应注意避光。（3）DNA模板的量不一定十分精确，可稍多，因为在纯化回收步骤中可能有丢失，有研究用到4 ?滋g DNA[1]，但DNA的量也不能过多，否则会导致DNA处理不完全。（4）亚硫酸氢钠修饰DNA时，反应温度控制在50~55 ℃，修饰时间掌握在8~16小时，一般在10小时以上，修饰时间过短使修饰不完全，修饰时间过长（超过16小时）会使甲基化胞嘧啶也转化为尿嘧啶并且使DNA模板的破坏加剧。（5）回收修饰后的DNA时，如果模板DNA较少，可加入适量鲑鱼精DNA或糖原作为载体促进DNA沉淀。（6）在用双蒸水或TE buffer溶解回收修饰后的DNA前，要使其内的乙醇充分挥发完。（7）修饰后的DNA为单链易降解，-20 ℃贮存不能超过2个月，最好是修饰后短期内使用，若要贮存建议最好放入-70 ℃无线发射电路冰箱中。

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