第30卷第1期上海海洋大学学报Vol.30,No.l 2021年1月JOURNAL OF SHANGHAI OCEAN UNIVERSITY Jan.,2021文章编号：1674-5566(2021)01-0120-09DOI：10.12024/jsou.20190902779
徐宏洲，杨宸，彭俊，刘海侠
(西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100)
摘要：试验以5个不同质量浓度氟苯尼考处理铜绿微世藻，测定其生长及生理响应。结果表明，氟苯尼考质量浓度低于0.1mg/L时促进铜绿微囊藻的叶绿素a介成，而对藻肌蛋白含冰和多糖分泌无直接影响；质量浓度高于1.0mg/L时则抑制其叶绿素a合成，而藻胆蛋门和多糖含墩均随处理质量浓度升高而增加不同质量浓度的氟苯尼考处理对铜绿微囊藻光合作用相关基因rhcL以及光系统H反应中心蛋白编码基因psaii 和pMDl均有一定程度的影响;rbel.和psaB基因的表达量在试验前3天均有下调，后期随质量浓度明显上调；psbDl基因在1.0mg/L组的表达量明显高于其他组表明水中緘苯尼考质址浓度在1.0mg/L以上有促进铜绿微囊藻的生长趋势. 关键词：铜绿微囊藻；氟苯尼考；胞外多糖；藻胆蛋白
中图分类号：Q949.22文献标志码：A
抗生素是一类目前在各国各地广泛应用的抗菌药物，由于不合理的使用，抗生素残留已成为水坏境永久性污染物，不仅诱导抗性基因的产生，而且影响着水体微生物的生物量和活性，严重威胁着天然水体的水生态系统结构和功能⑴。研究表明，抗生素对藻类的生长能力和叶绿素a含量有明显的抑制作用，蓝藻由于其细胞结构与细菌相似，在一定的暴露浓度范围内.比其他藻类对抗生素更敏感。
水体富营养化引起的蓝藻水华越来越普遍，给人类的生活用水和环境旅游业造成巨大危害W影响微囊藻暴发性生长的因素有温度、光照、pH、氮磷含量等环境因子E】，外源性污染物如内分泌干扰物、壬基酚、重金属等的影响也有报道l9-，01o氟苯尼考是动物专用的氯霉素类抗生素，常被用于家畜、家禽和水产养殖的抗感染川七，但不合理的滥用会导致动物的氟苯尼考代谢大量进入环境、土壤和水体中，对水生生物的生长和种结构造成破坏；抗生素对藻类生长和生理活动的影响已有许多研究报道t，4-'61o而氟苯尼考对水华蓝藻的影响并未见报道。因此开展不同质量浓度氟苯尼考对铜绿微囊藻的生长和生理活性的影响，对指导抗生素的合理使用有重要意义。
1材料与方法
11材料
铜绿微囊藻(FACHB-524)购自中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心。
1.2方法
1.2.1铜绿微囊藻的培养
藻种在超净工作台转入灭菌的玻璃三角瓶内，放置在智能光照培养箱(PGX-1801)型)内培养2~3<1进行活化。在无菌条件取6mL活化后藻液接种到60mL BG-11培养基培养。培养温度为(25±1)七，光照强度为1500lx，光暗周期12 h：12h，每天定时摇动三角瓶，并以显微计数法统计铜绿微囊藻的生长情况。
1.2.2不同质量浓度氟苯尼考处理铜绿微囊藻
电热恒温鼓风干燥机通过药敏试验和预试验可知铜绿微囊藻对氟苯尼考有明显的抗性，预试验中，当氟苯尼考质量浓度达到30mg/L时铜绿微囊藻全部死亡,
收稿日期：2019-09-02修回日期：2020-04-07
基金项目：陕西省科技厅一般项@(2018NY-109)；陕西省大学生科创项@(3201710712053)；陕西省水利厅项0(2018slkj-20)作者简介：徐宏洲(1998—)，男，研究方向为水产养殖、E-maii：X*****************
通信作者：刘海侠,E-mail：liuhaixia209@
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1期徐宏洲，等：氟朵尼考对铜绿微變藻生长利牛.理特征的影响121
25mg/L时有明显生长抑制。根据预试验结果和环境中氟苯尼考质量浓度（0.I~1.0mg/L），试验质量浓度梯度设置为0、0.1J.O J0和25mg/ L。取对数生长期（密度2x106cell/mL）的微囊藻进行正式试验。每个质量浓度梯度试验组设3个平行。每天定时摇动三角瓶以免藻细胞附壁，试验周期7d，在1、3、5、7d取样进行检测。
1-2.3光合素（叶绿素a）的测定
无菌条件下取10mL藻液，通过反复冻融-浸提法利用分光光度计测定提取的上清液在波长为630、645、663、750nm处的吸光度值，根据公式U"计算并绘制曲线。
1.2.4藻胆蛋白的测定
取5mL藻液，经离心，加入5mL的磷酸缓冲液，反复冻融3~4次后，将离心后的上清液用分光光度计测定波长为620、650和656nm下的吸光度值。根据PADGETT等说］的公式分别计算藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蛋白的浓度和相对含量。
1.2.5胞外多糖的测定
参考YANG等何的方法，胞外多糖（EPS）可分为固着性胞外多糖（bEPS）和溶解性胞外多糖（sEPS）。将15mL藻液离心后收集上清液用于测定溶解性胞外多糖（sEPS），下层藻细胞加蒸憎水，调节pH至10,45T水浴4h，离心收集的上清液经过滤透析冻干浓缩测定固着性胞外多糖（bEPS），采用苯酚硫酸比法力〕测定各试验组胞外多糖的含量。
1.2.6铜绿微囊藻总RNA的提取
无菌条件下取30mL的藻液在4T、6000r/ min下先离心5min，弃上清再加入1mL的超纯水，溶解沉淀后转移到15mL的离心管中，然后在4T、12000r/min下离心10min去上清，沉淀保存于-80七用于提取RNA。铜绿微囊藻RNA 提取参考高胜玲等使用PGTX进行。使用核酸分析仪测定RNA浓度和纯度，天根反转录试剂盒（天根生物公司，北京）进行反转录。
1.2.7RNA的提取
根据文献［22］得到psaB、psbDl和r6cL的定量引物（表1），以16S rRNA基因作管家基因进行校正。利用CFX96TM实时PCR检测系统进行qPCR，反应体系：95T预变性10min,95T变性10s、55七复性15s、72T延伸30s，共39个循环。
表1本研究所用引物
Tab.1Sequences of primers used in this study
~引物
Primer
位点Position
基因Gene name
psaB F5'-CGGTGACTGGGGTGTGTATG-3'
348~460 R5—ACTCGGTTTGGGGATGGA-3'
psb D1F5'-TCrrCGGCATCGCTTICTCS'
109〜189 R5Z-CACCC A C A GC A CTC A TCC A-3'
rbcL F5^-CGTrrCCCCGTCGCTTT-S*
762-889 R5z-CCGAGTTTGGGTTTGATGGT-3'
16S rRNA F5'-GCCGCRAGGTGAA A MCTAA-3'
抱毯140-369 R5'-A A TCCAAARACCTTCCTCCC-3'
基因的相对表达量分析采用2亠°法。所有数据的表示方法均使用平均值土标准误进行显著性差异分析。
13数据处理
采用SPSS软件和Microsoft Excel进行数据统计分析，以P<0.05为显著差异（以a,b,c标注）,P<0.01为极显著差异（以A,B,C标注）。使用Graph P ad Prism7软件作图。2结果
2.1铜绿微囊藻的生长
将藻种活化1周后，取10mL藻液接种到100mL BG11液体培养液中培养，每天定时取样，用血细胞计数板统计铜绿微囊藻的数量，结果如图1所示，微囊藻在正常培养条件下第4天左右进入指数生长期。
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上海海洋大学学报30卷
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图1铜绿微囊藻的生长曲线
Fig. 1 Curve of the growth of M. aeruginosa
2.2氟苯尼考对铜绿微囊藻光合素（叶绿素
a ）的影响
从图2可见，对照组和0. 1 mg/L 组的微囊藻 叶绿素a 含量随时间升高，而氟苯尼考质量浓度
1 mg/L 组、10 mg/L 组和25 mg/L 组的铜绿微囊 藻叶绿素a 含量出现下降。推断氟苯尼考质量浓
度低于0.1 mg/L 时促进铜绿微囊藻的叶绿素a 合成，大于1 mg/L 时则抑制其合成。
2.3氟苯尼考对铜绿微囊藻胞外多糖的影响
微囊藻的体直径被认为和胞外多糖含量
存在显著的正相关，而固着性胞外多糖和溶解性
胞外多糖含量之间也存在显著的正相关关系，可
见多糖的合成和分泌与微囊藻形成体和维持 体形态有着密不可分的联系，而微囊藻体形成
是水华治理的最大限制条件。由图3a 可见，在氟
苯尼考质量浓度低于0.1 mg/L 时对胞外溶解性
多糖分泌无直接影响，在1 mg/L 、10 mg/L .25
mg/L 3组中随质量浓度的升高胞外溶解性多糖
含量逐渐升高，在第5天左右达到最高值。由图
3b 可见,0.1 mg/I.组时的胞被多糖分泌和对照
改锥头组无显著差异，而随着氟苯尼考质量浓度的升
高，胞被多糖质量浓度逐渐升高，在第3天达到
最高值。总之，氟苯尼考质量浓度低于0. 1 mg/L
时对多糖分泌无直接影响，质量浓度大于10 mg/
L 时合成的多糖总量会随抗生素质量浓度的增加
而增加，随着氟苯尼考质量浓度的增加，微囊藻
胞外多糖的分泌呈现先促进后抑制的趋势，并且
在时间上胞被多糖含量的峰值比胞外溶解性多
糖滞后2 d 。
图2不同质量浓度氟苯尼考处理下铜绿
微囊藻的叶绿素a 含量变化
Fig. 2 Changes of Chi. a of M. aeruginosa exposure
to different Florfenicol mass concentrations
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s ⑹图3不同质量浓度氟苯尼考处理下铜绿微囊藻的胞外多糖质量浓度
Fig. 3 EPS mass concentrations of M. aeruginosa exposure to different Florfenicol mass concentrations
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1期徐宏洲，等：氛苯尼考对铜绿微囊藻生长和乞理特征的影响123
24氟苯尼考对铜绿微囊藻藻胆蛋白的影响藻胆蛋白主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中，其主要功能是作为光合作用的捕光素复合体，在一些藻类中藻胆蛋白也可以作为储藏蛋白，供藻类在氮源缺乏的季节作为备用氮源，维持生存。结果表明,3种藻胆蛋白有相同的变化趋势，氟苯尼考质量浓度低于0.1mg/L时对藻胆蛋白含量无直接影响，质量浓度大于1 mg/L时藻胆蛋白含量均随着处理质量浓度升高有增加趋势，在第3天达到最高值，而后有明显下降趋势（图4）。
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(a)藻蓝蛋白phycocyanin
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图4不同质量浓度氟苯尼考处理下铜绿微囊藻的藻胆蛋白含量的变化
Fig.4Changes of phycobiliprotein content of M.aeruginosa exposure to different Florfenicol mass concentrations
2.5光合相关基因测定
通过铜绿微囊藻光合作用相关基因rbcL（1, 5-二磷酸竣化酶/加氧酶）、PS I反应中心蛋白psaB基因和psbDl基因分析不同氟苯尼考质量浓度组对铜绿微囊藻细胞的光合作用系统产生的影响。psaB基因和psbDl基因表现为先下调后随浓度而上调的趋势，"cL基因表达量在各质量浓度组前3天均下调，而10m
g/L和25mg/L 质量浓度组从第5天开始明显上调，到第7天大于0.1mg/L的浓度组均明显上调（图5）。各试验质量浓度组psaB基因表达水平在试验开始第1天相对对照组均下调，第3天氟苯尼考质量浓度在25mg/L组开始上调表达，第5天在大于10 mg/L组上调表达，第7天大于1.0mg/L组均有上调表达（图6）。psbDl基因在0.1mg/L组的表达水平均下调，而1.0mg/L组和25mg/L组表达量在处理5d后明显上调。可见不同质量浓度的氟苯尼考均会对细胞的光合系统产生一定程度影响（图7）。
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上海海洋大学学报30卷
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(d)第7天 The 7th day
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3.2.2.1.1 a 质量浓度 Mass concentration/(mg/L)
(c)第5天 The 5th day
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不同小写字母表示显著差异(Pv0.05)；不同大写字母表示极显著差牙(P <0.01)
Difleremt lowercase letters indicate a significant difference (P <0.05) ； Differemt uppercase letters indicates very significant difference (P <0.01).
图5微囊藻"cL 基因在不同质量浓度氟苯尼考处理下的表达
Fig. 5 Expression profile of rbcL gene of M. aeruginosa exposure to different Florfenicol mass concentrations
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不同大j 字母表示极显著差异(P<0.01)
Differrnit uppercase letters indicate very significant difference( P <0. 01 ).
图6 微囊藻p$aB 基因在不同质量浓度氟苯尼考处理下的表达
Fig. 6 Expression profile of psaB gene of M. aeruginosa exposure to different Florfenicol mass concentrations
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