目的：本实验系将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染。 一、进入无菌室前准备
工作人员进入无菌室前，必须用消毒液或肥皂洗手消毒，然后在缓冲间更换专用工作服、鞋或鞋套、帽子、口罩和手套，双手再用75%的酒精消毒，方可进入操作间操作。
二、进入无菌室
1、无菌室灭菌：无菌室应在每周和每次操作前用75%酒精或0.1%新洁尔灭擦拭工作台面及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外灯1h。在每次操作完毕，同样使用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌不少于半小时。
2、工作台面沉降菌检测：取直径为90mm的培养皿，注入融化的营养琼脂培养基20ml，30-50℃培养48h证明无菌后，取3只培养皿在无菌操作台或超净工作台平均位置打开上盖，暴露
30min后盖好置30-35℃培养48h后取出检查。3只培养皿上生长的菌落数应不超过1个（百级清洁度要求）。 实验所用仪器：超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪、恒温水浴锅、电热干燥箱等。
aa187 实验用具：试管、注射器、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管、精密pH试纸、集菌培养器、剪刀、镊子、无菌衣、口罩、灭菌袋或牛皮纸等。
无人机控制系统3、与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min，或支电热干燥箱内160℃2h。
三、无菌检查过程
1、培养基的制备：市售脱水培养基按说明书配制、灭菌。保存在2-25℃、避光环境。非密闭容器中一般在3周内使用，密闭容器中一般在1年内使用。
2、培养基的适用性检查
1）无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支，培养14天，应无菌生长。
2）灵敏度检查：a选取菌种，其传代次数不超过5代；
b菌液制备：接种金葡、铜绿、枯草的新鲜培养物（斜面）至营养肉汤培养基30-35℃培养18-24h；生孢的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃培养18-24h；白念的新鲜培养物至改良马丁培养基23-28℃培养24-48h；黑曲的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基23-28℃培养5-7d。
c培养基接种：
金葡2支 白念2支
硫乙醇酸盐 铜绿2支 改良马丁 黑曲2支
流体培养基 枯草2支 培养基 空白对照1支
（12ml） 生孢2支 （9ml）
空白对照1支
结果判定：空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判定培养基的灵敏度检查符合规定。
2、稀释液、冲洗液
稀释液、冲洗液配置后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
常用有：0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。（若需要可在灭菌前加入表面活性剂或中和剂）
3、方法验证试验
当建立产品的无菌检查法时，应进行方法学验证，以证明所采用的的方法适合
于该产品的无菌检查。若产品组分或原检查条件发生改变时，检查方法应重新
验证。验证时按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。
1）菌种及菌液的制备，培养基抑菌性检查（删除铜绿增订大肠埃希菌）
2）薄膜过滤法：规定量的供试品——过滤——冲洗——加入试验菌——过滤
▲每种菌做1管不含供试品管作为对照
3）直接接种法
▲硫乙醇酸盐流体培养基： ▲改良马丁培养基
金葡菌2管 白念2管
大肠埃希菌2管 黑曲2管
枯草2管
生孢2管
（每种实验菌均做一管接入规定量的供试品，另一管作为对照）
试验管：培养基+供试品+对应菌
阳性对照管：培养基+对应菌
阴性对照管：培养基+稀释液
检测管：培养基+供试品
（试验管、阳性对照管实验菌应生长良好，检测管阴性对照管应无菌生长）
4）结果判定复合硅微粉
空心魔方与对照管比较，如含供试品的各管中的实验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可忽略不计。
4、供试品的无菌检验
1）实验前准备：培养基移入前编号，消毒液（酒精、新洁尔灭）擦拭瓶（管）外壁。
2）检验数量：一般情况，若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作为阳性对
照用；直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作为阳性对照用。
3）检验量在：指一次实验所用的供试品总量（g或ml）。不管采用什么方法，若每支供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐和改良马丁培养基。
4）阳性对照：培养基+对应菌+供试品 培养48-72h应生长良好。
5）阴性对照；（供试品无菌检查，取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作）
阴性对照应无菌生长。
5、供试品的处理及接种培养基
1）薄膜过滤法 应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可用一般薄膜过滤器。
无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45um，直径约为50mm。
供试液的制备：
a管类器具，按管内表面积没10cm2 流过管内腔1ml浸提介质，流量约为10ml/min；b容器类器具，按容器内表面积每10cm2 加入 浸提介质1ml，振摇数次；
c实体类器具，按表面积每10cm2 加入 浸提介质1ml，振摇数次。
（供试液的制备应按无菌操作法进行，制备后2h内使用。）
2）直接接种法
硫乙醇酸盐流体培养基 每管装量不少于15ml 供试品体积不得大于培养基体
改良马丁培养基 每管装量不少于15ml 积的10%
a敷料供试品：取规定数量以无菌操作拆开包装，于不同部位剪取约100mg或1cm*3cm的供试品接种于各管足以浸没供试品的培养基中。
b肠线、缝合线等供试品：按规定量取量最小包装，接种于各管足以浸没供试品的适
量培养基中。
c灭菌医用器具供试品：取规定量必要时应将其拆开后切成小碎段，接种。
（取上述制备的供试品，在近火焰上以右手握拳，小指为主拨开培养基管的塞子管口通过火焰，移到火焰下侧，沿着培养基管壁接入供试品，轻轻摇匀。）
*阴性对照，取个培养基各1管，以0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品。
*阳性对照，取硫乙醇酸盐流体培养基1管，接入供试品，再接入小于100cfu金葡菌。
3）培养及观察
按规定温度培养14天。
电子蜡烛灯
培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。
结果：艾盒 澄清 无菌生长
浑浊 有菌生长（转种同种新鲜培养基：观察是否长菌、浑浊；无法判定取
培养液涂片，染，镜检。）
4）结果判定
a阳性对照管生长良好，阴性对照管不得长菌，否则实验无效。
b若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。
c若供试品管中任何一管显浑浊并确认有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明实验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。
5）实验结果无效的判定
a无菌检查实验所用设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。
b回顾无菌检查过程，发现有可能引起微生物污染的因素。
c供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品或无菌技术操作不当引起的。
四、实验报告
实验报告中宜给出下列信息：
a供试品名称；
b生产批号和（或）灭菌日期；
c供试液制备方法；
d接种方式；
e每日观察结果；
f结果判定。
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