中国临床神经外科杂志2021年1月第26卷第1期Chin J Clin Neurosurg,January 2021,Vol.26,No.1
【摘要】目的探讨长链非编码RNA MIR4435-2HG 的表达水平及甲基化状态与脑胶质瘤病理分级的关系。方法选取2019 年1~12月手术切除的脑胶质瘤组织110例和颅脑损伤内减压术中切除正常脑组织20例（对照组）。采用实时荧光定量PCR 和甲基化特异性PCR 检测组织和血清MIR4435-2HG 水平及甲基化状态。结果110例胶质瘤中，低级别胶质瘤（WHO 分级Ⅰ~Ⅱ级）65例，高级别胶质瘤（WHO 分级Ⅲ~Ⅳ级）55例；IDH1突变46例。脑胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG 表达水平均明显高于对照组（P <0.05），而甲基化率明显低于对照组（P <0.05）。低级别胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG 水平明显低于高级别胶质瘤（P<0.05），而甲基化率明显高于高级别胶质瘤（P <0.05）。IDH1突变型胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG 水平明显低于IDH1野生型（P <0.05），而甲基化率明显高于IDH1野生型（P <0.05）。MIR4435-2HG 甲基化组胶质瘤组织和血清MIR4435-2HG 水平明显低于非甲基化组（P <0.05）。ROC 曲线分析显示，血清MIR4435-2HG 水平鉴别脑胶质瘤级别的曲线下面积为0.752（95%置信区间0.701~0.804），最佳截断值为1.98，灵敏度和特异度分别为65.0%和91.5%。结论脑胶质瘤，尤其是高级别胶质瘤，血清MIR4435-2HG 表达水平普遍升高，检测血清MIR4435-2HG 水平有助于鉴别诊断脑胶质瘤级别。MIR4435-2HG 转录受其基因甲基化水平的调控，并且与IDH1突变有关。
【关键词】脑胶质瘤；长链非编码RNA ；MIR4435-2HG ；基因启动子甲基化；肿瘤病理分级【文章编号】1009-153X （2021）01-0028-03
【文献标志码】A凯膜过滤技术
【中国图书资料分类号】R 739.41;Q 786
视讯系统Relationship between expression level and methylation status of lncRNA MIR4435-2HG and pathological grade of gliomas
LUO Xiao-quan,TANG Hui,FENG Hao,CHEN Bing,SUN Mou.Department of Neurosurgery,Nanchong Central Hospital,Nanchong 637000,China
【Abstract 】Objective To investigate the relationship between expression level and methylation status of lncRNA MIR4435-2HG and pathological grade of gliomas.Methods The expression levels and methylation status of lncRNA MIR4435-2HG in glioma tissues and serum obtained from 110patients (glioma group)with gliomas who underwent microsurgery from January 2019to December 2019and in normal cerebral tissues and serum obtained from 20patients (control group)with traumatic brain injury who underwent decompression were detected by real-time fluoresc
ent quantitative PCR and methylation-specific PCR,respectively.Results Of 110glioma patients,65patients were low-grade gliomas (WHO grade Ⅰ~Ⅱ)and 55were high-grade gliomas (WHO grade Ⅲ~Ⅳ);46had IDH1mutations.The expression levels of MIR4435-2HG in glioma tissues and glioma patients'serum were significantly higher than those of the control group (P <0.05),and the methylation rates were significantly lower than those of the control group (P <0.05).The levels of MIR4435-2HG in glioma tissue and serum of low-grade glioma patients were significantly lower than those of high-grade glioma (P <0.05),and the methylation rates were significantly higher than those of high-grade glioma (P <0.05).The levels of MIR4435-2HG in glioma tissue and serum of IDH1mutant glioma patients were significantly lower than those of IDH1wild-type glioma (P <0.05),and the methylation rates were significantly higher than those of IDH1wild-type glioma (P <0.05).The levels of MIR4435-2HG in
glioma tissue and serum of the MIR4435-2HG methylated group were significantly lower than those in the non-methylated group (P <0.05).ROC curve analysis showed that the area under curve for serum MIR4435-2HG levels to identify the grade of glioma was 0.752
(95%CI 0.701~0.804);the best cutoff value was 1.98;the sensitivity and specificity were 65.0%and 91.5%,respectively.Conclusions The expression level of serum MIR4435-2HG is generally elevated i
绞车滚筒n glioma patients,especially high-grade gliomas.The serum level of MIR4435-2HG is helpful for the differential diagnosis of glioma grades.The transcription of MIR4435-2HG is regulated by its gene methylation level and is related to IDH1mutation of glioma.
虚拟试衣技术【Key words 】Glioma;LncRNAMIR4435-2HG;Methylation;Pathological grade;IDH1
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论著
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lncRNA MIR4435-2HG 的表达水平及甲基化状态与
脑胶质瘤病理分级的关系
罗孝全
唐
辉
冯
浩
陈
兵
孙
谋
脑胶质瘤在临床组织学和遗传学上都具有较高
的异质性，例如低级别胶质瘤普遍存在异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenases 1，IDH1）突变[1]。
doi:10.13798/j.issn.1009-153X.2021.01.009
作者单位：637000四川，南充市中心医院神经外科（罗孝全、唐辉、
冯
浩、陈
兵、孙
谋）
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中国临床神经外科杂志2021年1月第26卷第1期Chin J Clin Neurosurg,January2021,Vol.26,No.1
lncRNA MIR4435-2H是一种新的致癌基因[2]。本文探讨lncRNA MIR4435-2HG的表达水平及甲基化状态与脑胶质瘤病理分级的关系。
1资料与方法理疗环
1.1标本来源选取2019年1~12月手术切除的脑胶质瘤组织110例，其中男51例，女59例；中位年龄52岁；低级别胶质瘤（WHO分级Ⅰ~Ⅱ级）65例，高级别胶质瘤（WHO分级Ⅲ~Ⅳ级）55例；IDH1突变46例。另外选取颅脑损伤内减压术中切除正常脑组织20例为对照，其中男13例，女7例；中位年龄50岁。本研究经我院医学伦理委员的批准。
1.2实时荧光定量PCR法检测MIR4435-2HG表达术中获取组织标本迅速置于液氮中，24h后放到-80℃长期保存。另外，所有病人初诊时采集血液样本，留取血清，置于-80℃保存。使用QIAamp Min⁃Elute Virus Spin试剂盒和Qiamp DNA/RNA FFPE组织试剂盒（德国Qiagen公司）分别提取血清和石蜡包埋组织快中RNA。使用SensiFASTTM cDNA合成试剂盒（美国Bioline公司）对2μg RNA进行逆转录反应，获得cDNA。以1μg稀释后cDNA为模板，用SYBR Green Master Mix试剂盒（美国Bio-Rad公司）制备qPCR反应混合物。以GAPDH作为内源性对照。基于2-ΔΔCT方法，MIR4435-2HG表达被标准化为内源性控制GAPDH。
1.3MIR4435-2HG基因启动子甲基化检测使用EpiTect bisulfite试剂盒（德国Qiagen公司）进行亚硫酸氢钠处理，并用Wizard DNA纯化树脂（美国Pro⁃mega公司）对修饰后的DNA样品进行纯化。使用200ng DNA进行甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MSP）扩增。分别用甲基化或非甲基化DNA序列的特异性引物来区分MIR4435-2HG甲基化。PCR产物经
2.0%琼脂糖凝胶电泳分离。仅出现甲基化引物的阳性扩增被解释为完全甲基化，同时出现甲基化和非甲基化引物的阳性扩增被视为部分甲基化。
1.4统计学处理利用SPSS19.0软件分析；计量资料以x±s表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验；采用受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线分析鉴别效能；采用Kappa值判断一致性，≥0.75为一致性好，0.40~0.75为一致性一般，<0.4为一致性较差；检验水准α=0.05。
2结果
2.1脑胶质瘤MIR4435-2HG表达水平和甲基化状态与对照组相比，脑胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG水平均明显增高（P<0.05），而甲基化率明显降低（P<0.05）。与低级别胶质瘤相比，高级别胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG水平明显增高（P<0.05），而甲基化率明显降低（P<0.05）。与IDH1野生型胶质瘤相比，IDH1突变型胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG水平明显降低（P<0.05），而甲基化率明显增高（P<0.05）。见表1。
2.2脑胶质瘤MIR4435-2HG甲基化状态和表达量的关系MIR4435-2HG甲基化组胶质瘤组织（1.83±0.64）和血清（1.51±0.38）MIR4435-2HG水平明显低于非甲基化组（分别为2.95±0.87、2.12±0.51；P< 0.05）。Kappa分析显示，脑胶质瘤组织MIR4435-2HG甲基化率与其表达水平一致性良好（Kappa= 0.782，P<0.05），与血清MIR4435-2HG水平一致性一般（Kappa=0.636，P<0.05）。
2.3ROC曲线分析结果血清MIR4435-2HG水平鉴别脑胶质瘤级别的曲线下面积为0.752（95%置信区间0.701~0.804），最佳截断值为1.98，灵敏度和特异
组别
对照组
脑胶质瘤组低级别胶质瘤高级别胶质瘤IDH1野生型IDH1突变型例数（例）
20
110
70
40
64
46
MIR4435-2HG表达水平
组织
1.00±0.15
2.47±1.15*
2.25±0.79
2.85±0.83#
2.69±0.95
2.17±0.81&
血清
1.00±0.13
1.86±0.47*
1.77±0.45
2.02±0.43#
1.96±0.55
1.72±0.58&
MIR4435-2HG启动子甲基化（例）
18（90.00%）
47（42.73%）*
37（52.86%）
10（25.00%）#
15（23.44%）
32（69.57%）&表1脑胶质瘤lncRNA MIR4435-2HG表达水平及其基因启动子甲基化状态
注：与对照组相应值比，*P<0.05；与低级别胶质瘤相应值比，#P<0.05；与IDH1野生型胶质瘤相应值比，&P<0.05
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度分别为65.0%和91.5%。见图1。3讨论
2016年，WHO 首次将分子生物标志物与典型的组织学特征结合起来，以确定神经胶质瘤亚型以及恶
性化程度[3]。MIR4435-2HG 是一种新发现的lncRNA 。本研究发现脑胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG 水平均明显高于对照组（P<0.05）；并且，高级别胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG 水平升高更明显。这说明MIR4435-2HG 可能参与脑胶质瘤的发生，可能与胶质瘤病理分级有观。
2013年，Cao 等[4]首次在肝细胞癌中发现MIR4435-2HG 呈低甲基化状态。Xu 等[5]证实MIR4435-2HG 可促进脑胶质瘤细胞增殖和侵袭活性，其作用机制可能是靶向miR-1224-5p/TGFBR2轴，进而驱动脑胶质瘤恶性化进程。Reon 等[6]通过Paris 和ribo-seq 数据，结合二级结构预测，在MIR4435-2HG 基因的3'端发现一个与蛋白结合的121bp 的干环结构，通过一种需要发夹结构完整性的机制促进肿瘤细胞的侵袭。本研究发现MIR4435-2HG 启动子两个不同的区域检测到CpG 位点，利用平行RNA 表达和DNA 甲基化数据以及Kappa 一致性分析，证实DNA 甲基化与MIR4435-2HG 表达水平呈负相关，提示MIR4435-2HG 的转录可能受到DNA 甲基化的调控。
IDH 突变是胶质瘤发生的早期事件，与脑胶质
瘤细胞的侵袭和迁移减弱、增殖减少等途径有关。IDH1R132H 和IDH2R172K 替换是最常见的情况，使IDH 产生一种新的酶活性，催化α-KG 生成一种抑制α-KG 依赖性酶的肿瘤代谢物，导致广泛的基因组DNA 甲基化[7]。本研究发现IDH1突变型胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG 表达水平明显低于ID
H1野生型胶质瘤，同时MIR4435-2HG 甲基化率明显增高。这说明MIR4435-2HG 甲基化上调可能与IDH1突变有关。
综上所述，脑胶质瘤，尤其是高级别胶质瘤，血清MIR4435-2HG 水平普遍升高，检测血清MIR4435-2HG 水平有助于鉴别诊断脑胶质瘤级别。MIR4435-2HG 转录受到DNA 甲基化调控，并且与IDH1突变有关，但是具体的调控机制尚需要进一步研究。
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定向扬声器
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[7]赵宇航，王泽芬，徐成仕，等.人脑胶质瘤IDH1突变状态
与MGMT 启动子甲基化、P53和TERT 突变相关性[J].中
国临床神经外科杂志，2018，23（5）：339-342.
（2020-11-02收稿，2020-12-18修回
）
图1ROC 曲线分析血清MIR4435-2HG 水平鉴别诊断脑胶质瘤级别的效果
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