摘要
新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）所引发的一种严重危害世界养禽业的传染病，可分为强毒株、中毒株和弱毒株三种毒株，其中强毒株可100 %致死感染家禽。NDV上的血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白和融合（F）蛋白均是位于病毒粒子囊膜表面的糖蛋白，它们的相互作用是发挥膜融合形成合胞体的关键。而HN蛋白在NDV的生命周期中主要发挥受体结合、促膜融合、神经氨酸酶（NA）活性，已有研究表明，NDV的致病性和膜融合与HN蛋白有关。本实验室前期从野鸟体内分离的两株NDV（NDV-Blackbird和NDV-Dove）同源性极高，F蛋白序列完全相同且裂解基序均为112R-R-Q-R-R↓F117（强毒株和中毒株的裂解基序），HN蛋白上仅有5个氨基酸突变（AAs：54、110、116、469与522），但毒力测定发现NDV-Blackbird是强毒，NDV-Dove是弱毒，而且它们在细胞上产生的合胞体大小差异显著。为了探究这5个氨基酸变异对两株NDV膜融合活性的影响及影响途径，本论文从以下几方面展开研究：
1. 两株NDV的生物活性分析
将两株NDV分别感染BHK21细胞24 h后，通过ImageJ软件分别统计它们所产生的40个合胞体的直径用以比较膜融合活性的差异，发现NDV-Blackbird产生的合胞体明显大于NDV-Dove。通过蚀斑法测定接毒
后不同时间点的病毒滴度来检测它们在DF-1细胞中的增殖情况，发现NDV-Blackbird的增殖速度明显快于NDV-Dove。同时，在感染BHK21细胞24 h后，利用血吸附（HAd）试验和神经氨酸酶（NA）检测试剂盒分别检测了它们的受体结合和神经氨酸酶活性，发现NDV-Blackbird的受体结合和神经氨酸酶活性均明显高于NDV-Dove。
综上所述，研究结果表明，两株NDV膜融合活性的差异可能与增殖能力差异和HN蛋白功能活性差异相关。
工位管理系统2. 两株NDV的HN蛋白差异位点分析
通过统计两株NDV编码结构蛋白中的差异氨基酸，并利用PyMOL软件分别构建HN蛋白的三维结构模型，对HN蛋白上差异氨基酸的位置进行了分析。同时，收集GenBank中裂解基序均为112R/K-R-Q-R/K-R↓F117的763株NDV的序列信息，利用Lasergene7.1软件分析它们的完整HN蛋白序列，确定了5个位置的主要氨基酸种类。
研究表明，5个氨基酸突变分别位于HN蛋白的不同位置，这些氨基酸的突变发生在主要氨基酸之间。
3. HN突变体蛋白的细胞膜表面表达效率分析
将HN突变体和野生型质粒转染进BHK21细胞24 h后，通过间接免疫荧光（IIFA）和流式细胞术（FCM）
对HN突变体蛋白的表达水平和细胞膜表面表达效率分析后发现，所有的HN突变体和野生型蛋白均成功表达，且在细胞膜表面的表达效率没有显著差异。
4. HN突变体蛋白的生物活性分析
为了排除病毒增殖能力对膜融合活性的影响，利用融合PCR技术构建5个HN 单突变体质粒，将其HN突变体和野生型质粒分别与F质粒共转染BHK21细胞36 h 后，通过ImageJ软件分别统计它们所产生的40个合胞体的面积用以比较促膜融合活性的差异，发现NDV-Blackbird的HN蛋白比NDV-Dove拥有更强的促膜融合能力，而突变体中T522I没有影响，G54S、F110L、G116R和A469V具有不同程度的影响，其中F100L和G116R影响较大。通过western blotting检测F蛋白的裂解情况，发现F蛋白的裂解程度没有差异，说明HN突变体蛋白对F蛋白裂解的刺激程度没有差异。同时检测单独转染HN突变体质粒24 h后的HAd和NA活性，发现两株NDV HN蛋白的HAd和NA活性差异显著；5个突变对HAd活性具有不同程度的影响；F110L、G116R、A469V与T522I显著影响NA活性，G54S没有影响。以上结果表明，5个突变对HN蛋白的功能活性都有特定的影响，这两株NDV膜融合活性的差异可能正是与这些功能活性的变化有关，而与HN蛋白对F蛋白裂解的刺激无关。新型橱柜门板
综上所述，我们发现HN蛋白对NDV的膜融合活性确实具有重要的影响，HN 蛋白上5个突变可能使受体结合、神经氨酸酶与促膜融合活性在蛋白和病毒水平上达到了一种平衡状态，最终引起了两株NDV
膜融合活性的差异。而L110、R116、V469与I522均为影响HN蛋白相应功能活性的关键氨基酸，这些都为后期NDV的致病性研究和减毒疫苗的研发提供了新的思路。
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关键词：新城疫病毒；膜融合活性；血凝素-神经氨酸酶（HN蛋白）；促膜融合活性
目录
摘要........................................................................................................................................... I ABSTRACT ........................................................................................................................... I II 第一章新城疫病毒研究进展. (1)
1.1 新城疫病毒研究概述 (1)
1.1.1 病毒的结构 (1)
1.1.2 病毒的分类 (2)
1.1.3 病毒的蛋白及其主要功能 (2)
1.2 新城疫病毒的膜融合机制 (4)
1.3 新城疫病毒的复制与转录 (6)
1.3.1 病毒的吸附与侵入 (6)
1.3.2 病毒的转录与复制 (6)
1.3.3 子代病毒的组装与出芽 (7)
1.4 新城疫病毒HN蛋白研究进展 (7)
1.4.1 HN蛋白的结构 (7)
1.4.2 HN蛋白的功能 (8)
1.4.3 HN蛋白对毒力和膜融合机制的影响 (9)
1.5 本研究的目的与意义 (10)
第二章两株NDV生物特性分析 (11)
2.1 材料 (11)
2.1.1 SPF鸡胚 (11)
2.1.2 细胞与毒株 (11)
2.1.3 主要试剂 (11)
2.1.4 主要仪器及常用试剂配制 (12)
2.2 方法 (12)
2.2.1 病毒的蚀斑纯化 (12)
2.2.2 病毒的扩增 (12)
2.2.3 病毒滴度测定 (13)
2.2.4 病毒的增殖规律测定 (13)
2.2.5 膜融合指数定性和定量分析 (14)
2.2.6 受体结合活性定性和定量分析 (14)
2.2.7 神经氨酸酶活性分析 (15)
2.2.8 统计分析 (15)
2.3 结果 (16)
2.3.1 蚀斑纯化 (16)
2.3.2 膜融合指数测定 (16)
2.3.3 病毒的增殖规律测定 (17)
2.3.4 受体结合活性定性和定量分析 (18)
2.3.5 神经氨酸酶活性分析 (19)
2.4 讨论 (20)
2.5 小结 (21)
第三章HN突变体蛋白生物特性分析 (22)
3.1 材料 (22)
3.1.1 数据材料 (22)
3.1.2 统计分析软件 (22)
3.1.3 细胞、载体与菌株 (22)
3.1.4 主要试剂 (22)
3.1.5 主要仪器及常用试剂配制 (23)
3.2 方法 (23)
3.2.1 五个氨基酸位点的位置确定 (23)
3.2.2 五个位点氨基酸种类的保守性分析 (23)
3.2.3 引物设计与合成 (24)
3.2.4 HN、F基因真核表达载体构建 (25)
3.2.5 HN突变体真核表达载体构建 (28)
3.2.6 HN突变体蛋白促融合活性定性和定量分析 (30)
分布式kvm3.2.7 Western blotting检测HN突变体与F蛋白表达 (30)
3.2.8 HN突变体蛋白受体结合活性定性和定量分析 (31)
3.2.9 HN突变体蛋白神经氨酸酶活性分析 (31)
3.2.10 IIFA试验定性检测HN突变体蛋白表达 (31)
3.2.11 FCM试验定量检测HN突变体蛋白表达效率 (32)
美光隐形眼镜3.2.12 统计分析 (33)
3.3 结果 (33)
3.3.1 五个差异氨基酸统计及位置展示 (33)
艾罐
3.3.2 五个位点氨基酸种类的保守性分析 (34)
3.3.3 HN、F基因真核表达载体构建 (34)
3.3.4 HN突变体真核表达载体构建 (35)
3.3.5 HN突变体蛋白表达效率分析 (36)
3.3.6 HN突变体蛋白促融合活性分析 (37)
3.3.7 Western blotting检测HN突变体与F蛋白表达 (38)
3.3.8 HN突变体蛋白受体结合活性定性和定量分析 (39)
3.3.9 HN突变体蛋白神经氨酸酶活性分析 (40)
3.4 讨论 (41)
3.5 小结 (44)
结论 (45)
附录 (46)
缩略词表 (48)
参考文献 (50)
致谢 (57)
个人简介 (59)
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