老年痴呆症是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，指的是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思电梯井防护门
维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍［2］
。患者早期无明显运动症状，只有当黑质多巴胺神经元丧失达50% 60%时，才出现典型运动障碍。其原因在于机体存在着强大的代偿能力：黑质多巴胺神经元活性增强、轴突末梢释放多巴胺递质频率增加、多巴胺代谢加强、DAT 下调（减少对突触间隙多巴胺重摄取）等。因此，虽然动物模型研究表明纹状体多巴胺大量丧失，但是体内微透析分析显示突触间隙多巴胺浓度正常。另外，前额叶皮质5-羟胺合成增加、代谢加强，多巴胺减少等，会导致NBM 鼠模型运动活性反而强于生理盐水对照组。损伤与代偿的消长，会导致症状上的波动，表现在步伐和爬杆时间上出现双相甚至多相变化过程。
运动对神经营养因子释放、突触传导、神经发生、血管形成等都有刺激和加强作用，并能增强脑抗损伤能力。关于运动对NBM 小鼠AD 模型进行干预，近年有3篇国外文献均发现跑台或转轮运动明显减轻NBM 损伤效应，使小鼠运动速度加快、耐力增加或步伐延长，并认为运动对AD 有保护和预防作用
［3 5］
。其中后2篇文献发现并认为DAT 下调是运动发挥保护作用的机制之一。本文NBM 游泳组较非游泳组小鼠步伐加大，且观察期内步伐未明
显减小；而爬杆时间明显减少，表现出游泳后运动功能增强。另外，游泳后纹状体DAT 明显下调，与上述文献有相似结果。神经生物学变化可能具有动态变化特点，因此基于单一时间点的观察可能具有局限性。运动保护作用是多机制（如神经营养因子）参与的复杂过程，有待于更多、更深入的研究。参考文献：
［1］Matsuura K ，Kabuto H ，Makino H ，et al．Pole test is a useful meth-od for evaluating the mouse movement disorder caused by striatal do-pamine depletion ［
J ］．J Neurosci Methods ，1997，73（5）：45-48．［2］Fernagut PO ，Diguet E ，Labattu B ，et al．A simple method tomea-sure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice ［J ］．J Neurosci Methods ，2002，113（8）：123-130．
［3］Tillerson JL ，Caudle WM ，Reveron ME ，et al．Exercise induces be-havioral recovery and attenuates neurochemical deficits in rodent models of Parkinson ’s disease ［J ］．Neuroscience ，2003，119（4）：899-911．
［4］Fisher BE ，Petzinger GM ，Nixon K ，et al．Exercise-induced behav-ioral recovery and neuroplasticity in the 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine-lesioned mouse basal ganglia ［J ］．Neurosci Res ，2004，77（2）：378-390．
［5］Beinborn M ，Worrall CI ，McBride EW ，et al．A human glucagon-like peptide-1receptor polymorphism results in reduced agonistre-sponsiveness ［J ］．Regul Pept ，
2005，130（3）：1-6．（收稿日期：2011-05-08）
基金项目：江苏省自然科学基金资助项目（BK2009211）。
大鼠髓样细胞表达激发受体-1/人IgG 融合蛋白真核表达载体的构建表达与鉴定 张尤历1，曹亮1，徐岷1，路筝2，袁伟红1，李兆申2
（1江苏大学附属医院，江苏镇江212001；2第二军医大学附属长海医院）
摘要：目的构建大鼠髓样细胞表达激发受体-1（TREM-1）/人IgG 融合蛋白的真核表达载体，并在家蚕Bm 细
胞中实现稳定表达。方法
克隆大鼠TREM-1胞外段与人IgGFc 段，片段连接后PCR 扩增，再与病毒穿梭载体
BAC1连接，基因克隆，构建重组质粒。利用杆状病毒表达系统（Bac-to-Bac ）筛选重组杆状病毒， 在Bm 细胞中进行融合表达，并用Western blot 法行蛋白鉴定。结果
重组质粒酶切测序正确，确认克隆载体构建成功。Western blot
结果说明该蛋白样品可被抗大鼠TREM-1抗体特异性识别，证明该蛋白为TREM-1/IgG 融合蛋白。结论成功构
建了大鼠TREM-1/IgG 融合蛋白真核表达载体，并在Bm 细胞中稳定表达。
关键词：髓样细胞表达激发受体-1；重组质粒；杆状病毒；融合蛋白中图分类号：R657．5
文献标志码：B
文章编号：1002-
266X （2011）40-0073-04目前研究表明，髓样细胞表达激发受体-1（TREM-1）是控制炎症反应的可能潜在分子靶
3
7
点［1，2］。根据TREM属于膜表面免疫球蛋白超家族（IgSF），TREM-1与IgG具有一定的同源性，TREM-1与IgG融合蛋白可能具有两种免疫球蛋白的特性。这种融合蛋白可能与免疫细胞表面的TREM-1竞争性结合TREM-1配体，从而起到抑制活化信号的作用。2010年2 12月，我们利用杆状病毒表达系统构建重组大鼠TREM-1/人IgG蛋白的真核表达载体，同时用Western blot法行蛋白鉴定，拟为后续利用重组蛋白重症胰腺炎（SAP）研究奠定基础。1材料与方法
1．1动物雄性SD大鼠4只，体质量160 180g，清洁级，购自浙江省实验动物中心，大鼠自由饮食、饮水，适应性饲养1周后进行造模实验。
1．2材料L-精氨酸、钠（国药集团化学试剂有限公司），TRIzol试剂盒（Invitrogen公司），反转录试剂盒（Fermentas公司）。T4连接酶、PCR试剂盒（TaKaRa公司），大鼠TREM-1抗体（Santa Cruz 公司）。大肠杆菌DH5a、DH10Bac感受态细胞、Bm 细胞由江苏大学生命科学院医学实验室保存。根据基因文库大鼠TREM-1胞外区和人IgGFc段cDNA 序列设计引物。大鼠TREM-1胞外区引物：上游：5'-CGCGGATCCATGTCAGAAGTCAAAGCTGCCATT-3'（BamH1），下游：5'-CCGGAATTCGCGAACGGACA-CACCTGAAGAACCCTT-3'（EcoR1），393bp；人IgG-Fc段引物：上游：5'-CGCGAATTCACATGCCCAC-CGTGCCCAGCA-3'（EcoR1），下游：5'-CAATTACTA-AAGCTTTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3'（Hand Ⅲ），672bp。
1．3实验方法
1．3．1大鼠胰腺炎模型建立4只雄性SD大鼠实验前禁食12h，L-精氨酸腹腔注射造模，剂量2．5g/（kg·次），共2次，间隔1h，造模前后均自由饮水。1．3．2标本取材大鼠于造模24h后经2%钠溶液腹腔注射麻醉（50mg/kg）。留取大鼠胰腺组织液氮冻存用于提取总RNA。人IgGFc基因片段由江苏大学生命科学院医学实验室馈赠。1．3．3总RNA提取和逆转录胰腺组织液氮研磨，按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA。按Fermentas 反转录试剂盒说明书进行反转录得到cDNA。1．3．4重组质粒的构建用上述设计引物分别PCR扩增大鼠TREM-1胞外区和人IgGFc段，产物酶切回收片段用T连接酶连接后PCR扩增，扩增产物克隆至pMD18-T质粒中，并与转座载体BAC1分别用BamH1、HandⅢ双酶切，回收两端带酶切位点的基因片段，用T连接酶连接，构建重组转座质粒，并转化DH5a，接种于含氨苄青霉素的营养琼脂上，37ħ培养12h，挑取单菌落，提取质粒进行酶切鉴定。将重组转座质粒转入感受态大肠杆菌DH10Bac中，涂于含X-gal和IPTG的筛选平板（含庆大霉素、卡那霉素及四环素）上，37ħ培养48h，挑取白菌落及蓝阴性对照菌落，提取重组杆状病毒质粒，并用pUC/M13引物做PCR鉴定。1．3．5蛋白表达与鉴定
1．3．5．1准备杆粒DNA/脂质体复合物溶液A：取重组杆粒10μl，加入无血清Bm细胞培养基补充至100μl；溶液B：取脂质体8μl，加入92μl无血清Bm细胞培养基。将溶液A和溶液B混匀，室温静置30min。取生长良好的Bm细胞，用无血清昆虫Bm培养基洗2 3次，加入800μl无血清的Bm细胞培养基，再加入准备好的杆粒DNA/脂质体复合物200μl。28ħ继续培养4h后，加入1ml含有20%血清的Bm
细胞培养基继续培养。28ħ继续培养60h后，在显微镜下观察Bm细胞感染征象。收集培养上清（含杆状病毒），用其感染正常Bm细胞至出现细胞病变后收集细胞。同时设立空载杆粒为阴性对照。
1．3．5．2Western blot将有明显病变的细胞悬液离心，收集并裂解细胞，进行SDS-PAGE电泳后，将电泳产物转移至硝酸纤维素膜上，用抗大鼠TREM-1抗体作为一抗（1ʒ100），以羊抗鼠抗体作为二抗（1ʒ500），利用辣根过氧化酶显剂的化学荧光方法使X-感光胶片成像来检测相关蛋白的位置和含量。
2结果
2．1TREM-1胞外段及IgGFc段PCR结果PCR 产物大小与预期一致。见图1
。pfc电感
图1TREM-1胞外段及IgGFc段的PCR结果
注：M为DL2000marker；1、2、3为TREM-1胞外段的PCR产物；4、5为IgGFc的PCR产物
2．2酶切鉴定结果大鼠TREM-1胞外段与人Ig-GFc段连接后PCR扩增，再与BAC1连接，构建重组质粒。重组质粒用BaMHI/HandⅢ双酶切鉴定。电
47
泳结果在1100bp 左右出现外源片段，证实重组转移质粒构建成功，并送测序，测序结果与基因文库原序列进行比对后，核苷酸序列相似性100%。
2．3重组杆粒PCR 验证结果重组质粒转化DH10感受态细胞，蓝白斑筛选、克隆、获得重组杆状病毒质粒，用M13正反向引物进行PCR 验证，发生重组的杆粒理论长度应为2300bp ，加上插入基因的长度，约为3400bp ，若未发生重组，产物长度为300bp 左右，电泳结果表明目的融合片段在DH10受体菌中发生了转座。见图2
。
图2重组杆粒PCR 验证结
注：M 为DL 5000marker ；1为蓝斑对照；2、
3、4为重组杆粒2．4
目的蛋白Western blot 鉴定结果重组杆粒纯
化后转染Bm 细胞，
烷基叔丁基醚
与正常细胞相比，感染细胞直径变大、形状变圆、细胞核增大，继而离壁漂浮、脱落。
收集上清液，获得重组杆状病毒，重复感染Bm 细胞，72h 后收获感染细胞，行Western blot 鉴定，结果见图3
。
图3
目的蛋白Western-blot 鉴定结果注：1为不含目的基因的杆粒转染细胞蛋白印迹显示无条带；2为重组杆粒转染细胞，蛋白条带清晰
号码池
3讨论
Yasuda 等［3］研究发现，当人体发生SAP 时，中
英姿带
性粒细胞和单核细胞表面的TREM-1、血清可溶性TREM-1表达明显升高。TREM-1扩大炎症反应效
应，与下游细胞因子之间形成正反馈自分泌调节回路，影响机体天然免疫，促使炎症反应增强放大
［2］
。
在信号转导中，跨膜区的赖氨酸残基起重要作用，当TREM-1与配体结合后，它可与接头蛋白DAP 12跨膜区内的带负电荷的天冬氨酸相偶联，
并通过DAP 12胞质区中的免疫受体酪氨酸活化基序来传递活化信号
［4］
。Kelker 等
［5］
证明TREM-
1胞外功能区的单体性，
认为TREM-1胞外功能区的CDR 结合环直接结合其配体。TREMs 由于其典型的胞外IgV 结构，
被列为IgSF 中的成员。有构想TREM-1与IgG 融合蛋白综合具有此两种免疫球蛋白的特性，这种融合蛋白能与免疫细胞表面的TREM-1竞争性结合TREM-1配体，从而发挥抑制活化信号的作用，可能成为严重感染性疾病或其他微生物相关疾病的有效疗法。该重组融合蛋白由于在基因水平将目的蛋白基因同IgFc 段基因相连，使新蛋白获得许多新
dr探测器
的特性［6］
：①引入的重链区CH 结构域使重组蛋白具有更长的半衰期，
更适合于体内的应用；②通过Fc 段亲和层析，可以方便进行蛋白纯化；③由于大量商品化Fc 配套产品存在，使融合蛋白的检测更加方便、特异、敏感；④不同的IgFc 段结构域可以形成多聚体分子，提高重组蛋白结合抗原或配体的能力。
在本实验蛋白表达过程中，使用了杆状病毒表达系统。该系统相对于酵母、哺乳动物细胞表达系
统具有操作过程安全性高，
只感染无脊椎动物；具有蛋白质完整的翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸
化、
酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等；修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致；表达水平较高，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50%，
且能同时表达多个基因；具有剪切功能，能表达基因组DNA ，对重组蛋白进行定位，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋
白可分泌到细胞外等优点。我们使用的是Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统，与其他杆状病毒构建及筛
选方法相比具有以下显著优势［7］
：①由于重组病毒的分离是通过蓝白斑筛选，不存在野生型和非重组
型病毒污染的问题，因此不需要传统繁琐的空斑分
析来纯化重组病毒；②大大缩短了重组病毒构建所
需要的时间，可以由原来的4 6周或更长时间减少
到仅7 10d 。
综上所述，本研究首次利用Bac-to-Bac 杆状病毒表达系成功构建了大鼠TREM-1与人IgG 融合蛋白的重组表达载体、杆粒，并且融合蛋白能够成功在
Bm 细胞中稳定高效表达，为后期研究奠定了基础。参考文献：
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5
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J ］．生物技术通报，2009，24（6）：45-47．（收稿日期：2011-02-28）
·个案报告·
成软骨型骨肉瘤伴双肺转移1例
王斌，聂青，张军
（中国人民解放军海军总医院，北京100048）
患者男，36岁，因发现左腹股沟区肿物1个月余，伴左腹股沟区疼痛，站立或活动后明显，症状进行性加重，并出现左下肢活动障碍在外院就诊。B 超检查示：左大腿根部可探及约4．4cm ˑ4．2cm ˑ2．9cm 混合回声肿物，边界清楚、规整。行左腹股沟肿物切除手术，会诊病理切片结果示：“成软骨型骨肉瘤”。外科建议行扩大切除手术，患者拒绝。2009年12月入我院查体：KPS 评分70分。全身浅表淋巴结（－）。心肺及腹部未见异常体征。左腹股沟区可见一长约15cm 手术疤痕，愈合可。术区见轻度肿胀，皮温较正常偏高，
局部压痛明显，左侧髋关节活动受限，未见反常活动，右下肢正常。血常规：WBC 6．53ˑ109
/L ，
RBC 3．86ˑ1012
/L ，Hb 113g /L ，PLT 324ˑ109
/L 。血生化：天冬氨酸转氨酶（AST ）35U /L ，丙氨酸转氨酶（ALT ）57U /L ，尿素氮（BUN ）6mmol /L ，肌酐（Cr ）79μmol /L ，血清铁8．8μmol /L ，血糖4．9mmol /L 。方法：行左腹股沟肿物单纯切除后，给予EIP 方案化疗1个周期，具体方案为：异环磷酰胺2g ，第1 4天；美司钠解救
400mg ，3次/d ，第1 4天（预防出血性膀胱炎）；表阿霉素50mg 、
第1天，60mg 、第2天；顺铂30mg ，第1 3天。化疗后1周给予左耻骨瘤床区域放疗：10MV-X 线，
DT 5000cGy /25f /5W ，200cGy /f 。放疗过程中给予血管内皮抑制素（恩度）抗肿瘤血管生成。结束后出院。出院后2个月因出现咯血入住当地医院，
肺CT 检查示双肺多发结节影，考虑肺转移瘤，见图1。给予止血对症支持，
3周后因呼吸功能衰竭死亡
。图1肺CT 检查示双肺多发结节影讨论：骨肉瘤是一种起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨
肿瘤，
其特征为增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。典型骨肉瘤临床少见，约占恶性肿瘤的0．2%，原发骨肿瘤的15%。典型骨肉瘤好发于男性，发病年龄多为8 25岁，好发部位为长骨，一般为股骨远端或胫骨近端，其次为肱骨近端，其他部位较少见，原发于耻骨的成软骨型骨肉瘤更属罕见。成软骨型骨肉瘤临床有其较为特异的生物学行为，在诊断、鉴别诊断、综合等方面有如下特点：①病理学特征：成软骨型骨肉瘤作为骨肉瘤的一个亚型和其他普通型骨肉瘤的临床和预后并无大的差别，但病理组织学上与软骨肉瘤有相互重叠之处，
容易误诊为软骨肉瘤，应与软骨肉瘤进行鉴别。成软骨型骨肉瘤以产生软骨基质为主，大多为高级别透明软骨，肿瘤内的软骨基质很少，有明显黏液变性或出现其他形式的软骨肉瘤成分；软骨肉瘤是纯软骨分化恶性肿瘤，常伴有软骨基质黏液变性、钙化、骨化等继发性改变，
肿瘤内不存在肿瘤细胞直接形成的肿瘤性骨样组织。②转移及预后：骨肉瘤呈高度恶性，易于血道转移，转移部位最常见的是肺，其次是骨骼，肺部作为骨肉瘤发生远处转移最常见和最主要的部位之一，约占骨肉瘤远处转移部位的90%。骨肉瘤患者一旦出现肺转移，即预示着预后较差。对于出现肺转移或其他远处转移的成骨肉瘤目前仍然无有效的方法，
5年生存率不足20%。③及进展：外科手术切除原发病灶及累及肢体联合全身化疗（术前化疗、
术后化疗）被认为是骨肉瘤现阶段标准的临床方案，且已得到国内外学者的公认。手术包括保肢手术和截肢手术，化疗包括新辅助化疗和术后化疗，目前临床上常采用术前化疗+手术+术后化疗的模式。新辅助化疗的应用使骨肉瘤的无病生存率明显提高，
可达到68% 76%，故新辅助化疗结合外科手术已成为骨肉瘤的常见手段。所以，新的化疗药物的突破或者化疗药物的新的组合显得尤为重要。吉西他滨不仅具有抗骨肉瘤的作用，而且还有放疗增敏作用，可使骨肉瘤细胞阻滞于S 期，因此吉西他滨联合放疗可能是骨肉瘤的一种新方案。吡柔比星是新一代的蒽环类抗癌药物，
能有效对抗部分耐阿霉素（ADM ）的肿瘤，在传统化疗药物ADM 等多药耐药骨肉瘤患者的中，具有较好的应用前景。本例患者术前未行新辅助化疗也许是导致肺部快速转移的原因之一。放疗在骨肉瘤中应用较少，主要原因是骨肉瘤对放疗的敏感性差，临床上可联合热疗加以补充。处于S 期肿瘤细胞对放疗表现抗拒，不易被射线杀灭，但对热疗表现为高敏感性，热疗对S 期细胞杀灭作用明显，从而使热疗和放疗具有增效和互补作用。另外，肿瘤中心的乏氧癌细胞对放疗亦表现不敏感，而热疗促使肿瘤供血血管
扩张，肿瘤血液循环加速，降低了肿瘤乏氧细胞比率，增强了放疗疗效。
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