中国协和医科大学
博士学位论文
实验研究
姓名：***
申请学位级别：博士
专业：生物医学工程
指导教师：修瑞娟；贺福初
2000.7.1
包装箱制作
中国协和医科大学博士学位论文
速效降温器Ａｎｇｉｏｓ诅ｔｉｎＡＳ
强度调制器ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃｍｅｍｂｒａＩｌｅＣＡＭ
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡｃＤＮＡｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅＤＥＰＣｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｇｒｏ叭ｈｆａｃｔｏｒＥＣＧＦｅｍ＝ｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙＥＬＩＳＡＥｎｄｏｓｔａｔｉｎＥＳ
ｆｊｔａｌｃａｌｆｓｅｍｍＦＣＳ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗ也ｆａｃｔｏｒＦＧＦ
ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎＨＥ
ＨｕｍａｎＵｍｂｉｌｉｃａｌｖ毫ｉ矗ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＨＵＶＥＣＣｅｌｌ
牌坊制作Ｌｕｒｉａ．Ｂｅｒｔａｎｉｍｅｄｉ啪ＬＢ
ｐｏｌｙｖｉｎｙｐｙｎＤｌｉｄｏｎｅＰＶＰ
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ｔｅ册ｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙＪｔ脚１ｓｆ毫ｒ∞ｅ－ＴＵＮＥＬｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋ－ｅｎｄ－ｌａｂｅｌｉｎｇａｓｓａｙ
ＶａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅＪｉａＪｇｒｏｗｔ｝ｌｆｌａｃＩｏｒＶＥＧＦ血管抑制素 鸡胚绒毛尿囊膜
互补ＤＮＡ
焦碳酸二乙酯
内皮细胞生长因子酶联免疫吸附测定内皮抑制素
胎牛血清
成纤维细胞生长因子苏木素．伊红
低压注塑热熔胶人脐静脉内皮细胞ＬＢ细菌培养基
聚烯吡酮
聚合酶链反应
磷酸盐缓冲液
反转录聚合酶链式反应
肿瘤坏死因子
透风窗
末端脱氧核糖核酸转移酶介导的ｄＵＴＰ缺口末端标记实验
血Ｌ管内皮生长凶子
中国协和医科大学博士学位论文２
中文摘要
肿瘤的生长要求持续的血管新生束提供养分，抑制肿瘤血管新生疗法可以控制肿瘤生长和转移，伯前受到广泛瞩目。相对抗肿瘤血管新生的蛋白疗法需重复给药和费用高昂的缺点．基因可以长期、稳定、廉价地表达外源抗血管新生蛋白达到异曲同工的效果。但是目前抗肿瘤血管新生的研究基本都局限于肿瘤细胞本身，缺乏对肿瘤微血管和微循环的观察。因此ｊ本研究通过小鼠内皮抑制素（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ，Ｅｓ）基因柬研究抗肿瘤血管新生疗法对肿瘤生长、转移的抑制作用，以及对肿瘤微循环功能的影响。映验包括下列内容： Ｌ
１．以昆明小鼠肝脏总ＲＮＡ为模板，经ＲＴ．ＰＣＲ克隆获得了ＥｓｃＤＮＡ并测序实证，构建ｐＳｅｃＴａ９２．Ｅｓ（Ｅｓ）、ｐＳｅｃＴａ９２一ＥＳ—ＴＴ（ＥＳ－ＴＴ，ＴＴ源自ｔ啪ｏｒｎｅｏｖａＳｃｕｌａｔｕｒｅ．ｔａｌ苫ｅｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ）真核表达重组质粒，转染Ｃｏｓ．７细胞均获融合蛋白表达，该转染细胞上清可以诱导内皮细胞凋亡、抑制内皮细胞增殖：其中，Ｅｓ组抑制内皮细胞增殖的作用强于Ｅｓ．ＴＴ组（ｐ＜０．０５）。
２．在９同龄鸡胚尿囊膜血管新生实验中，ｐｓｅｃＴａ９２一Ｅｓ与甲基纤维素联合作用于鸡胚尿囊膜新生血管网７２小时，可以抑制微血管网络的形成。
３．将荷Ｌｅｗｉｓ癌的Ｃ５７小鼠肌肉注射质粒ＤＮＡ或ＤＮＡ伊ＶＰ４０偶联物，ＥＬｌＳＡ检
测到ＥＳ／ＰｖＰ４０组Ｃ５７小鼠血清中融合蛋白的表达，在ＥＳ／ＰＶＰ４０组和Ｅｓ．１ｖＩ伊ＶＰ４０组肿瘤组织中融合蛋白浓度无统计学差异。肿瘤组织切片电镜检查和组织学检查可见ＥＳ／ＰＶＰ４０组和ＥＳ—Ｔ１什ＶＰ４０组中肿瘤细胞的凋亡和坏死，红染新生血管减少，但各组肿瘤细胞增殖未见差异。肺组织ＨＥ染仅在空白对照组和空载体对照组中可见肺转移。质粒ＤＮＡ与ＰＶＰ４０偶联后，对肿瘤生长的抑制效率均明显提高。ＥＳ与ＥＳ—ＴＴ融合蛋白的表达可抑制肿瘤生长和肿转移的发生．但前者的生物学作用强于后者。
４．鉴于会黄地鼠颊囊肿瘤模型在肿瘤微循环研究中具有微血管丰富、结构清晰、利于进行微循环动态连续观察的独特优势，本实验研究了ＥＳ基因对会黄地鼠颊囊Ｂ１６ＢＬ／６肿瘤生长和微循环功能的影响。空白对照组和空载体对照组中，Ｂ１６ＢＬ／６细胞植入颊囊组织后引起肿瘤微血管明显增
中国协和医科大学博士学位论文
生，肿瘤周边区微血管超速生长。微循环功能严重紊乱：肿瘤微血管管径、微血管密度和迂曲度增加、流速变慢。ＥＳ／ＰＶＰ４０组和ＥＳ—Ｔ１忡ＶＰ４０组调节了肿瘤微循环状况，抑制肿瘤周边区微血管的超速生长，降低微血管管径、微血管密度和迂曲度，提高流速，并明显抑制肿瘤的生长和转移；但Ｅｓ／ＰｖＰ４０组的生物学作用强于Ｅｓ－ＴＴ／ＰＶＰ４０组。
Ｙ
综合上述研究，我们得到如确结论：Ｅｓ基因通过抑制肿瘤血管新生可以有效地抑制肿瘤的生长、转移，抑制肿瘤内及周边微血管的超速生长、调节颊囊肿瘤微循环功能紊乱。ＥＳ－ＴＴ融合蛋白未实现对肿瘤新生血管床的特异导向作用，而且ＴＴ的存在影响了Ｅｓ的生物学活性。址述研究有助于发展抗肿瘤血管新生策略和抗血管形成药物的筛选，为ＥＳ基因从实验室走向临床应用提供了初步依据书
关键词：肿瘤ｙ基因、微循环√血管增生
中国协和医科大学博士学位论文４
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｔ岫ｏｒＳ
ｒｅｑｕｉｒｅｏｎｇｏｉｎｇａ｜１９ｉｏｇｅｎｅｓｉｓｔｏｓｕｐｐｏｎｔｈｅｉｒｇｒｏ叭ｈ．ａｎｄｉＩｌｌｌｉｂｉｔｉｏｎｏｆ锄ｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｈａＳｂｅｅｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄａｓａＶｉａｂｌｅａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒａ１１ｔｉｃａＩｌｃｅｒｔ｝ｌｅｍｐｙ．Ｎｏ、ｖｄａｙｓ，ａＩｌｔｉａＩｌｇｉｏｇｅｎｉｃｔｕｍｏｒｔｈｅｒａｐｙｈａＳａｔｔｒａ
ｃｔｅｄｉｎｔｅｎｓｅｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｔｏｐｒｏｍｏｔｅｔ呻ｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎａＩｌｄｍａｉｎｔａｉｎｄｏｎｎａｌｌｃｙ’孤ｔｉａｌｌｇｉｏｇｅｎｉｃａｇｅｎｔｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎｔｈｅｒａｐｙｓｈｏｕｌｄｂｅｃ１１ｒｏｎｉｃａｌｌｙａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ．Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ
ｏ髓ｒｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌ、ｖａｙｔｏａｃｈｉｅＶｅｓｌｌｓｔａｉｎｅｄｔ１１ｅｒａｐｅｕｔｉｃｒｅＪｅａｓｅｏｆｐｏｔｅｎｔ锄ｇｉｏｓ诅ｔｉｃｆａｃｔｏｒｓ，ａＩｌｄｈａｓａｃｈｉｅｖｅｄｔｈｅｓａｍｅｇｏａｌｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｔｌｌｅｒａｐｙ“ｔｈｌｏｗｅｒｅｘｐｅｎｓｅ．Ｏｆｓｏｍａｌｌｙａ１１ｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ｍｏｓｔｔａ唱ｅｔｔｈｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ，ｌａｃｋｉｎｇｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｕｍｏｒｎｅｏＶａＳｃｕｌａｒｎｅｔｗｏｒｋ柚ｄｍｉｃｍｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．ＡｓａｓｔＩ币ｔｏｗａｒｄｓｅｒｉａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｆｍｏｕｓｅＥｎｄｏｓｔａｔｉｎ（ＥＳ）ｇｅｎｅｔｈｅｍｐｙｏｎｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔ｝ｌ，ｍｅｔａｓｔａｓｉｓａｌｌｄｔｕｍｏｒｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕＩａｔｉｏｎ，、Ｖｅ
ｃ确ｅｄｏｕｔｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：
１．ＷｅｃｌｏｎｅｄｔｌｌｅＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡｂｙＲＴ—ＰＣＲ丹ｏｍＣｈｉｎｅ
ｓｅＫｕｒｌｍｉｎｇｍｏｕｓｅｌｉｖｅｒＲＮＡａＩｌｄＶ面ｆｉｅｄｉｔｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｃｏｎｓｔｍｃｔｅｄｐＳｅｃＴａ９２一ＥＳ（ＥＳ）ａｎｄｐＳｅｃＴａ９２－ＥＳ—ＴＴ（ＥＳ－丌，ＴＴｄｅｒｉＶｅｄ舶ｍｔｕＩＩｌｏｒｎｅｏＶ觚ｃｕｌａｍｒｅ—ｔａｒｇｅｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ）ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｓ，ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｔｈｅｍｉｎｔｏＣＯＳ·７ｃｅｌｌｓｔｏａｃｈｉｅｖｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＴｈｅｓｕｐｅｍａｔａｌｌｔｓｏｆｓｕｃｈｔｒａＩｌｓｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ锄ｄｉＩｌｌｌｉｂｉｔｅｄｔｌｌｅｐｒ０１ｉｆｅｍｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｔｌｌｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌｓ加ｖ咖，ｎｌｅｂｉｏｌｏ百ｃａｌａｃｔｉＶｉｔｙｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄＥＳ·ＴＴｏｎｔｈｅｐｍｌｉｆｂｒａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｔｌｌｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｗａｓｌｏｗｅｒｔｌｌａｎｔｈａｔｏｆｔｌｌｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄＥＳ（ｐ＜０．０５）．
２．Ａｍｏｄｉｆｉｅｄｃｈｏｒｉｏａｌｌ锄ｔｏｉｃｍｅｍｂｍｅ
ａｓｓａｙｏｆ９－ｄａｙｃ１１ｉｃｋｅｍｂｒｙｏｓｗａＳ
ｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｌＩｅａＩｌｔｉ－趾ｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｅ艉ｃｔｏｆＥＳｇｅｎｅ仃ａｎｓｆｅｒ’ａＩｌｄｔｈｅｓｕｐｐｒｅｓＳｅｄ
ｆｏ啪ａｔｉｏｎｏｆｒｅｇｉｏｎａｌｍｉｃｍＶａｓｃｕｌａｒｎｅｔｗｏｒｋｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄａｆｔｅｒＥＳ
ｇｅｎｅｔｍｓｆｃｒｏｍｏ山ｅｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃｍｅｍｂｒａＩｌｅｆｏｒａ
ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇｈａｔｃｈｏｆ３
ｄａｙｓ．
３．Ｔｂａｓｓｅｓｓｍｅｅ丘ｂｃｔｓｏｆＥＳｇｅｎｅｔｌｌｅｒ印ｙｏｎｔＩｌｍｏｒｇｒｏｗｔｌｌａ１１ｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ｐｌａｓｍｉｄＤＮＡ锄ｄＤＮＡ／ＰＶＰ４０ｃｏｍｐｌｅｘｗｅｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｂｙｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｏＣ５７ｍｉｃｃｂｅ撕ｎｇ两ｍａｒｙｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓＬｅｗｉｓｌｕｌｌｇｃａｒｃｉｎｏｍａ．１１１ｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥＳａｎｄＥＳ·ＴＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎｓｅｒｕｍｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬｌＳＡ，ｗｈ柏ｅｔｈｅｒｅｅｘｉｓｔｅｄｎｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｄｊ舵ｒｅｎｃｅｏｒｆｕｓｉｏｎｐｍｔｅｉｎｗｉｔｈｉｎｔｈｅｔｕｍｏｒｅｘｔｒａｃｔｓｂｅｔ、ｖｅｅｎＥＳ／ＰＶＰ４０锄ｄＥＳ－ＴＴ／ＰＶＰ４０ｇｒｏｕｐ．ＴｈｅｅｌｅｃｔｍｎｔｒａＪｌｓｍｉｓｓｉｏｎ
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