一种基于铜离子络合显反应检测丝素蛋白的比免疫传感器及方法

1.本发明涉及文物检测技术领域，尤其涉及一种基于铜离子络合显反应检测丝素蛋白的比免疫传感器及方法。

背景技术：

2.中国是最早开始养蚕、缫丝、织绸的国家，而且在西汉时期，张骞出使西域，开辟了举世闻名的“丝绸之路”，商贸上的往来不仅带来了经济的繁荣，还沟通了中西方文化的传播与交流。时至今日，越来越多的丝绸文物从墓葬中被发掘出来，对它们进行探索研究，不仅是我们了解当时纺织织造技术的重要实物证据，也对当时社会发展状况和人文环境有重要的参考价值。
3.丝织品中主要成分为蛋白质，其所处的地下环境较为复杂，受杂质干扰影响较大。表征古代丝织品的传统检测方法，基本只适用于现存保存较为完好的丝绸文物样品。大部分丝织品在出土时就已经部分泥化，失去其原有的完整结构，甚至降解成小分子的肽段，而且复杂多样的土壤环境会使得样品中含有大量的杂质，这些都会影响传统检测方法的精确度。
4.比免疫传感器是在一定介质上发生抗原-抗体特异性免疫识别反应引起该介质呈现具有比分析的特性的传感器。该方法与常用的分析检测技术，如傅里叶红外光谱，拉曼光谱，x-衍射分析、质谱相比，对微痕迹类文物残留物进行分析时，更快速简单高效、灵敏度高、特异性强。但是目前在检测丝织品文物中还尚未有见应用报道。因此，有必要开发出一款专门针对于丝织品文物检测的比免疫传感器。

技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于铜离子络合显反应检测丝素蛋白的比免疫传感器及方法。本发明比免疫传感器通过磁珠表面的抗体和氧化铜钠米粒子的抗体与抗原发生结合反应，用稀酸处理后铜离子配位络合显实现对丝素蛋白的定性及定量检测。
6.本发明的具体技术方案为：
7.第一方面，本发明提供了一种基于铜离子络合显反应检测丝素蛋白的比免疫传感器，包括铜离子显剂、纳米氧化铜抗体探针分散液和羧基化磁珠免疫探针分散液。其中：
8.所述铜离子显剂的制备方法包括：将2-肼吡啶和1，2-二苯基乙二酮分别溶解于无水乙醇中，随后将含有1，2-二苯基乙二酮的乙醇溶液缓慢滴加至含有2-肼吡啶的乙醇溶液中，回流加热反应，反应完成后将所得产物冷却至室温，真空蒸发溶剂，得到重结晶的黄固体产物铜离子配合物；将tris-hcl和四氢呋喃混合作为溶剂，配制得到铜离子显剂，冷藏保存。
9.所述纳米氧化铜抗体探针分散液的制备方法包括：取纳米氧化铜颗粒溶解于磷酸盐缓冲液中，室温下超声处理；加入兔抗丝素蛋白血清并摇晃；然后将所得混合物离心处理，去除上清液以去除未与纳米氧化铜颗粒结合的抗体；然后将与丝素蛋白抗体结合的纳米氧化铜颗粒重新分散在磷酸盐缓冲液中，离心，收集上清液，加入抗体封闭液并将摇晃，得到抗体功能化的纳米氧化铜粒子分散液。
10.所述羧基化磁珠免疫探针分散液的制备方法包括：移取羧基化磁珠到微离心管中，用移液将磁珠用含有tween20的磷酸盐缓冲液清洗，洗涤多次后，将磁珠重悬于磷酸盐缓冲液中，得到磁珠分散体；将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺加入到mes缓冲液中，并将其移入磁珠分散体中，孵育；对所得孵育物用含有tween20的磷酸盐洗涤缓冲液洗涤多次，并在磷酸盐洗涤缓冲液中分散，然后加入鼠抗丝素蛋白抗体，孵育；加入抗体封闭液，并在振荡器上震荡以封闭多余的活性位点；最后用磁分离液和含tween20的磷酸盐缓冲液清洗多次，将所得羧基化磁珠免疫探针重悬于磷酸盐缓冲液中，得到羧基化磁珠免疫探针分散液，冷藏保存。
11.作为优选，所述铜离子显剂的制备方法具体包括：将1.0-1.2mg的2-肼吡啶和2.0-2.2mg的1，2-二苯基乙二酮分别溶解于18-22ml无水乙醇中，随后将含有1，2-二苯基乙二酮的乙醇溶液缓慢滴加至含有2-肼吡啶的乙醇溶液中，回流加热反应2-4h，反应完成后将所得产物冷却至室温，真空蒸发溶剂，得到重结晶的黄固体产物铜离子配合物；将45-55mm的tris-hcl和四氢呋喃按照1：8-10的体积比混合作为溶剂，配制得到8-12μm的铜离子显剂，冷藏保存。
12.作为优选，所述纳米氧化铜抗体探针分散液的制备方法具体包括：取2-4mg纳米氧化铜颗粒溶解于1.3-1.7ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中，室温下超声处理6-10h；加入180-220μl兔抗丝素蛋白血清并摇晃5-6h；然后将所得混合物于高速离心机中以11000-12000rpm的转速离心15-25min，去除上清液以去除未与纳米氧化铜颗粒结合的抗体；然后将与丝素蛋白抗体结合的纳米氧化铜颗粒重新分散在1.3-1.7ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中，以800-1200rpm离心6-10min，收集上清液，加入250-350μl抗体封闭液并将摇晃0.5-1.5h，得到抗体功能化的纳米氧化铜粒子分散液。
13.作为优选，所述羧基化磁珠免疫探针分散液的制备方法具体包括：移取8-12μl45-55mg/ml的羧基化磁珠到1.3-1.7ml微离心管中，用移液将磁珠用含有0.03-0.07wt％tween20的250-350μl磷酸盐缓冲液清洗，洗涤多次后，将磁珠重悬于250-350μl ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得到磁珠分散体。
14.将14.5-14.7mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和5.3-5.5mg n-羟基丁二酰亚胺加入到8-12ml ph＝6.0的mes缓冲液中，并将其移入磁珠分散体中，在35-39℃下孵育35-45min。
15.对所得孵育物用含有0.03-0.07wt％tween20的磷酸盐洗涤缓冲液洗涤多次，并在250-350μl ph＝7.4的磷酸盐洗涤缓冲液中分散，然后加入35-45μl浓度为0.8-1.2mg/ml的鼠抗丝素蛋白抗体，在35-39℃下孵育80-100min；加入80-120μl抗体封闭液，并在振荡器上震荡0.5-1.5h以封闭多余的活性位点；最后用磁分离液和含0.03-0.07wt％tween20的磷酸盐缓冲液清洗多次，将所得羧基化磁珠免疫探针重悬于450-550μl ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得到羧基化磁珠免疫探针分散液，冷藏保存。
16.第二方面，本发明提供了一种利用上述比免疫传感器定量检测丝素蛋白的方法，包括以下步骤：
17.a)标准曲线的建立：将羧基化磁珠免疫探针分散液分别与含有不同浓度丝素蛋白的磷酸盐缓冲液在离心管中混合均匀，孵育活化，磁分离后，用含有tween-20的磷酸盐洗涤缓冲溶液重复洗涤多次，除去上清液，加入抗体功能化的氧化纳米铜探针分散液，在振荡器上室温震荡混合反应，得到免疫复合物；随后用含有tween20的磷酸盐缓冲溶液和tris-hcl缓冲液分别洗涤经过震荡混合和磁分离所得到的免疫复合物多次，向清洗后的免疫复合物缓慢滴加盐酸溶液以使纳米氧化铜中的铜离子游离出来，最后向所得混合溶液中加入铜离子显剂，室温静置后，取上清液进行紫外可见光吸光度检测，获得对应不同浓度丝素蛋白的吸光度，以此数据建立标准曲线。
18.b)待检物的检测：与步骤a)的区别在于，将待检物替换含有不同浓度丝素蛋白的磷酸盐缓冲液；然后在测得吸光度后，将吸光度数据代入标准曲线中，获得丝素蛋白浓度。
19.作为优选，所述标准曲线的建立具体包括：将70-90μl羧基化磁珠免疫探针分散液分别与90-110μl含有不同浓度丝素蛋白的ph＝7.4的磷酸盐缓冲液在离心管中混合均匀，在35-39℃下孵育活化30-50min，磁分离后，用含有0.03-0.07wt％tween-20的磷酸盐洗涤缓冲溶液重复洗涤多次，除去上清液，加入150～300μl抗体功能化的氧化纳米铜探针分散液，在振荡器上室温震荡混合反应8-12min，得到免疫复合物；随后用含有0.03-0.07wt％tween20的磷酸盐缓冲溶液和ph＝7.4的tris-hcl缓冲液分别洗涤经过震荡混合和磁分离所得到的免疫复合物多次，向清洗后的免疫复合物缓慢滴加20～50μl 0.08-0.12m的盐酸溶液以使纳米氧化铜中的铜离子游离出来，最后向所得混合溶液中加入150～300μl铜离子显剂，室温静置3-7min后，取上清液进行紫外可见光吸光度检测，获得对应不同浓度丝素蛋白的吸光度，以此数据建立标准曲线。
20.与现有技术对比，本发明的有益效果是：
21.1)本发明构建了基于铜离子显的比免疫传感器，通过磁珠表面的抗体和氧化铜钠米粒子的抗体对于抗原的结合反应，用稀酸处理后铜离子配位络合显实现建立丝素蛋白的标准检测体系，加入了颜分辨更为方便快捷，将其首次用于丝织品文物的微痕检测。
22.2)免疫学和传感技术的双重融合：提高了对古代丝织物的微痕鉴定的准确性，可实现定性和定量检测文物中的丝素蛋白含量。
附图说明
23.图1(a)为实施例1制备的显剂和探针的照片及紫外可见光吸光度图；
24.图1(b)为实施例1制备的比免疫传感器使用浓度为100ng/ml的丝素蛋白分析时，复合物经过稀酸处理前后的紫外可见光吸光度变化图。
具体实施方式
25.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
26.实施例1
27.一种基于铜离子络合显反应检测丝素蛋白的比免疫传感器，包括铜离子显
剂、纳米氧化铜抗体探针分散液和羧基化磁珠免疫探针分散液。其中：
28.铜离子显剂的制备：将1.1mg的2-肼吡啶和2.1mg的1，2-二苯基乙二酮分别溶解于20ml无水乙醇中，随后将含有1，2-二苯基乙二酮的20ml乙醇溶液缓慢滴加至含有2-肼吡啶的乙醇溶液中，回流加热反应3h，反应完成后将所得产物冷却至室温，真空蒸发溶剂，得到重结晶的黄固体产物铜离子配合物；将50mm的tris-hcl(ph＝7.4)和四氢呋喃按照1∶9的体积比混合作为溶剂，配制得到10μm的铜离子显剂，4℃冷藏保存。
29.纳米氧化铜抗体探针分散液的制备：取3mg纳米氧化铜颗粒溶解于1.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中，室温下超声处理8h；加入200μl兔抗丝素蛋白血清并摇晃6h；然后将所得混合物于高速离心机中以11000rpm的转速离心20min，去除上清液以去除未与纳米氧化铜颗粒结合的抗体；然后将与丝素蛋白抗体结合的纳米氧化铜颗粒重新分散在1.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中，以1000rpm离心8min，收集上清液，加入300μl抗体封闭液并将摇晃1h，得到抗体功能化的纳米氧化铜粒子分散液。
30.羧基化磁珠免疫探针分散液的制备：移取10μl 50mg/ml的羧基化磁珠到1.5ml微离心管中，用移液将磁珠用含有0.05wt％tween20的300μl磷酸盐缓冲液清洗，洗涤多次后，将磁珠重悬于300μl ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得到磁珠分散体。
31.将14.59mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和5.41mg n-羟基丁二酰亚胺加入到10ml ph＝6.0的mes缓冲液中，并将其移入磁珠分散体中，在37℃下孵育40min。
32.对所得孵育物用含有0.05wt％tween20的磷酸盐洗涤缓冲液洗涤多次，并在300μl ph＝7.4的磷酸盐洗涤缓冲液中分散，然后加入40μl浓度为1.0mg/ml的鼠抗丝素蛋白抗体，在37℃下孵育90min；加入100μl抗体封闭液，并在振荡器上震荡1h以封闭多余的活性位点；最后用磁分离液和含0.05wt％tween20的磷酸盐缓冲液清洗多次，将所得羧基化磁珠免疫探针重悬于500μl ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得到羧基化磁珠免疫探针分散液，冷藏保存。
33.利用上述比免疫传感器定量检测丝素蛋白的方法：
34.a)标准曲线的建立：将80μl羧基化磁珠免疫探针分散液分别与100μl含有不同浓度(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)丝素蛋白的ph＝7.4的磷酸盐缓冲液在离心管中混合均匀，在37℃下孵育活化40min，磁分离后，用含有0.05wt％tween-20的磷酸盐洗涤缓冲溶液重复洗涤多次，除去上清液，加入150μl抗体功能化的氧化纳米铜探针分散液，在振荡器上室温震荡混合反应10min，得到免疫复合物；随后用含有0.05wt％tween20的磷酸盐缓冲溶液和ph＝7.4的tris-hcl缓冲液分别洗涤经过震荡混合和磁分离所得到的免疫复合物多次，向清洗后的免疫复合物缓慢滴加20μl 0.1m的盐酸溶液以使纳米氧化铜中的铜离子游离出来，最后向所得混合溶液中加入150μl铜离子显剂，室温静置5min后，取上清液进行紫外可见光吸光度检测，获得对应不同浓度丝素蛋白的吸光度(如下表所示)，以此数据建立标准曲线。
35.[0036][0037]
所得标准曲线为：y＝(0.1664
±
0.0035)log c+(0.3818
±
0.0064)r2＝0.9973，c(ng/ml)。
[0038]
b)待检物的检测：参照步骤a)的方法，检测待检物的吸光度，将该吸光度数据代入标准曲线中，获得丝素蛋白浓度。
[0039]
实施例1制备的显剂和探针如图1(a)所示，铜离子溶液趋于无，dphe显剂溶液趋于淡黄，而两者配合物的溶液呈现红。紫外可见光吸收光谱图可看出，dphe在332nm有一个特征峰；而铜离子溶液在300-600nm的范围内是一个较为光滑的曲线，没有明显吸收峰；将dphe和铜离子溶液混合后，在400-600nm的范围内出现了502nm这一唯一且强度较高的特征峰。制备的比免疫传感器使用浓度为100ng/ml的丝素蛋白分析时，复合物经过稀酸处理后，在502nm出现较强的吸收峰在加入盐酸后得到的紫外可见光吸光度，如图1(b)所示。
[0040]
实施例2
[0041]
一种基于铜离子络合显反应检测丝素蛋白的比免疫传感器，包括铜离子显剂、纳米氧化铜抗体探针分散液和羧基化磁珠免疫探针分散液。其中：
[0042]
铜离子显剂的制备：将1.5mg的2-肼吡啶和2.5mg的1，2-二苯基乙二酮分别溶解于20ml无水乙醇中，随后将含有1，2-二苯基乙二酮的20ml乙醇溶液缓慢滴加至含有2-肼吡啶的乙醇溶液中，回流加热反应4h，反应完成后将所得产物冷却至室温，真空蒸发溶剂，得到重结晶的黄固体产物铜离子配合物；将50mm的tris-hcl(ph＝7.4)和四氢呋喃按照1∶9的体积比混合作为溶剂，配制得到10μm的铜离子显剂，4℃冷藏保存。
[0043]
纳米氧化铜抗体探针分散液的制备：取4mg纳米氧化铜颗粒溶解于1.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中，室温下超声处理10h；加入200μl兔抗丝素蛋白血清并摇晃6h；然后将所得混合物于高速离心机中以12000rpm的转速离心20min，去除上清液以去除未与纳米氧化铜颗粒结合的抗体；然后将与丝素蛋白抗体结合的纳米氧化铜颗粒重新分散在1.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中，以1000rpm离心8min，收集上清液，加入300μl抗体封闭液并将摇晃1h，得到抗体功能化的纳米氧化铜粒子分散液。
[0044]
羧基化磁珠免疫探针分散液的制备：移取10μl 50mg/ml的羧基化磁珠到1.5ml微离心管中，用移液将磁珠用含有0.05wt％tween20的300μl磷酸盐缓冲液清洗，洗涤多次后，将磁珠重悬于300μl ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得到磁珠分散体。
[0045]
将14.59mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和5.41mg n-羟基丁二酰亚胺加入到10ml ph＝6.0的mes缓冲液中，并将其移入磁珠分散体中，在37℃下孵育40min。
[0046]
对所得孵育物用含有0.05wt％tween20的磷酸盐洗涤缓冲液洗涤多次，并在300μl ph＝7.4的磷酸盐洗涤缓冲液中分散，然后加入40μl浓度为1.0mg/ml的鼠抗丝素蛋白抗体，在37℃下孵育90min；加入100μl抗体封闭液，并在振荡器上震荡1h以封闭多余的活性位点；最后用磁分离液和含0.05wt％tween20的磷酸盐缓冲液清洗多次，将所得羧基化磁珠免疫探针重悬于500μl ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得到羧基化磁珠免疫探针分散液，冷藏保
存。
[0047]
实施例3
[0048]
一种基于铜离子络合显反应检测丝素蛋白的比免疫传感器，包括铜离子显剂、纳米氧化铜抗体探针分散液和羧基化磁珠免疫探针分散液。其中：
[0049]
铜离子显剂的制备：将1.3mg的2-肼吡啶和2.3mg的1，2-二苯基乙二酮分别溶解于20ml无水乙醇中，随后将含有1，2-二苯基乙二酮的20ml乙醇溶液缓慢滴加至含有2-肼吡啶的乙醇溶液中，回流加热反应4h，反应完成后将所得产物冷却至室温，真空蒸发溶剂，得到重结晶的黄固体产物铜离子配合物；将50mm的tris-hcl(ph＝7.4)和四氢呋喃按照1：9的体积比混合作为溶剂，配制得到10μm的铜离子显剂，4℃冷藏保存。
[0050]
纳米氧化铜抗体探针分散液的制备：取4mg纳米氧化铜颗粒溶解于1.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中，室温下超声处理10h；加入200μl兔抗丝素蛋白血清并摇晃6h；然后将所得混合物于高速离心机中以12000rpm的转速离心20min，去除上清液以去除未与纳米氧化铜颗粒结合的抗体；然后将与丝素蛋白抗体结合的纳米氧化铜颗粒重新分散在1.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中，以1000rpm离心8min，收集上清液，加入300μl抗体封闭液并将摇晃1h，得到抗体功能化的纳米氧化铜粒子分散液。
[0051]
羧基化磁珠免疫探针分散液的制备：移取10μl 50mg/ml的羧基化磁珠到1.5ml微离心管中，用移液将磁珠用含有0.05wt％tween20的300μl磷酸盐缓冲液清洗，洗涤多次后，将磁珠重悬于300μl ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得到磁珠分散体。
[0052]
将14.59mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和5.41mg n-羟基丁二酰亚胺加入到10ml ph＝6.0的mes缓冲液中，并将其移入磁珠分散体中，在37℃下孵育40min。
[0053]
对所得孵育物用含有0.05wt％tween20的磷酸盐洗涤缓冲液洗涤多次，并在300μl ph＝7.4的磷酸盐洗涤缓冲液中分散，然后加入40μl浓度为1.0mg/ml的鼠抗丝素蛋白抗体，在37℃下孵育90min；加入100μl抗体封闭液，并在振荡器上震荡1h以封闭多余的活性位点；最后用磁分离液和含0.05wt％tween20的磷酸盐缓冲液清洗多次，将所得羧基化磁珠免疫探针重悬于500μl ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得到羧基化磁珠免疫探针分散液，冷藏保存。
[0054]
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0055]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：

1.一种基于铜离子络合显反应检测丝素蛋白的比免疫传感器，其特征在于：包括铜离子显剂、纳米氧化铜抗体探针分散液和羧基化磁珠免疫探针分散液；其中：所述铜离子显剂的制备方法包括：将2-肼吡啶和1,2-二苯基乙二酮分别溶解于无水乙醇中，随后将含有1,2-二苯基乙二酮的乙醇溶液缓慢滴加至含有2-肼吡啶的乙醇溶液中，回流加热反应，反应完成后将所得产物冷却至室温，真空蒸发溶剂，得到重结晶的黄固体产物铜离子配合物；将tris-hcl和四氢呋喃混合作为溶剂，配制得到铜离子显剂，冷藏保存；所述纳米氧化铜抗体探针分散液的制备方法包括：取纳米氧化铜颗粒溶解于磷酸盐缓冲液中，室温下超声处理；加入兔抗丝素蛋白血清并摇晃；然后将所得混合物离心处理，去除上清液以去除未与纳米氧化铜颗粒结合的抗体；然后将与丝素蛋白抗体结合的纳米氧化铜颗粒重新分散在磷酸盐缓冲液中，离心，收集上清液，加入抗体封闭液并将摇晃，得到抗体功能化的纳米氧化铜粒子分散液；所述羧基化磁珠免疫探针分散液的制备方法包括：移取羧基化磁珠到微离心管中，用移液将磁珠用含有tween20的磷酸盐缓冲液清洗，洗涤多次后，将磁珠重悬于磷酸盐缓冲液中，得到磁珠分散体；将1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺加入到mes缓冲液中，并将其移入磁珠分散体中，孵育；对所得孵育物用含有tween20的磷酸盐洗涤缓冲液洗涤多次，并在磷酸盐洗涤缓冲液中分散，然后加入鼠抗丝素蛋白抗体，孵育；加入抗体封闭液，并在振荡器上震荡以封闭多余的活性位点；最后用磁分离液和含tween20的磷酸盐缓冲液清洗多次，将所得羧基化磁珠免疫探针重悬于磷酸盐缓冲液中，得到羧基化磁珠免疫探针分散液，冷藏保存。2.如权利要求1所述的比免疫传感器，其特征在于：所述铜离子显剂的制备方法具体包括：将1.0-1.2mg的2-肼吡啶和2.0-2.2mg的1,2-二苯基乙二酮分别溶解于18-22ml无水乙醇中，随后将含有1,2-二苯基乙二酮的乙醇溶液缓慢滴加至含有2-肼吡啶的乙醇溶液中，回流加热反应2-4h，反应完成后将所得产物冷却至室温，真空蒸发溶剂，得到重结晶的黄固体产物铜离子配合物；将45-55mm的tris-hcl和四氢呋喃按照1:8-10的体积比混合作为溶剂，配制得到8-12μm的铜离子显剂，冷藏保存。3.如权利要求1所述的比免疫传感器，其特征在于：所述纳米氧化铜抗体探针分散液的制备方法具体包括：取2-4mg纳米氧化铜颗粒溶解于1.3-1.7ml ph=7.4的磷酸盐缓冲液中，室温下超声处理6-10h；加入180-220μl兔抗丝素蛋白血清并摇晃5-6h；然后将所得混合物于高速离心机中以11000-12000rpm的转速离心15-25min，去除上清液以去除未与纳米氧化铜颗粒结合的抗体；然后将与丝素蛋白抗体结合的纳米氧化铜颗粒重新分散在1.3-1.7ml磷酸盐缓冲液(ph=7.4)中，以800-1200rpm离心6-10min，收集上清液，加入250-350μl抗体封闭液并将摇晃0.5-1.5h，得到抗体功能化的纳米氧化铜粒子分散液。4.如权利要求1所述的比免疫传感器，其特征在于：所述羧基化磁珠免疫探针分散液的制备方法具体包括：移取8-12μl 45-55mg/ml的羧基化磁珠到1.3-1.7ml微离心管中，用移液将磁珠用含有0.03-0.07wt% tween20的250-350μl磷酸盐缓冲液清洗，洗涤多次后，将磁珠重悬于250-350μl ph=7.4的磷酸盐缓冲液中，得到磁珠分散体；将14.5-14.7mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和5.3-5.5mg n-羟基丁二酰亚胺加入到8-12ml ph=6.0的mes缓冲液中，并将其移入磁珠分散体中，在35-39℃下孵
育35-45min；对所得孵育物用含有0.03-0.07wt% tween20的磷酸盐洗涤缓冲液洗涤多次，并在250-350μl ph=7.4的磷酸盐洗涤缓冲液中分散，然后加入35-45μl浓度为0.8-1.2mg/ml的鼠抗丝素蛋白抗体，在35-39℃下孵育80-100min；加入80-120μl抗体封闭液，并在振荡器上震荡0.5-1.5h以封闭多余的活性位点；最后用磁分离液和含0.03-0.07wt% tween20的磷酸盐缓冲液清洗多次，将所得羧基化磁珠免疫探针重悬于450-550μl ph=7.4的磷酸盐缓冲液中，得到羧基化磁珠免疫探针分散液，冷藏保存。5.一种利用权利要求1-4之一所述比免疫传感器定量检测丝素蛋白的方法，其特征在于：a）标准曲线的建立：将羧基化磁珠免疫探针分散液分别与含有不同浓度丝素蛋白的磷酸盐缓冲液在离心管中混合均匀，孵育活化，磁分离后，用含有tween-20的磷酸盐洗涤缓冲溶液重复洗涤多次，除去上清液，加入抗体功能化的氧化纳米铜探针分散液，在振荡器上室温震荡混合反应，得到免疫复合物；随后用含有tween20的磷酸盐缓冲溶液和tris-hcl缓冲液分别洗涤经过震荡混合和磁分离所得到的免疫复合物多次，向清洗后的免疫复合物缓慢滴加盐酸溶液以使纳米氧化铜中的铜离子游离出来，最后向所得混合溶液中加入铜离子显剂，室温静置后，取上清液进行紫外可见光吸光度检测，获得对应不同浓度丝素蛋白的吸光度，以此数据建立标准曲线；b）待检物的检测：与步骤a）的区别在于，将待检物替换含有不同浓度丝素蛋白的磷酸盐缓冲液；然后在测得吸光度后，将吸光度数据代入标准曲线中，获得丝素蛋白浓度。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述标准曲线的建立具体包括：将70-90μl羧基化磁珠免疫探针分散液分别与90-110μl含有不同浓度丝素蛋白的ph=7.4的磷酸盐缓冲液在离心管中混合均匀，在35-39℃下孵育活化30-50min，磁分离后，用含有0.03-0.07wt% tween-20的磷酸盐洗涤缓冲溶液重复洗涤多次，除去上清液，加入150~300μl抗体功能化的氧化纳米铜探针分散液，在振荡器上室温震荡混合反应8-12min，得到免疫复合物；随后用含有0.03-0.07wt% tween20的磷酸盐缓冲溶液和ph=7.4的tris-hcl缓冲液分别洗涤经过震荡混合和磁分离所得到的免疫复合物多次，向清洗后的免疫复合物缓慢滴加20~50μl 0.08-0.12m的盐酸溶液以使纳米氧化铜中的铜离子游离出来，最后向所得混合溶液中加入150~300μl铜离子显剂，室温静置3-7min后，取上清液进行紫外可见光吸光度检测，获得对应不同浓度丝素蛋白的吸光度，以此数据建立标准曲线。

技术总结

本发明涉及文物检测技术领域，公开了一种基于铜离子络合显反应检测丝素蛋白的比免疫传感器及方法。该比免疫传感器包括铜离子显剂、纳米氧化铜抗体探针分散液和羧基化磁珠免疫探针分散液。本发明构建了基于铜离子显的比免疫传感器，通过磁珠表面的抗体和氧化铜钠米粒子的抗体对于抗原的结合反应，用稀酸处理后铜离子配位络合显实现建立丝素蛋白的标准检测体系，加入了颜分辨更为方便快捷，将其首次用于丝织品文物的微痕检测，可实现对文物中丝素蛋白的定性及定量检测。实现对文物中丝素蛋白的定性及定量检测。实现对文物中丝素蛋白的定性及定量检测。