在大肠杆菌中，当外源蛋白高水平表达的时候，极易形成包涵体，为蛋白纯化等下游工作带来很大的麻烦。下面是一些可以参考的有助于提高目的蛋白可溶性表达的实验方案： 1.降低蛋白合成的速度。可以通过以下方法实现：
a.降低培养温度
b.使用弱启动子
c.使用低拷贝数的质粒表达载体
风刀干燥机
水稻田 d.降低诱导物的浓度
2.改变培养基
a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子
b.加入缓冲液保持pH稳定
c.加入1%的葡萄糖，抑制lac启动子
d.加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子
e.加入乙醇， thiols and disulfides等？
3.与分子伴侣或折叠酶共表达
常用的分子伴侣有：GroES-GroEL， DnaK-DnaJ-GrpE，ClpB
常用的折叠酶有：
peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPI's)
disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC)
protein disulfide isomerase (指纹鼠标PDI)
4.分泌表达。使目的蛋白分泌到周质空间
周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成，而胞内则是还原性的。
周质空间有折叠酶DsbA和DsbC的存在，帮助蛋白正确折叠。
周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解。
可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。
5.使用特定的菌株
AD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB).
Origami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor).
6.与可溶性partner融合表达
7.表达目的蛋白的一个片段 > 70 kDa的蛋白在大肠杆菌中是很难表达的。
8.体外去折叠，重新折叠
外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略
摘要：长期以来，大肠杆菌一直是表达外源蛋白的首选表达系统．但由于外源蛋白在表达过程中容易被宿主细胞蛋白酶降解或者形成包涵体，其应用受到了限制．本文综述了在大肠杆菌中表达可溶外源蛋白的策略和进展，以期提高具有生物活性的外源基因的表达水平．
1 前言：大肠杆菌具有遗传性状了解透彻、生长快、培养经济、表达水平高、待选质粒和宿主多等特点，在基因工程技术领域成为首选的表达系统．但是外源蛋白往往在获得高水平表达的同时，容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵体．目前国内外对蛋白质体外复性研究较多，但其过程往往费时、费力，且不经济，因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景．
2 宿主与载体的选择
2．1宿主的选择
2．1．1选择有利于外源蛋白可溶性表达的宿主外源蛋白在大肠杆菌细胞质或细胞周质中表达时，容易被宿主本身表达的蛋白酶降解．因此，选择蛋白酶缺失的宿主非常有利于外
源蛋白的表达，尤其是外源可溶蛋白和分泌表达的蛋白．Ignatova等采用不同的大肠杆菌宿主表达青霉素酰化酶，优化培养基后，发现蛋白酶缺失的宿主BL21(DE3)表达该活性可溶蛋白优势明显．Schein等发现缺失Ion蛋白酶的大肠杆菌宿主能显著地提高RNases的可溶分泌表达水平．除此之外，由于大肠杆菌细胞质环境是还原性的，不利于形成二硫键，因此，如果能构建促进二硫键形成的宿主，也将有可能极大地提高可溶蛋白的表达水平
2．1．2外源蛋白与其他辅助蛋白共表达在强启动子调控下，外源蛋白在大肠杆菌中的表达水平往往比较高，而宿主自身的折叠辅助蛋白(分子伴侣与折叠酶)显然无法满足新生肽段正确折叠的要求．因此，共表达分子伴侣和折叠酶就有可能为外源新生肽段提供充分的辅助折叠支持，进而增加可溶活性蛋白的表达量．目前用于共表达以增加外源蛋白可溶性的辅助蛋白有GroEL／ES 和Dn水一DnaJ-GrpE、引发因子(Trigger factor)、硫氧还蛋白(Thioredoxin)和折叠酶fFoldase)等．需要注意的是，应根据外源蛋白的特点有选择性地共表达分子伴侣和折叠酶．例如在大肠杆菌中共表达热激蛋白GroEL／ES能增加某些蛋白(0c一1，6一岩藻糖基转移酶、浸麻芽孢杆菌环式糊精葡聚糖转移酶、谷氨酸消旋酶 剐、过氧化物歧化酶 、酪氨酸激酶 、人胶原酶原 )的可溶性，却对其他一些蛋白(人型干扰素受体2c亚基的胞外段、噬菌体P22结构蛋白、人酸性富含胱氨酸分泌型蛋白无增溶效果．又
如GroEL／ES与人酪氨酸激酶Lck共表达并不能增加后者的可溶性，而硫氧还蛋白却能显著地促进该外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达 ．除此之外，温度也可能会对共表达折叠辅助蛋白的效果产生重要的影响．例如preS2一S，_B一半乳糖苷酶与DnaK和DnaJ分子伴侣共表达，能在30～42℃范围内提高可溶蛋白的表达水平，而共表达GroEL和GroES分子伴侣却只能在30℃条件下取得比较好的效果．值得一提的是，如果将几种折叠辅助蛋白分子同时共表达，有可能获得比单独表达某种折叠辅助蛋白更好的效果．Jiro等 5J将GroEI／ES，Trx或DsbBD与谷氨酸消旋酶同时共表达，活性谷氨酸消旋酶的产量上升了2．2～2．3倍．在某些情况下，共表达那些能增加蛋白可溶性和促进大肠杆菌生长的蛋白也能起到良好的效果．例如Kallio等在大肠杆菌中共表达透明颤菌血红蛋白，发现该蛋白对活性蛋白的表达有明显促进作用．
2．2载体的选择
2．2．1启动子的选择目前有许多启动子应用于外源蛋白的表达．选择启动子可溶性表达外源蛋白，需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性以及经济因素等各方面加以考虑．如果外源蛋白分泌表达，蛋白表达速率必须加以优化，以防止大肠杆菌的转运系统达到饱和
状态 ．因此，需要选择的启动子的强度应尽量与宿主细胞的转运能力保持一致．如果所表达的外源蛋白对细胞的生长有毒害作用，应尽量选择高度可抑制性和诱导性启动子，以减少对宿主细胞的不利影响．另外，还需要从经济和启动子诱导的操作性角度选择合适的启动子．目前应用相当广泛的PET系统，调控紧密，能使克隆到T7启动子下游的外源目的基因在IPTG(或乳糖)诱导下大量表达．但外源蛋白的过量表达往往形成包涵体，高水平的mRNA也容易导致核糖体的破坏和细胞死亡，而且T7RNA聚合酶可能导致质粒和外源基因表达的不稳定．专门用于外源蛋白低温诱导的温度敏感型启动子冷激蛋白CspA 能在适当低温条件下达到较高的可溶蛋白表达水平．Csp启动子比较适用于那些易形成包涵体或不稳定基因产物的外源蛋白的表达．除此之外，阿拉伯糖启动子、pH 启动子、渗透压启动子、溶氧启动子等也日益为人们所重视，并且有的已经成功应用于大规模生产过程 ．
2．2．2构建融合蛋白
通过增加连接体(Linker)而改变蛋白序列有可能改善蛋白折叠、提高蛋白的溶解性、增
强抗蛋白酶降解性、增加蛋白产量以及在培养基中分泌表达．而对于那些外源小分子量蛋白
或某些分子量较大蛋白的片段，只能考虑构建融合蛋白才能顺利表达．大肠杆菌麦芽糖结合
蛋白(MBP)与目的蛋白融合表达，除了易于分离和提高目的蛋白稳定性外，还常具有在细胞
周质分泌表达的优点．Clement等将重组单链抗体(scFvs)~ C末端与MBP融合后在细胞质内表达，发现融合蛋白的可溶性和稳定性均比未融合蛋白有了显著的提高．Spangfort等将HIV人T淋巴细胞受体CD4与麦芽糖结合蛋白融合表达(LB培养基，30℃)，发现融合表达产物可溶，并被转运到细胞周质．多聚组氨酸(Polyhistidine)与外源蛋白融合后能通过固定离子亲合层析给外源蛋白的分离纯化带来极大便利，但组氨酸的数目与融合部位对融合蛋白的表达水平及其溶解性有显著影响．硫氧还蛋白(Thioredoxin)与许多外源蛋白融合后能促进外源蛋白的可溶性表达，这种效应在较低温度下尤为显著[2引．其他可供选择的融合蛋白还有钙调蛋白结合蛋白(Calmodulin—binding peptide)、DsbA和谷胱甘肽一S一转移酶(GST)及天然大肠杆菌蛋白NusA，GrpE，BFR等．需要注意的是，温度可能对融合蛋白可溶性表达的效果有重大影响．另外，以融合蛋白方式表达外源蛋白有三点需要慎重考虑：
首先，融合表达会增加一个切除融合片断的程序，该程序往往需要昂贵的高特异性的因子，
相应地增加了成本；其次，即使是较高特异性的因子也往往会对目的蛋白发生作用，造成目
的蛋白损失和杂蛋白增多；最后，即使融合蛋白表达的水平较高，经过各种分离程序之后，
目的蛋白的量可能非常有限．
2．2. 3分泌表达
由于大肠杆菌的细胞质是一个还原性环境，外源蛋白在细胞质内往往难以正确折叠．分
泌表达外源蛋白能简化蛋白纯化工艺，除此之外，由于分泌表达后信号序列的切除，外源蛋
白前端的甲硫氨酸残基不复存在，保证了外源蛋白N一端的纯正性．然而外源蛋白分泌表
达是一个非常复杂的过程，常常会遇到诸如不完全的跨内膜转运、转运装置的容量不足
以及蛋白降解等问题 ．许多因素，包括外源蛋白的大小、氨基酸组成及导肽的类型都会对蛋白的转运造成影响．为获得外源蛋白的高效分泌表达，应尽量优化翻译水平，使其与大肠杆菌的转运装置的容量保持一致．共分泌表达分子伴侣或向培养基中加入低分子量的添加剂，往往会提高外源蛋白在细胞周质内分泌表达的水平.
2．2．4密码子的使用
密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响．研究人员已经对蛋白表达过程中稀有密码子替换的效应进行了深入的研究，但并没有获得一致性的结论．稀有密码子存在对某些蛋白质的表达具有负面影响，这种负面效应可能缘于某些tRNA相对不足，或者是密码子一反密码子配对的能量差异．在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译．虽然在某些情况下，密码子的优化可以获得更高水平的蛋白表达，但研究人员发现，基因的表达水平并非总是受稀有密码子的限制，而且rRNA的丰度也未必与密码子的使用相关联．值得注意的是，在某些基因中使用稀有密码子能显著降低肽链的延伸速率，从而有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达口 ．然而，对于特定外源蛋白的表达，一个密码子优化的程序可能是有益的，因为经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性．
3 培养条件与诱导方法的选择
3．1降低培养温度
低压蒸汽锅炉 最适合大肠杆菌生长的温度在37～39℃之间，在此温度下表达外源蛋白极易生成包涵体．低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例．但培养温度也有一个下限，一般为8～10℃ ，因为在此温度以下，大肠杆菌将停止生长，蛋白也基本上停止表达．定点突变可能会对表达可溶蛋白的温度选择有重要影响．Mainfroid等发现人丙糖磷酸异构酶37涡轮分子泵℃下能在大肠杆菌中可溶表达，而丙糖磷酸异构酶的两个突变体Metl4Gln和Arg98Gln却在37℃下形成没有活性的包涵体，在28℃下才获得可溶表达．在某些情况下，不同的培养温度都能表达可溶性蛋白，但是降低培养温度具有3个优势：首先，低温下培养基中的氧气溶解性更高，高密度培养时，能有效防止菌体厌氧生长，防止对菌体生长和外源蛋白表达有抑制作用的乙酸的生成；其次，低温培养时，抗生素的半衰期更长，质粒稳定性也可能会相应增加；最后，降低培养温度能降低可溶蛋白降解速率，提高可溶蛋白的稳定性．
降低培养温度能提高外源蛋白可溶性的原因目前还没有满意的解释．不少研究人员认为，低温能降低蛋白质合成的速率，改变多肽折叠的动力学，从而导致正确折叠的蛋白增
加．但是，蛋白表达速率与蛋白可溶性之间并不存在必然的联系．Schein等通过改变SD序列与起始密码子ATG之间的距离来改变Mx蛋白合成的速率，发现该蛋白在无声鼠标37℃都会形成包涵体，而底物不足导致蛋白合成速率下降时，并不能获得外源蛋白可溶性表达量的增加 ．低温培养更有利于可溶性蛋白表达的另一个原因可能是外源蛋白在低温下表达时，蛋白区室化效率更 ，也可能在较低温度下，与蛋白折叠和蛋白聚合相关的蛋白的表达更有利于菌体形成稳定的可溶性蛋白．
3．2培养基的组成
培养基的组成对可溶外源蛋白的表达有显著影响．由于复合培养基成分复杂，在发酵过程中很难准确分析哪些成分对菌体细胞生长和蛋白表达有重要影响，所以一般推荐使用合成培养基．但合成培养基往往又存在菌体生长较慢和菌体浓度较低的问题，因此研究人员为此做了许多卓有成效的工作．一般来讲，在表达外源蛋白时，要尽量避免由于营养物质缺乏导致的菌体生长抑制的情况发生．外源蛋白的表达显著地受葡萄糖浓度的影响，虽然葡萄糖比较适合作为菌体生长的碳源，但在诱导表达时期，需尽量保持低水平的葡萄糖．以甘油代替葡萄糖作为表达外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效应的有效途径之一 ．在诱导时期，流加营养物质也有可能显著提高可溶蛋白的表达量．在某些情况下，向培养基中添加
蛋白抑制剂也能提高可溶蛋白量．Palva等在培养基中添加蛋白酶抑制剂，对生产来自枯草杆菌的干扰素非常有效．Slabaugh将核苷酸还原酶抑制剂羟基脲添加到培养基中，发现核苷酸还原酶亚基vvR1量明显上升．如果外源蛋白在细胞周质表达，向培养基中添加适当浓度的某些非代谢性糖类(比如蔗糖也可能有利于可溶蛋白的表达．当外源蛋白在细胞质表达时，非代谢性糖类由于细胞膜的阻碍不能扩散到细胞质中，但这些糖类的存在会增加培养基的渗透压，进而导致细胞质内渗透压防护剂(比如甘氨酰一三甲铵乙内酯)的积累，这种渗透压保护剂与周质中的非代谢性糖类一样，能抑制细胞质中外源蛋白的聚合，从而提高可溶蛋白的表达水平 ．外源蛋白二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程，向培养基中添加适量的金属离子，可能提高这些酶类的活性，因此也有可能增加可溶蛋白的表达量．某些外源蛋白的活性和稳定性与某些金属离子密切相关，因此向培养基中添加外源蛋白所需金属离子也可能提高蛋白的可溶性和稳定性．另外，良好的通气能有效降低培养基中对菌体表达蛋白有重要影响的CO2和乙酸的浓度，也有可能获得高产量的活性蛋白．在蛋白表达过程中，培养基的pH值也会对可溶蛋白的表达产生重要影响，需要根据菌体和目的蛋白的特点选择合适的pH值．
3．3诱导条件
在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白时，诱导时机和诱导剂的用量必须严格控制．在摇瓶培养时，普遍认为在低菌体浓度下诱导比较合适，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白．然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达．工业上往往采用高菌浓度补料诱导制备大量可溶蛋白，比如纤维原细胞生长因子一皂角苷融合蛋白的生产就是采用补料方法达到A600=85的高菌浓度后，在30℃下用IPTG诱导表达，分离纯化后1 鲫单位可溶性丝毒素达到了2．2 mg／L． 也可考虑在高菌浓度下低温诱导采用冷激启动子高效表达可溶性蛋白．诱导剂种类及其浓度都会对外源蛋白表达产生重要影响，应根据所采用的表达系统(比如启动子的强弱)和外源蛋白的特点优化选择在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平．Saraswat等以乳糖流加诱导的方式表达重组人白细胞介素一，发现乳糖流加诱导的可溶重组人白细胞介素一2的表达水平(9．3 g／L)显著高于一次性乳糖流加诱导的表达水平(5．4 g／L)．
4 通过改变蛋白结构增加可溶性
自从包涵体被发现以来，其形成原因一直是研究人员探讨的焦点，实现外源蛋白的可溶性表达也依赖于对该问题的解答．降低培养温度并不能促进所有外源蛋白的可溶性表达，
人们也无法解释42℃时某些外源蛋白完全可溶的情况，而对这些蛋白进行定点突变却能在所有温度下获得可溶性表达．值得注意的是，虽然定点突变可能增加外源蛋白的可溶性，但不能简单地将这种效应归因于蛋白疏水性和某些特定氨基酸含量的改变．这种可溶蛋白的增加也可能是突变后外源蛋白对蛋白降解的稳定性的增加或者与分子伴侣相互作用增强的次级效应所致．Murby等在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒主要糖蛋白的101个氨基酸片段时，将该片断的若干个苯丙氨酸残基进行了突变，发现病毒糖蛋白片段的溶解性和对蛋白酶的稳定性有了显著的提高，而且突变后的蛋白片段与原蛋白片段具有相同的抗原性和二级结构．定点突变还可能改变温度对蛋白可溶性的效应．需要引起注意的是，虽然可以通过突变导致蛋白降解的位点来提高外源蛋白对蛋白酶的稳定性，但是这种突变可能会对蛋白活性造成极大影响．目前，研究人员已经开始根据己知蛋白的结构和活性特征，利用计算机有针对性地对蛋白突变进行设计，大大地提高了获得具有高活性和高稳定性蛋白的效率和可能．
5 结论与展望
外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达是一个系统工程，其中包含许多环节，环环相扣，任何一个环节的瓶颈都会对可溶蛋白的表达效率产生不良影响．因此，需要在研究过程中
积累经验，并及时汲取相关领域研究的最新进展，出制约可溶蛋白表达的关键因素，以期做到“对症下药”和“有的放矢”．在过去的几十年里，人们对蛋白质体内折叠过程、包涵体形成机理的研究日益深入，基因工程手段也日臻成熟，使大量表达外源活性蛋白成为可能，各种生物活性蛋白需求的迅猛增长也促进了研究方法和技术手段的进步．毫无疑问，随着蛋白质折叠调节机制、蛋白质体内复性机理等方面的探索和经验积累，在大肠杆菌中可溶性表达外源蛋白的技术将会越来越成熟，成本也将逐渐降低，并最终造福整个人类社会。
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