越来越多的科研学者使⽤⼆代测序（Next-Generation Sequencing）进⾏⾃⼰课题研究，很多科研⼈员选择将样本直接寄送到⼆代测序科服公司进⾏实验。很多⼈可能并不了解⽂库构建的完整流程，今天⼩编就给⼤家介绍⼏种常见⽂库构建的流程。
双向呼叫⼀. DNA建库流程：
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DNA建库的完整流程：
1. 基因组DNA⽚段化：由于⽬前测序仪读长有限，如双端各测150bp或75bp等，可采⽤酶打断和超声打断两种⽅式，酶打断操作更⽅便，更节 省时间，但⽬前酶打断还有⼀定的偏好性，超声打断还是主流打断⽅式；
2. 末端修复：打断后的DNA末端会有粘性末端，需要进⼀步补平成平末端；
4. 加接头：接头是⼀段固定序列，能够与芯⽚配对发⽣成簇反应，可分为长接头（index在接头上，index区分不同⽂库样本），短接头（index
通过PCR引⼊）；
5. 磁珠纯化：⼀般此步骤采取两步磁珠纯化，根据磁珠优先吸附⼤⽚段原理，通过使⽤不同体积磁珠，第⼀步磁珠纯化去除⼤⽚段，第⼆步磁珠
纯化去除⼩⽚段，从⽽得到合适⽚段长度⽂库；
6. PCR扩增：通过接头引物扩增富集⽂库；
7. 磁珠纯化：纯化⽂库；
8. ⽂库质检：⼀般先⽤Qubit进⾏⽂库定量，然后使⽤2100仪器进⾏⽂库⽚段分析，通过qPCR进⾏绝对定量，混样上机。
⼆、 mRNA建库流程：
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1. mRNA分离：mRNA的3’端有Poly A结构，利⽤Oligo dT磁珠将mRNA从总RNA中拉出来。mRNA建库对RNA质量要求较⾼，⼀般要求
RIN值⼤于7，RNA发⽣降解会引起只能捕获到mRNA 3’端信息，5’端信息会发⽣丢失；
2. mRNA⽚段化：⼀般使⽤Mg离⼦及⾼温打断，⽚段化长度与打断时间相关；
3. ⼀链⼆链合成：将mRNA先反转录成cDNA，再进⾏⼆链合成；陶瓷纤维棉
4. DNA建库：后续步骤和DNA建库步骤相同，只是不要打断步骤。
三、LncRNA建库流程
LncRNA建库流程与mRNA建库整体流程类似，只是第⼀步mRNA纯化改为rRNA去除，⽬前市⾯rRNA去除主要有四种⽅法：
1. 磁珠连接探针去除：通过碱基互补配对原理，对于rRNA序列有依耐性，不同物种使⽤不同探针类型；去除rRNA后后续建库流程与； image
2. DNA探针去除法I：根据rRNA序列设计特异性DNA探针，将探针与总RNA混合后进⾏退⽕延伸，rRNA会形成DNA/RNA双连结构，利⽤
RNAase H降解嵌合链中RNA，再⽤DNA酶降解DNA探针，剩下mRNA及LncRNA建库流程与mRNA建库流程⼀致，此法也是基于rRNA序列，不同物种使⽤不同探针；
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3. DNA探针去除法II：先⽤随机引物进⾏⼀链合成，按建库流程构建单链⽂库，特异性DNA探针能与rRNA单链⽂库退货延伸，形成双链结构，
储槽在反向接头上带有特殊酶切位点，⼀旦形成双链结构，酶切位点能够被酶识别，将接头切除，rRNA不带有完整接头，mRNA及LncRNA带有完整接头，通过接头引物富集的即是mRNA及LncRNA信息，此法也基于rRNA序列，不同物种使⽤不同探针；
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4. 变形退⽕法去除rRNA：此法是⽬前最新研发出来的rRNA去除⽅法，不过⽬前市场⽤户还不多，效果还有待进⼀步验证。先使⽤随机引物进⾏
⼀链合成，然后进⾏变性形成单链cDNA及单链RNA混合样本，加⼊特殊化学成分，能识别rRNA，促进rRNA与其对应的cDNA退⽕，⽽LcnRNA及mRNA则不会与cDNA退⽕，加⼊酶mix消化双链rRNA/cDNA，后⾯在进⾏常规的建库步骤。此原理不基于RNA序列，没有物种局限性。此原理还有待市场验证，如果效果理想将是rRNA去除突破性技术，可能会取代前三类rRNA去除技术。
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