刘杨赞;卢景琦;贾信庭;陶珺;詹维纳
【摘 要】在飞秒激光随机扫描双光子显微成像系统中使用宽带二维声光偏转器扫描飞秒激光,可以增大扫描角度至74 mrad,增大双光子显微成像范围.但宽带二维声光偏转器在大角度扫描时引入的散较大,造成成像范围边缘的光斑严重畸变,边缘光斑直径达2.3 μm,影响边缘视场的成像质量.为了提高成像质量,设计了一种新的散补偿方法,基于衍射透镜组成的开普勒望远系统,可以同时补偿不同扫描角度的不同散.经过散补偿后成像边缘的光斑直径小于1μm,使系统获得大范围扫描成像的同时,所有扫描角度的散都能够得到很好的补偿,在整个视场范围内光斑直径小于1μm,实现更均匀的荧光激发,均匀成像.%In femtosecond laser random scanning two-photon microscopic imaging system,using a broadband two-dimensional acousto-optic deflector scanning femtosecond laser can increase scanning angle to 74 mrad,increasing two-photon microscopic imaging range.But broadband two-dimensional sound and light deflector has large dispersion in large angle scan,resulting in serious distortion of imaging edge and spot diameter of 2.3 μm.In order to improve image q uality,a new dispersion compensation method is designed.Kepler's telescope system based on diffraction lenses can compensate different dispersions of different scanning angles.After dispersion compensation,imaging edge of spot diameter is less than 1 μm,so that wide range of scanning imaging is obtained and dispersions of all scanning angle are well compensated.Spot diameter throughout entire field of view is less than 1 μm and more uniform fluorescence excitation and imaging are achieved.
【期刊名称】《应用光学》
【年(卷),期】2017(038)002
【总页数】6页(P321-326)
【关键词】双光子荧光显微成像;声光偏转器;散补偿;随机扫描;衍射透镜;Zemax
【作 者】刘杨赞;卢景琦;贾信庭;陶珺;詹维纳
【作者单位】武汉理工大学 理学院,湖北 武汉 430070;武汉理工大学 理学院,湖北 武汉 430
070;武汉理工大学 理学院,湖北 武汉 430070;武汉理工大学 理学院,湖北 武汉 430070;武汉理工大学 理学院,湖北 武汉 430070
【正文语种】中 文
【中图分类】TN202;O439
5g怎么做20世纪90年代以来，双光子荧光显微成像已经成为研究生命科学的重要工具之一。由于使用近红外激光对荧光分子标记的生物样品进行高度局域化的荧光激发，相比于共聚焦显微镜具有高组织穿透能力、大成像深度、高纵向分辨率、低光漂白和光损伤等主要优势[1]。基于声光偏转器的随机扫描方式能够提高成像的时间分辨率，但由于双光子激发需要使用飞秒激光，飞秒激光是宽带光源，经过声光偏转器扫描后会产生时间散和空间散，即脉冲宽度变宽和光斑畸变，这会降低双光子激发的荧光效率，影响成像质量。当二维声光偏转器用于小视场成像时，可以使用一个棱镜或声光调制器来补偿散，中心视场的散被完全补偿，边缘视场的散可以忽略。为了研究更大神经元网络，需要使用宽带二维声光偏转器，使光束获得更大的偏转角，增大扫描范围，扩大成像视场。这时成像的边缘视场散比较大，光斑畸变严重影响成像质量。如果把边缘视场散都能够很好地补偿，就
可以使用宽带二维声光偏转器扫描，得到大视场的清晰成像[2]，在扩大成像范围时，不影响成像质量。二元光学是基于光波衍射理论发展起来的一个新兴光学分支，是一种纯相位衍射光学元件，相比于折射光学元件，具有独特的散性能。二元光学元件的散性质是由所使用的波长决定的，与基底材料无关。二元光学中的衍射透镜近年来多用于消差[3]，其引入的差远大于普通透镜。
转接卡本文基于二元光学衍射透镜的特殊散特性，设计了一种散补偿装置，可以很好地补偿声光偏转器的散。
1.1 散分析
数字振镜声光偏转器是根据声光偏转原理制成的器件。声光晶体的折射率受声光晶体内声波的调制沿声波传播方向形成高低周期性分布，类似于一个光栅，其空间周期(光栅常数)就等于声波的波长。衍射角θ可表示为[4]
θ
式中：λ为偏转光波长；f为声波的频率；V为声波在声光晶体内的传播速度。通过改变声波
波长可以调节衍射角即光束偏转角来实现扫描，使用2个正交的声光偏转器可以实现二维扫描[5]。
双光子激发需要使用飞秒激光，而超短脉冲激光是一种复光，其脉冲宽度越小，谱宽越大，使用散器件时会引发散。飞秒激光脉冲为高斯形脉冲，通过散系统后的脉宽[6]：
τout=τin·[1+7.]1/2
GVD称为速度散，单位为fs2/cm；L为光在散系统中的传播距离。GVD与L的乘积又称为延时散GDD。可见，GDD可用于表示散系统的时间散程度。
声光偏转器扫描时相当于一个光栅常数变化的光栅。散补偿的基本思路是在光路中再添加另外的散元件，并且使这些散元件引入的散效应正好与声光偏转器的散效应相反。使用一个棱镜，可以引入一个固定的角散和GDD，可以同时补偿声光偏转器中心频率的空间散和时间散，其他频率的空间散不能得到完全补偿。为了方便分析以及补偿声光偏转器的剩余散，以声光偏转器空间散为零即二维声光偏转器工作于中心频率时的光束主光线为光轴，经过二维声光偏转器后的扫描光束与光轴的夹角为[7]
两根一起塞进来θ·λ
剩余空间角散率为
式中：fx与fy为横向与纵向声光偏转器声波的频率；f0x与f0y为横向与纵向声光偏转器声波的中心频率；θ0为中心波长的扫描光束与光轴的夹角；λ0为中心波长。
1.2 剩余散补偿理论
在双光子荧光显微成像系统中，光束经过声光偏转器扫描后，为了将偏转光束耦合到显微镜物镜的后焦面上以及使光束直径与显微镜物镜的口径相匹配，需要使用开普勒望远系统式的共焦系统进行调节。共焦系统由2个共焦的透镜组组成，如图1所示。
光束经过共焦系统后的扫描角度大小关系可表示如下：
式中：θ1和θ2为光束入射与出射共焦系统的扫描角度；f1与f2为共焦系统第一组透镜与第二组透镜的焦距。光束出射扫描角与共焦系统前后两组透镜的焦距有关：
·θ1
在二元光学中，衍射透镜在基板上光刻不同厚度的衍射层，通过衍射关系，将不同波长的光成像在不同位置，从而实现分光作用。衍射透镜的散与入射光的波长有关，不同波长光有不同的衍射透镜焦距[8]：
f(λ)=f0λ0/λ
单片机解码式中f0为对应于中心波长λ0的透镜焦距值。
使用衍射透镜作为共焦系统的第一组透镜组成开普勒望远系统，代入公式(6)，出射扫描角可表示为
···θ1
经过二维声光偏转器后的扫描光束与光轴的夹角即为共焦系统的入射扫描角。由(3)式可知，进入共焦系统的入射扫描角为
θ1=λ
将上式代入(8)式可以得到：
·
由上式可以得知光束经过二维声光偏转器和衍射透镜组成的共焦系统后，光束出射扫描角与波长没有关系，散得以消除。
在双光子荧光显微成像系统中，使用钛蓝宝石超短脉冲激光器，激光器工作在840 nm，光谱带宽约为6.7 nm，使用的宽带声光偏转器参数如表1所示。
显微镜物镜为40倍物镜(NA=0.8)，焦距为4.5 mm。结合声光偏转器的扫描角范围，扫描视场为：418 μm×418 μm。光路如图2所示。
由图2可知，光束经过声光偏转器后，进入由F1透镜和F2透镜组成的共焦光路和显微镜物镜聚焦成光斑激发荧光。F1透镜和F2透镜的焦距分别为225 mm和180 mm。声光偏转器扫描光束同时也引入角散，虽然经过了棱镜的补偿，但仍有剩余散，激发荧光的光斑发生畸变，畸变大小由角散大小决定。为了方便表述与仿真，将角散转变为线散，线散率为
·f物··f物·
θ0为中心波长的扫描光束与光轴的夹角。以空间散为零的光束主光线为光轴，同时也是扫描的视场中心。剩余散大小基本上以光轴轴对称分布[9]。扫描光斑畸变情况如图3所示。
由(3)式、(4)式和(11)式以及剩余散关于光轴对称分布，可以知道光束经过二维声光偏转器后，散大小与θ0有关，中心波长的扫描光束与光轴的夹角越大，散越大。中心波长扫描光束与光轴的夹角θ0的范围由二维声光偏转器的工作频率范围决定，θ0最大为3°。由(11)式可以得到中心波长的扫描光束与光轴的夹角与线散的关系，如图4所示。
从图中可以看出，视场边缘的线散达到2.3 μm，即由散引起的光斑畸变量最大可达到2.3 μm。
使用Zemax仿真光路，主要仿真声光偏转器、共焦系统和显微镜物镜中的光线追迹。可以通过在Zemax中编写一个自定义面来实现声光偏转器的效果，使不同角度的光束有不同的角散[10]。由于散可以看成是关于轴对称分布的，所以在Zemax中仿真时只需仿真一个方向。挑选视场角最大的方向来进行仿真，使用轴对称的光学元件来补偿散，如果这个方向被补偿，全视场范围的散即可得到补偿。为了仿真剩余散，选取声光偏转器最
大偏转角的光束与光轴的夹角为仿真最大视场。不同偏转角有不同的角散转换成不同视场有不同的角散，使用Zemax自定义面代替声光偏转器，视场代替不同偏转角，使光束通过它时产生的散与声光偏转器产生的散一致。为了体现声光偏转器引入的散，使用理想薄透镜仿真共焦系统与显微镜物镜。经过Zemax仿真后，不同视场的点列图如图5所示，垂轴差如图6所示。
图5展示了散未得到补偿时，在视场0°,2°,3°时的光斑畸变情况以及光斑大小，视场越大，光斑畸变越严重，光斑直径越大。图6表示在散未得到补偿时，不同视场的差。可以看到仿真垂轴差图中视场与差的关系与图3中偏转角与线散的关系一致。点列图中随着视场变大，光斑半径变大。视场边缘的光斑畸变达2.3 μm。在Zemax中使用衍射透镜代替共焦系统中的第二组透镜，使用一个binary 2面和2个surface面仿真衍射透镜，设bianry面的相位系数为变量，通过在merit function editer中写入操作数控制光线，对整个光路进行优化，得到衍射透镜的相位参数以及散补偿后的点列图与垂轴差的仿真结果见图7和图8。
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