荧光标记二抗的选择-FITC/Rhodamine/Texas Red/Cy/PE/AMCA
一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP)，荧光基团(FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine)和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术)中通常使用荧光标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。其中荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有以下几种： 【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】
FITC纯品为黄或橙黄结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Tex
as Red等。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿较为敏感，通常切片标本中的绿荧光少于红。然而FITC的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。
【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】
这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长 (550, 570, 596nm)和最大发射波长(570, 590, 620nm)。尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，使用RRX和TR可以得到更好的颜区分。在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白(PE)耦联基团要比罗丹明好。TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红荧光，与FITC的绿荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染。
【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】
Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。
Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。
【藻红蛋白或藻胆素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】
存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。
【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】
耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联
的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。
注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。另外，多标记中对探针彩区分程度的要求。例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。如果对灵敏度有更高的要求，则Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。
流式细胞术多荧光分析指南 | |
2009年6月11日 |
流式细胞术多荧光检测是目前精细鉴定细胞亚及分析不同细胞亚功能的重要手段，在国际和国内均得以广泛应用。然而，面对种类繁多的荧光染料，如何知道这些染料是否适合您所拥有的流式细胞仪，以及这些染料间的颜补偿究竟有多大呢？下面提供两个表格谨供参考，希望能给您带来一丝感悟。 |
表1：荧光素特性及检测滤片 |
荧光素 | 激发波长 (nm) | 发射波长(nm) | 长通滤片 | 带通滤片 | eFluorTM450 | 405, 407 | 450 | -- | 440/40, 450/50 | Pacific Blue | 405, 407 | 455 哇哈论坛 | -- | 440/40, 450/50 | eFluorTM605NC | 355, 405, 407 | 605 | 595LP | 605/40 | eFluorTM625NC | 355, 405, 407 | 625 | 595LP | 605/50 | eFluorTM650NC | 355, 405, 407 | 650 | 630LP | 660/40 | FITC | 488 | 518 | 汽车座套广告-- | 530/30 | Alexa Fluor® 488 | 488 | 519 | -- | 530/30 | PE | 488 | 575 | 550LP | 575/26, 585/40 | PE-Cy5 | 488 | 667 | 635LP | 670/14, 695/40 | PE-Cy5.5 | 488 | 695 | 685LP | 695/40 | PerCP-Cy5.5 | 488 | 695 | 685LP | 695/40, 710/40 | PE-Cy7 | 488 | 785 | 735LP | 780/60, 780/40 | APC | 633, 635, 640 | 660 | -- | 660/20 | Alexa Fluor® 647 | 633, 635, 640 | 668 | -- | 660/20 | Alexa Fluor® 700 | 633, 635, 640 | 723 | 685LP | 710/40, 710/50, 720/45 | APC-eFluorTM780 | 633, 635, 640 | 电子点烟器780 | 735LP | 780/60 | APC-Alexa Fluor® 750 | 633, 635, 640 | 775 | 735LP | 防潮密闭门780/60 | 注释: | 1.以eFluorTM450为例: 最大激发波长为405 nm或407 nm, 最大发射波长为450 nm, 流式细胞仪检测时无需长通滤片(LP, Long Pass), 而需440/40 (即检测波长范围为440 + 20 nm)或450/50 (即检测波长范围为440 + 25 nm)的带通滤片 (BP, Band Pass)。 2.以eFluorTM605NC为例: 最大激发波长为335 nm, 405 nm或407 nm, 最大发射波长为605 nm, 流式细胞仪检测时需595LP长通滤片(即大于595 nm的光可透过滤片, 而小于595 nm的光被滤片反射),和605/40 (即检测波长范围为605 + 20 nm)的带通滤片。 | | | | | |
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表2：荧光素颜补偿参考值 |
| FITC | PE | PerCP-Cy5.5 | PE-Cy7 | APC | Alexa Fluor® 700 | APC-Alexa Fluor® 750 | eFluorTM 450 | eFluor网络游戏防沉迷系统TM 605NC | eFluorTM 650NC | FITC | | 1.10 | 0.00 | 0.08 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | PE | 冶炼炉16.52 | | 0.01 | 1.62 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.41 | 0.00 | PerCP-Cy5.5 | 3.37 | 27.52 | | 3.50 | 0.74 | 5.29 | 0.16 | 0.00 | 0.06 | 31.83 | PE-Cy7 | 0.27 | 2.01 | 11.48 | | 0.11 | 0.86 | 1.86 | 0.00 | 0.00 | 0.08 | APC | 0.00 | 0.01 | 2.19 | 0.05 | | 0.62 | 22.80 | 0.00 | 0.06 | 77.17 | Alexa Fluor® 700 | 0.00 | 0.00 | 19.35 | 0.11 | 29.46 | | 8.84 | 0.00 | 0.00 | 5.83 | APC-Alexa Fluor® 750 | 0.09 | 0.00 | 3.09 | 5.34 | 5.10 | 25.70 | | 0.01 | 0.03 | 0.00 | eFluorTM450 | 0.27 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.06 | 0.22 | | 0.15 | 0.09 | eFluorTM605NC | 1.51 | 16.99 | 0.00 | 0.02 | 0.03 | 0.32 | 0.00 | 1.47 | | 6.02 | eFluorTM650NC | 0.24 | 1.02 | 1.43 | 0.01 | 1.06 | 0.00 | 0.44 | 0.00 | 1.02 | | 注释: | 1.表中数值表示各荧光检测通道间的颜补偿值 (compensation), 单位为%。 2.以FITC和PE为例：若流式细胞仪的FL1通道检测FITC, FL2通道检测PE, 则需将仪器的补偿设置为 FL1-%FL2=1.10, FL2-%FL1=16.52. 具体可理解为PE荧光素的1.10%漏到FL1检测通道, 需从FL1中减除; 而FITC荧光素的16.52%漏到FL2检测通道, 需从FL2中减除。 | | | | | | | | | | | |
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