Vol. 28, No. 1
Mar., 2021
第28卷第1期
2021年3月寄生虫与医学昆虫学报
Acta Parasitol. Med. Entomol. Sin.
doi ：10. 3969/j.issn.l005-0507. 2021. 01. 001
阻断效应的评估*
收稿日期：2020-09-21
*基金项目：国家自然科学基金项目(No. 81761128017)
** 通信作者：E-mail ： ************
刘鹏波张耀文赵艳郁春云曹雅明**
(中国医科大学免疫学教研室，辽宁沈阳110122)
摘要 东南亚大湄公河区域(GMS)内的6个国家批准了 2030年前在该地区实现完全消除疟疾的区域性疟
疾消除计划，传播阻断疫苗(TBV)作为实现这一计划的有力武器面临着候选抗原数量不足的缺陷。本文 研究了配子融合蛋白PvHAP2的传播阻断活性，以评估其作为TBV 候选抗原的潜能。通过原核表达系统表 达了 PvHAP2的HAP2/GCS1结构域从而获得了重组蛋白，并用其免疫BALB/c 雌性小鼠获得抗体。通过间 接免疫荧光分析显示抗PvHAP2抗体仅与间日疟原虫雄性配子体反应。结果显示，在用临床分离株进行的 标准膜饲实验(SMFA)中发现抗PvHAP2抗体能够抑制间日疟原虫卵囊在雌性按蚊宿主体内形成。相比 较于对照组，用与抗PvHAP2抗体混合后的间日疟原虫患者血液饲喂按蚊后，按蚊感染率降低25%，平均 卵囊数降低15.3%。但抑制效果不如杆状病毒表达蛋白免疫获得的抗血清明显，导致这一情况岀现的原因
需要进一步探讨。结果表明，HAP2有成为TBV 候选抗原的潜质，但相较原核表达蛋白系统更为高效
的蛋 白表达系统值得深入的研究。
关键词 间日疟原虫；PvHAP2；配子体；传播阻断疫苗
EVALUATION OF TRANSMISSION BLOCKING
EFFECT OF GAMETE FUSION FACTOR PVHAP2 IN PLASMODIUM VIVAX *
网络雷达无线接收器LIU Peng-Bo 1 ZHANG Yao-Wen 1 ZHAO Yan 1 YU Chun-Yun 1 CAO Ya-Ming 1 **
(Department of Immunology ， China Medical University ， Shenyang ，Liaoning 110122，China )
Abstract Recently ，six countries in the Greater Mekong Sub-region ( GMS) of Southeast Asia have approved a
regional malaria elimination plan to achieve complete malaria eradication by 2030. Transmission blocking vaccine (TBV )，as a powerful weapon ， is facing with the shortage of candidate antigens. The transmission blocking
activity of gamete fusion protein PvHAP2 was studied in present study to evaluate its 'possibility as candidate
antigen of TBV. The recombinant protein was obtained by expressing the HAP2/GCS1 domain of PvHAP2 via the prokaryotic expression system ，and with it antibodies were obtained by immunizing BALB/c female mice. Indirect immunofluorescence analysis showed that the anti-PvHAP2 antibody reacted only with the male gametophyte of
Plasmodium vivax. The standard membrane feeding assay (SMFA ) with clinical isolates demonstrated that anti-
PvHAP2 antibody could inhibit the formation of oocysts in female Anopheles mosquitoes. Compared with the control group ，the infection rate reduced by 25% in Anopheles mosquitoes fed with blood from patients with P.
vivax mixed with anti-PvHAP2 antibody ， and the mean oocyst number reduced by 15. 3%. But the inhibitory
effect was lower than the antisera obtained from the baculovirus expressed protein immunize
d mice ， the reason led to such situation need to be further studied. The results showed that HAP2 has the potential to be a candidate
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寄生虫与医学昆虫学报第28卷第1期
antigen for TBV,but more efficient protein expression system than the prokaryotic expression system should be used by further study.
Key words Plasmodium vivax；PvHAP2；Gametocyte；
疟疾是由疟原虫感染所引起的一种古老的严
重危害人体健康的虫媒疾病(周吉坤等，2015)。仅在2018年，全世界大约有2.28亿例
疟疾感染病例，其中有40.5万人死于疟疾。感
染人类的多种疟原虫中，间日疟原虫在全球范围
内的分布最广，且在非洲以外地区的感染病例最
多(WHO,2020)。间日疟原虫具有复杂的生物
学特性，感染早期配子体在出现症状前就出现在
外周血使其拥有更长的传播窗口期。同时，它具
有侵染网织红细胞的倾向性，因此很难获得体外
连续培养，使开发有效的抗疟措施是一项极具挑
战的任务。此外，有研究证据表明，间日疟原虫
在中缅边境流行区已经出现了对氯喹等抗疟药物
敏感性降低的现象(胡月，2016)。间日疟原虫
在与恶性疟原虫共同流行地区的优势地位日益增强，突出了针对间日疟原虫开发新控制措施的必
要性，包括开发出高效的疫苗等。然而，与恶性
疟原虫相比，间日疟原虫疫苗的研发依然处于早
期临床前阶段，疫苗新的候选抗原筛选依然是当
前工作的重心。而在间日疟原虫感染早期不断产
生有性阶段的雌、雄配子体对其实现有效的传播
至关重要，这说明针对疟原虫有性阶段的传播阻
断疫苗可能是消灭间日疟在人中传播的一项重
要措施。
传播阻断疫苗以疟原虫有性阶段以及按蚊中
肠期蛋白为抗原。但目前为止，虽然研究了较多
的传播阻断疫苗的候选抗原，但其中仅有一小部
分表现出来传播阻断活性(TRA)。传播阻断疫
苗的发展目前主要集中在疟原虫生命周期中的3
个阶段，包括受精前抗原Pfs230(Farrance et al.，2011)和Pfs48/45(Outchkourov et al.，2008)，受精后抗原Pfs25(Wu et al.，2008)和Pfs28(Duffy et al.，1997)以及蚊中肠抗原AgAP N1(Dinglasan et al.，2007)o
最近研究表明，HAP2/GCS1蛋白具有成为
新一代TBV候选抗原的潜质。HAP2/GCS1蛋白
最初于拟南芥中发现(von Besser et al.，2006)，
并且广泛存在于包括植物、多细胞生物、无脊椎
动物、藻类以及致病性和非致病性原生生物在内
的多种真核生物中。HAP2是由单一的跨膜结构Transmission blocking vaccine
域、胞外结构域和相对较短的胞内区所构成的高度保守的蛋白(Fedry et al.，2017，Fedry et al.，2018)。在对衣藻、拟南芥和四膜虫HAP2的结构和功能研究表明，HAP2是一种配子膜融合蛋白，与n类病毒融合蛋白同源(Fedry et al.，2017，Pinello et al.，2017，Feng et al.，2018)。在膜融合的过程中，一个由~40氨基酸(AA)保守区组成的疏水环结构发挥着重要的作用(Fedry et al.，2017)o HAP2存
在于所有疟原虫的基因组中，伯氏疟原虫PbHAP2基因的破坏可以阻止按蚊中肠雌、雄配子的受精和随后在按蚊中的发育(Hirai et al.，2008，Liu et al.，2008)o PbHAP2是一种在雄性配子表面表达的雄性生育因子，为雌性和雄性配子膜融合所必需(Hirai et al.，2008，Liu et al.，2008)。虽然PbHAP2仅参与了配子的融合，并未参与雌、雄配子的黏附结合过程，同时抗PbHAP2抗体可在体内、夕卜引起较强的传播阻断效应(TRA)(Blagborough et al.，2009)o在小麦胚芽无细胞系统中表达的PfHAP2重组蛋白免疫小鼠后，得到的抗体在标准膜饲实验中也显示出强大的TRA(Miura et al.，2013)效应。研究表明，针对保守的HAP2 cd环肽的抗体在伯氏疟原虫和恶性疟原虫系统中均显示出有效的TRA(Angrisano et al.，2017)效应，进一步强调参与疟原虫配子受精过程的II 类融合蛋白是TBV的潜在候选抗原。
前期结果显示，通过杆状病毒表达系统表达的PvHAP2蛋白的抗体表现出了较为明显的传播阻断效应，表明PvHAP2具有作为传播阻断疫苗候选抗原的潜能。然而，杆状病毒表达系统高昂的代价明显不适合大规模蛋白表达，在一定程度上制约了其作为疫苗抗原生产系统的可行性。为进一步阐明不同表达系统表达的rPvHAP2蛋白所制备抗体的传播阻断活性，本文通过间日疟原虫重组rPvHAP2蛋白的原核表达和抗体血清制备，探讨其抗血清对间日疟原虫的传播阻断活性，结果证实了PvHAP2在间日疟原虫中的表达和定位情况，并初步揭示其作为传播阻断候选抗原的潜在应用价值。
钾霞石
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刘鹏波等：间日疟原虫配子融合因子PvHAP2传播阻断效应的评估
1材料与方法
1.1材料
本研究选用的间日疟原虫临床分离株取自中缅边境间日疾患者，6~8周龄的雌性BALB/c小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。斯氏按蚊Anopheles stephensi由中国医科大学免疫学教研室恒温饲养。主要试剂辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(HRP-IgG)和鼠抗His-tag单抗购自美国Invitrogen公司，异丙基0-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、镍氨三乙酸琼脂糖柱、肝素钠及其余常规化学试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。限制性内切酶Bam H I Xho L I购买自美国NEB公司；血液基因组DNA提取试剂盒选自北京天根生化科技有限公司。DNA纯化试剂盒(TaKala Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0)购买于日本TaKala公司。
1.2目的基因的扩增以及原核表达载体pET32a-PvHAP2的构建
为表达重组蛋白rPvHAP2，在蛋白区域(231-459aa)选取了一段229aa的片段通过大肠杆菌原核表达系统进行表达。针对表达的片段以及原核表达载体pET32a(+)合理设计合成弓I物PvHAP2-F(5'-caGGATCCGTGCCATCATGG ATTTCTCC-3')和PvHAP2-R(5'-ggCTCGAGAA TAATTAACACATTTT
TTCA-3')并在稀释后用间日疟原虫基因组充当模板进行扩增。扩增体系包括1.5»L10»mol/L引物PvHAP2-F, 1.5»L10»mol/L引物PvHAP2-R,5»L2mmol/LdNTPs, 5»L10xbuffer,3»L25mmol/L MgSO4,2»L DNA模板，1咽PCR-Plus-Neo,ddH2O补至50 PCR反应程序如下：先于98T预热2 min；然后98弋10s,5630s,681min 30s,35个循环；最后68°C延伸5min,4°C保存。
PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳后，根据产物的大小切下目的基因片段，并按DNA纯化试剂盒的标准操作流程进行PCR产物的回收。之后用Bam H I和Xho L I限制性核酸内切酶对回收所得的目的基因和原核表达载体pET32a(+)进行双酶切处理并回收纯化，之后用T4DNA连接酶将回收的片段克隆至原核表达载体pET32a (+)中。将连接好的产物转化至宿主菌DH5a 中，采用菌体PCR的方法鉴定阳性克隆，并挑取阳性克隆扩大培养提取质粒，在双酶切鉴定后送北京华大基因测序，用DNA Star软件进行序列比对后，保存菌种备用。
1.3重组蛋白rPvHAP2的表达和纯化
1.3.1重组蛋白rPvHAP2的表达：冻存的菌液3接种于3mL新鲜的LB培养基，加入氨苄抗生素后于37C下摇菌过夜，次日提取质粒转化入RGB原核表达宿主菌中。菌落PCR鉴定正确后，按1：100的比例转接到新鲜的300mL LB培养基，在37C进行摇菌，当菌液OD值达到0.4~0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，于19C诱导8h,10000r/min离心10 min收菌。向收集的菌体加入1xNi-NTA结合缓冲液重悬
后在冰上进行超声破菌(540W超声2 s，间隔3s，全程时间20min)，破菌后的菌液在4C条件下12000r/min离心5min，收取上清液样品。水辊清洗剂
1.3.2上清蛋白纯化：取5mL50%镍氨三乙酸琼脂糖柱Ni-NTA His•Bind Superflow悬液加入到20mL1xNi-NTA结合缓冲液中，轻轻混匀，在3000r/min离心5min，吸去上清，重复2遍，以激活Ni-琼脂糖。加入经过无菌0.22^m 滤器推滤的20mL rPvHAP2蛋白表达后的上清液，在恒温摇床上轻轻摇动混匀，于4C结合60min。加入5倍柱体积的1xNi-NTA洗杂缓冲液(含300mmol/L NaCl与50mmol/L磷酸盐缓冲液，pH8.0)在混合器上洗涤10min，此步骤重复3~4次。弃去洗杂缓冲液后用10mL1X Ni-NTA洗脱缓冲液(300mmol/LNaCl与50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH8.0 )进行蛋白洗脱，收集蛋白。将洗脱后的蛋白放入透析袋中，并在含咪唑的PBS缓冲液中4C进行梯度透析。
1.4SDS-PAGA电泳和Western blot检测
将纯化后的rPvHAP2蛋白样品以每孔4Rg 进行上样。用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定蛋白的纯化情况，浓缩胶在60V电压下进行电泳，当到达分离胶后，将电压调到100V，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝R-250染30min，脱之后于凝胶成像分析仪上进行观察，从而分析蛋白质的表达及纯化情况。
纯化的重组蛋白用10%的SDS-PAGE电泳分离。电泳完毕后，在4C45V恒压转膜3h 将蛋白样品转至PVDF膜上。以5%(m/V)的
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寄生虫与医学昆虫学报第28卷第1期
TBST(0.1mol/L TBS，pH7.4,0.02%Tween 20)溶解脱脂奶粉在4T封闭2h o经TBST洗3次后，1：2000稀释的鼠抗His-tag单抗(5%脱脂奶粉稀释)与PVDF膜4T结合过夜。TBST 洗膜3次，每次5min，1:5000稀释HRP标记的山羊抗小鼠IgG(TBST稀释)，室温孵育2h，TBST洗膜3次，用ECL发光的方法在荧光图像分析系统中检测。
1.5多克隆抗体制备及血清抗体滴度检测
体内振动出去吃饭
为了获得针对重组PvHAP2蛋白的抗血清，用50Rg的上述重组蛋白与弗氏完全佐剂充分混合后通过皮下注射的方式对BALB/c雌性小鼠进行免疫，分别于第3、5周给予两次加强免疫，免疫方法为25Rg的PvHAP2重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合后进行皮下免疫。于末次免疫后第7d收集血清检测抗体滴度。多克隆抗体通过蛋白质A柱经行收集。用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释重组蛋白rPvHAP2(5Rg/mL)包被96孔酶标板，并于4X过夜。经200r L PBST(0.1 mol/L PBS，pH7.4，0.02%Tween20)洗板3次后，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭液在37X封闭1h o用PBST洗3次后，加入用封闭液稀释的血清(稀释倍数从1:200到1 :25600)，每孔100r L，于37X孵育2h o PBST洗板3次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG (1:5000)，37X孵育2h o PBST洗板7次后，加入底物邻苯二胺和过氧化氢进行显，100r L 稀
H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm处OD 值。
1.6间接免疫荧光测定(IFA)
在中缅边境通过显微镜镜检疟原虫的方法招募间日疟原虫患者。在获得书面知情同意(Human Subject Assurance Number: FWA0001184)后，每名患者抽取5mL静脉血，并在37X下立即与2倍体积的悬浮缓冲液(10 mmol/L Tris，pH7.4，170mmol/L NaCl，10 mmol/L葡萄糖)进行充分混合，以避免雄配子体出丝。离心除去上清液后，将红细胞沉淀重悬于10mL RPMI1640培养基中。用47% Nycodenzs/RPMI1640于500xg离心25min以对重悬液进行分离。收集灰界面处富含配子体细胞的组分，并用RPMI1640洗涤3次。将分离出的配子体细胞点到多孔载玻片上，并用4%多聚甲醛和0.0075%戊二醛(Sigma)固定30min。用甘氨酸/PBS(3.75mg/mL)中和固定液中醛基后，0.1%Triton X-100透膜10min。PBS洗涤后，用3%BSA/PBS溶液于37X封闭30min。经PBS洗涤后，加入抗PvHAP2血清纯化的IgG (1:500)孵育1h o PBS洗涤后，将玻片与Alexa Fluor®488山羊抗鼠IgG抗体(1:500)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在37X孵育1h o PBS洗涤后，将载玻片用ProLong防淬灭试剂盒固定，并使用荧光显微镜进行观察。免疫前血清用作IFA的阴性对照。1.7标准膜饲实验(SMFA)
在中缅边境招募间日疟感染的患者，在知情同意后，每个患者取10mL的血液进行SMFA以评估抗PvHAP2抗体的传播阻断效果。纯化的抗PvHAP2的IgG用来自泰国志愿者的AB+人血清(热灭活去除补
体后)以1:1进行稀释，共180 r L o然后将稀释的IgG(11.7Rg/RL)样品与患者的红细胞混合(1:1)，并在37X孵育15 min后将混匀血液样品加入膜进样器。每个样品，由实验室饲养的50只饥饿的按蚊通过进样器进食30min。喂食后，将未进食的按蚊去除，吸饱的按蚊饲养于温度为27X,80%相对湿度条件下，给予10%蔗糖水。在第7d每组解剖20只按蚊得到蚊中肠，用0.5%汞素染后在光学显微镜下计数在按蚊中肠上形成的卵囊数量。对照组用免疫前血清纯化的IgG作对照。
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1.8统计分析方法
使用Mann-Whitney U检验分析对照组和PvHAP2免疫组两组按蚊的卵囊数之间的差异。Student's t检验分析ELISA检测抗体滴度。按蚊感染率的计算方法为卵囊阳性按蚊在被解剖的全部按蚊中所占的百分比。Fisher's的精确检验用于比较对照组和PvHAP2免疫组之间的感染率差异。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
2结果
2.1pET32a-PvHAP2重组蛋白的表达
HAP2/GCS1的结构域具有重要功能，因此，我们选取了PvHAP2的229个氨基酸片段(231 -459aa)，它包含7个半胱氨酸但没有cd环的结构域。通过PCR的方法成功扩增得到了PvHAP2基因片段，经限制性内切酶Bam HI和Xho L I进行双酶切后连接至线性化的pET32a载
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刘鹏波等：间日疟原虫配子融合因子PvHAP2传播阻断效应的评估
体（图1），经华大测序正确后，冻菌备用。
图1pET32a-PvHAP2原核表达载体的构建流程图Fig.1The protocol for recombinant pET32
a-PvHAP2plasmid
A.pET32a原核表达载体质粒图谱；
B.扩增的PvHAP2基因 的DNA片段；
C.构建好的pET32a-PvHAP2原核表达载体. A.The plasmid map of pET32a prokaryotic expression vector； B. The amplified DNA fragment of PvHAP2gene； C.The constructed vector of pET32a-PvHAP2.
pET32a-PvHAP2表达载体经IPTG诱导，菌体超声破碎后。使用His-tag镍氨三乙酸琼脂糖柱纯化重组蛋白，并对洗脱及透析后的样品进行SDS-PAGE电泳检测，可清晰看到目标蛋白条带，蛋白纯度达到80%以上。同时使用Western blot对蛋白进行检测，验证了重组蛋白的正确表达（图2）。
A kDa M Cont PvHAP2
B kDa M Cont PvHAP2
图2SDS-PAGE电泳和Western blot检测Fig.2SDS-PAGE electrophoresis and Western blot
analysis of purified rPvHAP2protein
M：蛋白Marker；Cont：未诱导菌液.
M:Protein marker；Cont：Bacterial liquid without induction.2.2ELISA检测血清的抗体滴度
三次免疫后，通过眼球取血获得免疫后的血清纯化IgG。经ELISA检测表明，小鼠对重组PvHAP2蛋白具有较强的免疫应答。抗体滴度明显高于对照组，第3次免疫后抗体滴度达到1:25600（图3）。结果表明，重组PvHAP2具有较好的免疫原性，可诱导雌性BALB/c小鼠产生特异性抗体应答。
图3抗PvHAP2IgG抗体滴度检测Fig.3The antibody titer of purified anti-PvHAP2IgG
2.3间接免疫荧光检测蛋白定位
为确定PvHAP2的表达和定位，在中缅边境招募间日疟患者收集血液样本后，使用密度梯度离心法分
离得到间日疟原虫配子体进行IFA。结果表明对照组血清与配子体无反应，而抗PvHAP2血清可以识别雄性配子体，表明PvHAP2的免疫血清可以识别疟原虫天然抗原（图4）。
2.4标准膜饲实验评估传播阻断活性
为了评估抗PvHAP2的抗体是否可以阻断间日疟原虫向按蚊的传播。将纯化的IgG跟志愿者AB+血清混合后再与间日疟原虫患者血液混合，进行膜饲实验。结果显示，抗PvHAP2抗体表现出了TRA效应。与对照血清相比，抗PvHAP2的感染率降低25%，同时，抗PvHAP2抗体导致平均卵囊数降低15.3%（图5，表1）。
3讨论
传播阻断疫苗以疟原虫有性阶段表面表达的分子为靶点，通过抑制其在按蚊宿主体内发育进而阻止其传播。目前，传播阻断疫苗（TBV）候选抗原主要集中配子和动合子等阶段的表面抗原，而对配子期表面抗原的研究较少。尽管配子表面抗原暴露于宿主抗体的时间相对较短（一般少于1h），但配子产生的抗体却具有很强的
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窄叶火棘・
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