(19)中华人民共和国国家知识产权局
溜逸
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911023708.8
(22)申请日 2019.10.25手机受话器
(71)申请人 北京中医药大学
地址 100029 北京市朝阳区北三环东路11
号
(72)发明人 李军 胡仲冬 屠鹏飞 陈孝男
赵亚楠 杨爱琳 庞道然 田颖颖
唐雷梦媛 黄惠铭
(74)专利代理机构 北京悦成知识产权代理事务
所(普通合伙) 11527
代理人 高艳丽
(51)Int.Cl.
A61K 36/896(2006.01)茶水分离杯
水泵自动抽水
A61P 35/00(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种龙血竭提取物的制备方
法及用途。所述龙血竭提取物的制备方法为：将
龙血竭药材用石油醚除杂，所得药渣用乙酸乙酯
提取，所得提取液浓缩、干燥，得到所述龙血竭提
取物。本发明的龙血竭提取物具有显著的抗肿瘤
作用，
因而具有制备抗肿瘤药物的用途。权利要求书1页 说明书9页 附图4页CN 110559382 A 2019.12.13
C N 110559382
A
1.一种具有抗肿瘤作用的龙血竭提取物的制备方法，包括如下步骤：将龙血竭药材用石油醚除杂，所得药渣用乙酸乙酯提取，所得提取液浓缩、干燥，得到所述龙血竭提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将龙血竭药材用石油醚提取1～5次，固液分离，得到药渣；
(2)将所述药渣用乙酸乙酯提取1～5次，固液分离，合并乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯溶剂，得到所述龙血竭提取物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取的方法为加热回流提取；每次石油醚的体积与所述龙血竭药材质量的比为0.001～0.05L/g，每次提取时间为0.5～5小时；步骤(2)中，所述提取的方法为加热回流提取；每次乙酸乙酯的体积与所述药渣质量的比为0.001～0.05L/g，每次提取时间为0.5～5小时。
4.龙血竭提取物用于制备抗肿瘤的药物的用途，所述龙血竭提取物是采用根据权利要求1～3任一项所述的制备方法制备得到的。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物以所述龙血竭提取物作为唯一活性成分。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自神经胶质瘤、黑素瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌以及结肠癌中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自黑素瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌以及胃癌中的至少一种。
8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物形成促进人癌细胞凋亡的药物制剂。
9.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物形成抑制癌细胞的细胞迁移或细胞侵袭的药物制剂。
10.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物形成抗血管形成的药物制剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 110559382 A
龙血竭提取物的制备方法及用途
技术领域
[0001]本发明涉及龙血竭提取物的制备方法，还涉及其用于制备抗肿瘤的药物的用途。
背景技术
[0002]龙血竭为百合科剑叶龙血树的树脂，主要分布在我国云南及东南亚国家，具有活血散瘀、定痛止血、敛疮生肌等功效，适用于跌打损伤、瘀血作痛、外伤出血等症。
[0003]有研究发现龙血竭75％乙醇粗提物能抑Cholangiocarcinoma细胞增殖并诱导HCCC9810和QBC939细胞系凋亡且成时间和浓度依赖性。龙血竭75％乙醇粗提物明显下调抗凋亡蛋白Survivin的表
达及上调促凋亡蛋白Bak的表达，同时也抑制体内肿瘤生长。[0004]CN1481788公开了一种龙血竭总黄酮制剂的制备工艺：龙血竭药材粉碎成粗粉，加6-10倍量乙酸乙酯回流提取2-3次，每次1-2小时，滤过，合并2次滤液，回收乙酸乙酯并浓缩至干；乙酸乙酯提取物粉碎成粗粉，以20-40倍提取物量的0.2-0.5％NaOH溶液搅拌20-40分钟使溶解，滤过；滤液用5-12％HCl调pH至1～2，静置8-24小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，用去离子水洗至pH试纸检测为中性，60℃以下真空干燥，粉碎，即得龙血竭总黄酮。该方法制备方法复杂，除杂步骤繁琐。
[0005]CN101024604A公开了一种从龙血竭中分离纯化的二氢查耳酮化合物的制备方法，其特征在于具有以下的工艺过程和步骤：a.取一定量的龙血竭粉末为原料，用石油醚于索氏抽提器中在70℃抽提8～10小时；将残留物中的石油醚挥干后，再用氯仿于索氏抽提器中在60℃抽提8～12小时，提取液经减压旋转蒸发仪浓缩，并在40℃干燥，得氯仿提取物；b.将上述氯仿提取物再用甲醇溶解，加入一定量的粒度为200～300目的硅胶，搅拌均匀；待甲醇挥发后，将其研碎，上硅胶柱或快速硅胶柱；用石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，即用石油醚-乙酸乙酯的体积比分别为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的混合溶剂进行洗脱；取8∶2和/或7∶3和/或6∶4的洗脱部分用减压旋转蒸发仪浓缩，随后在40℃下干燥，得石油醚-乙酸乙酯提取物；c.将上述提取物再用甲醇溶解后，用Sephadex LH-20凝胶柱层析，并以体积比为1∶1的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱；洗脱溶剂总量为8～10个柱体积；收集过柱后的8～10个馏分，根据硅胶板点样分析结果，将第6～第8个馏分注入高效液相制
备谱仪纯化，弃去杂质峰，收集主成分峰；d.将上述纯化后所得馏分经旋转蒸发仪浓缩，在40～50℃下干燥后，即得新二氢查耳酮化合物。该方法得到氯仿提取段，经过复杂的纯化步骤，获得新二氢查耳酮化合物。
[0006]到目前为止，尚未见报道该龙血竭药材用石油醚除杂后的乙酸乙酯提取物具有抗肿瘤的用途。
发明内容
[0007]有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种龙血竭提取物的制备方法，该制备方法操作简单，无需复杂的后续处理，获得的龙血竭提取物的化学成分更少而抗肿瘤效果显著。
[0008]本发明的另一目的在于提供上述龙血竭提取物用于制备抗肿瘤药物的用途。[0009]本发明采用如下技术方案实现上述目的。
[0010]一方面，本发明提供一种具有抗肿瘤作用的龙血竭提取物的制备方法，包括如下步骤：将龙血竭药材用石油醚除杂，所得药渣用乙酸乙酯提取，所得提取液浓缩、干燥，得到所述龙血竭提取物。
[0011]根据本发明的制备方法，优选地，所述制备方法包括如下步骤：
[0012](1)将龙血竭药材用石油醚提取1～5次，固液分离，得到药渣；
[0013](2)将所述药渣用乙酸乙酯提取1～5次，固液分离，合并乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯溶剂，得到所述龙血竭提取物。
[0014]根据本发明的制备方法，优选地，步骤(1)中，所述提取的方法为加热回流提取；每次石油醚的体积与所述龙血竭药材质量的比为0.001～0.05L/g，每次提取时间为0.5～5小时；步骤(2)中，所述提取的方法为加热回流提取；每次乙酸乙酯的体积与所述药渣质量的比为0.001～0.05L/g，每次提取时间为0.5～5小时。
[0015]另一方面，本发明还提供龙血竭提取物用于制备抗肿瘤的药物的用途，所述龙血竭提取物是采用上述制备方法制备得到的。
[0016]根据本发明的用途，优选地，所述药物以所述龙血竭提取物作为唯一活性成分。[0017]根据本发明的用途，优选地，所述肿瘤选自神经胶质瘤、黑素瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌以及结肠癌中的至少一种。
[0018]根据本发明的用途，优选地，所述肿瘤选自黑素瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌以及胃癌中的至少一种。
[0019]根据本发明的用途，优选地，所述药物形成促进人癌细胞凋亡的药物制剂。[0020]根据本发明的用途，优选地，所述药物形成抑制癌细胞的细胞迁移或细胞侵袭的药物制剂。
[0021]根据本发明的用途，优选地，所述药物形成抗血管形成的药物制剂。
[0022]本发明将龙血竭药材用石油醚除杂，所得药渣用乙酸乙酯提取，所得提取液浓缩、干燥，得到龙血竭提取物。该提取部位富含酚类成分，主要包括黄烷类、高异黄烷类、二氢黄酮类、二苯乙烯类、黄酮多聚体类、小分子酚酸类、查耳烷及二氢查耳酮类等成分，抗肿瘤效果显著，且制备方法简单，无需复杂的后续处理。
附图说明
[0023]图1为0μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌HepG2细胞的凋亡效果的照片。[0024]图2为20μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌HepG2细胞的凋亡效果的照片。[0025]图3为40μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌HepG2细胞的凋亡效果的照片。[0026]图4为0μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌SK-HEP-1细胞的凋亡效果的照片。[0027]图5为20μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌SK-HEP-1细胞的凋亡效果的照片。[0028]图6为40μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌SK-HEP-1细胞的凋亡效果的照片。[0029]图7为0μg/mL的龙血竭提取物抑制HUVEC的微管形成能力效果的照片。
[0030]图8为10μg/mL的龙血竭提取物抑制HUVEC的微管形成能力效果的照片。
[0031]图9为20μg/mL的龙血竭提取物抑制HUVEC的微管形成能力效果的照片。
涂料分散机
具体实施方式
[0032]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0033]<；龙血竭提取物的制备方法>
[0034]本发明的龙血竭提取物的制备方法，包括如下步骤：将龙血竭药材用石油醚除杂，所得药渣用乙酸乙酯提取，所得提取液浓缩、干燥，得到所述龙血竭提取物。
[0035]具体地，所述制备方法包括如下步骤：
[0036](1)将龙血竭药材用石油醚提取1～5次，固液分离，得到药渣；
[0037](2)将所述药渣用乙酸乙酯提取1～5次，固液分离，合并乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯溶剂，得到所述龙血竭提取物。
[0038]本发明中，优选地，步骤(1)中，所述提取方法可以为加热回流提取法、超声提取法或索氏提取法，更优选为回流提取法。每次石油醚的体积与所述龙血竭药材质量的比可以为0.001～0.05L/g，优选为0.003～0.03L/g，更优选为0.005～0.01L/g。每次提取时间可以为0.5～5小时，优选为1～3小时，更优选为1.5～2.5小时。
支撑梁
[0039]本发明中，优选地，在步骤(2)中，将所述药渣用乙酸乙酯提取，所述提取方法可以为加热回流提取法、超声提取法或索氏提取法，更优选为回流提取法。每次乙酸乙酯的体积与所述药渣质量的比可以为0.001～0.05L/g，优选为0.003～0.03L/g，更优选为0.005～0.01L/g。每次提取时间可以为0.5～5小时，优选为1～3小时，更优选为1.5～2.5小时。[0040]根据本发明的一个具体实施方式，龙血竭提取物采用如下方法制备：(1)将龙血竭药材用石油醚回流提取1～3次，固液分离，得到药渣；每次石油醚的体积与所述龙血竭药材质量的比为0.005～0.01L/g，每次回流提取时间为1～3h；(2)将上述药渣用乙酸乙酯回流提取1～3次，合并乙酸乙酯提取液，将乙酸乙酯提取液减压回收溶剂后，得到乙酸乙酯提取物即龙血竭提取物；每次乙酸乙酯的体积与所述药渣质量的比为0.005～0.01L/g，每次回流提取时间为1～3h。
[0041]<；龙血竭提取物的用途>
[0042]本发明方法制得的龙血竭提取物具有显著的抗肿瘤作用，且对多种肿瘤具有抑制作用，因而可以用于制备抗肿瘤的药物。
[0043]本发明中，所述药物可以形成抗肿瘤的药物制剂；所述药物制剂包含所述龙血竭提取物，还包含药学上可接受的辅料。
[0044]本发明的龙血竭提取物对肿瘤细胞具有十分显著的细胞毒活性，能够明显促进肿瘤细胞凋亡的
发生以及抑制肿瘤细胞的迁移侵袭能力，并且表现出良好的抗血管形成活性。本发明的龙血竭提取物对多种肿瘤细胞具有细胞毒活性，如人神经胶质瘤H4细胞、人黑素瘤A875细胞、人宫颈癌Hela细胞、人肺癌NCI-H358细胞以及人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞、人胃癌HGC-27和MGC-803细胞，人乳腺癌MCF-7细胞，人结肠癌HCT-116细胞等。其中，本发明的龙血竭提取物对人肝癌HepG2细胞和SK-HEP-1细胞的细胞毒活性非常强。因此，本发明中，优选地，所述肿瘤选自神经胶质瘤、黑素瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌以及结肠癌中的至少一种。更优选地，所述肿瘤选自黑素瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌以及胃癌中的至少一种。再优选地，所述肿瘤为肝癌。
[0045]根据本发明的一个实施方式，所述药物形成抑制癌细胞体内成瘤能力的药物制
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