用于捕获分子靶标的液滴内表面工程的制作方法

用于捕获分子靶标的液滴内表面工程
1.本技术是国际申请日2017年4月4日、国际申请号 pct/ep2017/058035于2018年11月8日进入中国国家阶段、申请号 201780028636.9、发明名称“用于捕获分子靶标的液滴内表面工程”的申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及基于液滴的系统中、优选是微流体系统中的界面化学，更具体来说涉及允许目标分子的特异性相互作用和捕获的界面。

背景技术：

3.微流体技术中的微液滴提供了在其中物质或反应可以被分开的区室。通常，利用微流体两相流中的毛细不稳定性，将一个相的微液滴产生在另一个不混溶相中。向任一或两个所述相添加表面活性剂使所述微液滴对聚结稳定，并允许它们作为分立的微型反应器起作用。
4.范围广泛的化学和生物反应可以在水性微液滴内部进行，包括例如dna/rna扩增(mazutis等，a.d.lab chip,2009,9,2665-2672； mazutis等，anal.chem.,2009,81(12),4813-4821)、体外转录/翻译 (courtois等，chembiochem.,2008,9(3),439-446)、酶催化(baret 等，lab chip,2009,9(13),1850-1858)和基于细胞的测定法 (clausell-tormos等，chem.biol.,2008,15(8),427-437；brouzes等， proc.natl.acad.sci.usa,2009,106(34),14195-14200)。微液滴的微小尺寸——体积为1皮升至1纳升——便于极高的通量(104个样品/ 秒)和大大减少的试剂消耗。
5.最近，已设计了功能化的表面活性剂，用于将目标分子集中在液滴界面处。已执行了his标签结合化学，以设计允许蛋白质特异性吸附在液滴内界面处的功能化的表面活性剂(kreutz等，2009,j.am.chem. soc.131,6042-6043)。然而，这种方法限于捕获带有his标签的重组蛋白。
6.此外，即使在吸附之后，液滴内部的反应或物质的表征也可以受到所述液滴中存在的分子的多样性以及它们的潜在相互作用的限制。
7.因此，对用于从复杂介质捕获目标分子靶标并适合于微流体技术的新方法，存在着需求。

技术实现要素：

8.本发明提供了一种新的方法，所述方法在使用包含(a)在亲水头部基团上带有功能性组成部分的表面活性剂和(b)化学探针的结合系统的基础上，用于捕获存在于油包水乳液的水相中的分子靶标。
9.第一方面，本发明涉及一种用于捕获分子靶标的方法，所述方法包括：
10.a)提供油包水乳液液滴，所述乳液液滴在所述液滴的界面处包含功能化的表面活性剂，所述功能化的表面活性剂包含连接到功能化的亲水头部的至少一个亲脂尾部；
11.b)将所述功能化的表面活性剂与存在于或添加到所述液滴的水相中的化学探针接触，所述化学探针包含至少(i)一个能够特异性结合到分子靶标的捕获组成部分，和至少(ii)一个能够直接或间接结合到所述功能化的表面活性剂的结合结构域；以及
12.c)将所述功能化的表面活性剂与存在于或添加到所述液滴的水相中的所述分子靶标接触，
13.由此将所述分子靶标捕获在所述乳液液滴的内界面处，并且其中步骤b)和c)同时或以任何次序顺序进行。
14.通过(i)所述化学探针与所述功能化的表面活性剂的直接或间接结合和(ii)所述化学探针与所述分子靶标的特异性结合，将所述分子靶标捕获在所述乳液液滴的内界面处。所述功能化的表面活性剂可以在亲水头部基团上包含一个或多个功能性组成部分。所述化学探针可以与存在于所述功能化的表面活性剂的亲水头部中的一个或多个所述功能性组成部分直接或间接地相互作用。
15.优选地，本发明的方法使用微流体系统来执行。
16.所述方法还可以包括反转所述油包水乳液液滴的相，由此产生水包油乳液液滴并将被捕获的分子靶标暴露在所述乳液液滴的外表面处。
17.所述方法也可以进一步包括回收、检测和/或定量被捕获的分子靶标的步骤。
18.优选地，所述分子靶标是蛋白质或核酸。
19.优选地，所述化学探针的捕获组成部分选自所述分子靶标的抗体、镜像异构适体(spiegelmer)、肽适体、适体、配体或底物，能够杂交所述分子靶标的核酸，以及能够结合所述分子靶标的受体片段。
20.在优选实施方式中，所述功能化的表面活性剂是二嵌段或三嵌段表面活性剂。
21.所述化学探针可以通过共价或非共价相互作用、优选地通过共价相互作用结合所述功能化的表面活性剂。
22.所述化学探针可以通过共价相互作用直接结合所述功能化的表面活性剂。优选地，所述表面活性剂的功能化的亲水头部和所述化学探针的结合结构域各自带有能够通过点击反应或生物偶联反应来一起反应的反应性化学组成部分。
23.或者，所述化学探针可以通过结合中间体结合所述功能化的表面活性剂。优选地，所述表面活性剂的功能化的亲水头部和所述结合中间体各自带有能够通过点击反应或生物偶联反应来一起反应的反应性化学组成部分。
24.特别地，所述点击反应可以选自铜催化的叠氮化物-炔烃偶极环加成(cuaac)、环张力促进的炔烃-叠氮化物环加成(spaac)、使用四嗪和具有环张力的炔烃或烯烃的狄尔斯-阿尔德反应、四嗪-异腈环加成、硫醇-烯烃点击反应例如马来酰亚胺-半胱氨酸环加成、以及悉尼酮
ꢀ‑
炔烃环加成，优选为环张力促进的炔烃-叠氮化物环加成(spaac)。
25.所述化学探针可以通过非共价相互作用直接地或通过结合中间体结合所述功能化的表面活性剂。特别地，所述化学探针与所述功能化的表面活性剂之间的非共价相互作用可以依赖于亲和系统或蛋白质标签。
26.在一些实施方式中，所述分子靶标来自于包封在所述液滴内的生物实体，并且所述方法任选地包括裂解所述实体以释放出所述分子靶标。
27.优选地，每个乳液液滴包含单个遗传元件或生物实体。
28.第二方面，本发明还涉及一种用于按照本发明的方法捕获分子靶标的试剂盒，其包含：
[0029]-功能化的表面活性剂，其包含连接到功能化的亲水头部的至少一个亲脂尾部；和
[0030]-化学探针，其包含至少(i)一个能够特异性结合到分子靶标的捕获组成部分，和至少(ii)一个能够直接或间接地结合到所述功能化的表面活性剂的结合结构域。
[0031]
所述试剂盒还可以包含能够结合所述化学探针和功能化的表面活性剂两者，由此在所述两个实体之间充当桥的结合中间体。
[0032]
所述试剂盒还可以进一步包含：
[0033]-非功能化的表面活性剂；和/或
[0034]-水相；和/或
[0035]-油相；和/或
[0036]-微流体芯片，优选为包含下述模块的微流体芯片：用于产生油包水乳液液滴或重新注射油包水乳液的模块，与所述用于产生油包水乳液液滴或重新注射油包水乳液的模块流体连通并在其下游的用于产生双重乳液的模块，以及与所述用于产生双重乳液的模块流体连通并在其下游的相反转模块；和/或
[0037]-为使用这种试剂盒提供指导的小册子。
[0038]
本发明还涉及本发明的试剂盒的用途，其用于按照本发明的方法捕获分子靶标。
[0039]
在本发明的方法或试剂盒的一些实施方式中，所述功能化的表面活性剂包含式(ib)的组成部分或由式(ib)的组成部分构成：
[0040][0041]
其中：
[0042]-a和b是独立地选自1至5的整数，
[0043]-每个lipo是亲脂尾部，其独立地选自任选地被一个或多个杂原子中断并任选地被选自c
1-c3烷基、卤素如f、cl或br、-oh、-ome 和-cf3的一个或多个基团取代的饱和或不饱和烃链，全氟聚醚链，全氟化碳链及其组合，
[0044]-每个hydro是亲水头部，其包含独立地选自二吗啉磷酸酯基团、聚醚、聚醚胺、聚甘油及其组合的组成部分，
[0045]-每个funct是所述表面活性剂的功能性组成部分，其选自炔基、叠氮基、生物素、链亲合素和亲和素。
[0046]
在本发明的方法或试剂盒的一些其他实施方式中，所述功能化的表面活性剂包含：
[0047]-一个或两个亲脂尾部，其包含式(l1)的组成部分或由式(l1) 的组成部分构成：
[0048][0049]
其中n是25至45的整数
[0050]-一个亲水头部，其带有至少一个(例如1或2个)式(h2)的组成部分
[0051][0052]
其中d是1至12的整数。
[0053]
附图简述
[0054]
图1：krytox-peg
10-炔烃和krytox-peg
10-生物素的合成策略。
[0055]
图2：krytox-peg
12-炔烃和krytox-peg
12-生物素的合成策略。
[0056]
图3：dikrytox-叠氮化物和dikrytox-生物素衍生物的合成策略。
[0057]
图4：tamra-peg
6-bcn衍生物的合成。
[0058]
图5：磺基cy5-bcn衍生物的合成。
[0059]
图6：在内表面处使用磺基cy5衍生物的spaac反应。a： krytox-peg
12-叠氮化物2.5％/磺基cy5-bcn 300nm，b：008-f 2.5％/ 磺基cy5-bcn 300nm，c：krytox-peg
12-叠氮化物2.5％/磺基cy5-炔烃 300nm。
[0060]
图7：在内表面处使用krytox-peg
12-叠氮化物14和 tamra-peg
6-bcn 30的spaac反应。a：krytox-peg
12-叠氮化物 2.5％/tamra-peg
6-bcn 300nm，b：008-f 2.5％/tamra-peg
6-bcn 300 nm,，c：krytox-peg
12-叠氮化物2.5％/tamra-6-co2h 300nm。
[0061]
图8：微液滴表面的双功能化。油相：2.5％ krytox-peg
12-叠氮化物 14的novec 7500/水相：磺基cy5-bcn 32 200nm、tamra-peg
6-bcn30 200nm的pluronic 0.01％(在pbs 1x中)。
[0062]
图9：二嵌段-叠氮化物14在非功能化的商品化氟表面活性剂008-f 中稀释后的spaac反应。油相：novec 7500中2.5％浓度的，a＝ krytox-peg
12-叠氮化物14/008-f 80/20，b＝krytox-peg
12-叠氮化物 14/008-f 90/90，c＝krytox-peg
12-叠氮化物14/008-f 95/5。水相：a、 b、c＝磺基cy5-bcn 32 300nm、acms 1μm的pluronic 0.01％(在 pbs 1x中)。
[0063]
图10：商品化氟表面活性剂(008-)中一定浓度范围的二嵌段-叠氮化物14的荧光偏振。
[0064]
图11：一定浓度范围的磺基cy5-bcn 32探针的荧光偏振。
[0065]
图12：使用dikrytox-peg
12-叠氮化物23b的spaac反应。油相： a、b、c＝2.5％dikrytox-peg
12-叠氮化物23b的novec 7500。水相：a ＝磺基cy5-bcn 32 300nm的pluronic 0.01％，b＝tamra-peg
6-bcn30 300nm的pluronic 0.01％，c＝磺基cy5-bcn 32 200nm+ tamra-peg
6-bcn 30 200nm的pluronic 0.01％。
[0066]
图13：通过电去稳定进行相反转的原理。
[0067]
图14：用于双重乳液产生和相反转的微芯片。(1)w/o乳液入口。(2)分隔油入口。(3)外部水相入口。(4)出口。(a)电极(300vpp，10khz)。(b)电极0v。
[0068]
图15：用于荧光的光谱设置。
[0069]
图16：使用生物素化的表面活性剂(左)和非功能化的表面活性剂(右)的水包油液滴中的链亲合素荧光。
[0070]
图17：相反转后水包油液滴中的链亲合素荧光。
[0071]
图18：作图油液滴上链亲合素荧光平均值的柱状图。
[0072]
图19：通过电穿孔进行相反转的原理。
[0073]
图20：电穿孔杯的示意图。
[0074]
图21：在100ms期间施加10、25或50v后的液滴体。
[0075]
图22：通过自发去稳定进行相反转的原理。
[0076]
图23：用于双重乳液产生和通过自发去稳定进行相反转的微芯片。 (1)w/o乳液入口。(2)分隔油入口。(3)外部水相入口。(4) 出口。
[0077]
图24：在延迟线中温育10sec、1、5或10min后的液滴体。
[0078]
图25：相反转之前alexafluor532链亲合素和生物素化的抗体荧光的共聚焦图像。
[0079]
图26：相反转之后alexafluor532链亲合素和生物素化的抗体荧光的共聚焦图像。
[0080]
图27：多叠氮化物氟表面活性剂的合成策略。
[0081]
图28：偶联试剂的合成策略。
[0082]
图29：包含用于重新注射油包水乳液的包含ψ型结构的模块、用于使用t型汇流口产生双重乳液的模块和相反转模块的微流体系统。
[0083]
图30：通过spaac反应的寡核苷酸接枝。顶部：在乳液重新注射期间获得的信号。红：激光642nm，蓝：激光375nm。底部：共聚焦显微术，图像尺寸：367.83μm x 367.83μm，蓝：激光405nm，红：激光635nm。
[0084]
图31：寡核苷酸接枝和互补序列的捕获。共聚焦显微术，图像尺寸：367.83μm x 367.83μm，红：激光635nm，绿：激光488nm。
[0085]
图32：使用非功能化的氟表面活性剂008-f的阴性对照。共聚焦显微术，图像尺寸：367.83μm x 367.83μm，红：激光635nm，绿：激光488nm。
[0086]
图33：通过spaac反应的抗体(曲妥珠单抗)接枝。共聚焦显微术，图像尺寸：367.83μm x 367.83μm，蓝：激光405nm，红：激光635nm。
[0087]
图34：40pl液滴发生器。所述微流体装置的主要尺寸被标出。深度为40μm。将所述装置的通道用1％(v/v)1h,1h,2h,2h-全氟代癸基三氯甲硅烷(97％，abcr gmbh and co,)在hfe7500(3m)中的溶液钝化，随后用压缩空气冲洗。
[0088]
图35.捕获的rna的成像。含有标记的rna 4、捕获dna 5和 7-氨基香豆素-4-甲磺
酸的40pl液滴，通过使用408nm激光激发香豆素并在410-483nm处收集发射的光进行成像，同时通过用488nm激光激发atto 488并在499-553nm处收集发射的光将绿荧光可视化。
[0089]
图36.液滴反转装置。所述微流体装置的主要尺寸被标出。深度为40μm。将所述装置的通道用pah-pss处理进行钝化(zinchenko 等，2014，anal chem 86:2526-2533)。
[0090]
图37.反转程序之前和之后的液滴成像。a.反转过程的示意图以及在所述过程期间记录的所述液滴的荧光分布情况。电极用通道旁的红和蓝结构表示。液滴从左向右流通。b.顶部行：反转程序之前的w/o/w液滴。w/o/w液滴(白箭头)可以容易地与空的o/w液滴(白星号)区分开，因为只有前者在液滴内部表现出香豆素信号(蓝通道)。此外，被捕获的rna通过在所占据的w/o/w液滴内部形成绿环而被具体化。底部行：在反转程序后w/o/w液滴被转变成o/w液滴。尽管在所述液滴的表面(外表面)处仍然观察到被捕获rna的绿环，但蓝信号已从液滴内部完全消除。在两套图片中，在液体外部观察到的游离绿荧光被指派给来自于浓缩的tamra的串扰，所述tamra被蓝激光轻微激发并在绿通道中轻微发光。通过使用 408nm激光激发香豆素并在410-483nm处收集发射的光将液滴成像，同时通过用488nm激光激发atto 488并在499-553nm处收集发射的光将绿荧光可视化，并通过用561nm激光激发tamra并在559-735 nm处收集发射的光将橙荧光可视化。
[0091]
发明详述
[0092]
本发明人设想了一种用于捕获存在于油包水乳液的水相中的分子靶标的新方法。
[0093]
所述方法是基于结合系统的使用，所述结合系统包含(a)在亲水头部基团上带有功能性组成部分的表面活性剂，和(b)化学探针。
[0094]
所述化学探针包含至少两个不同结构域，即(i)至少一个能够特异性结合所述分子靶标的捕获组成部分和(ii)至少一个能够通过共价或非共价相互作用直接地或通过结合中间体与所述表面活性剂的功能基团相互作用的结合结构域。因此，所述化学探针充当所述功能化的表面活性剂与分子靶标之间的分子订书钉，由此将所述分子靶标捕获在所述乳液液滴的内表面处。
[0095]
所述分子靶标在所述乳液液滴的内表面处的捕获旨在促进它的回收、检测和/或定量。
[0096]
由本发明人开发的用于捕获分子靶标的方法可用于各种不同的生物技术领域中，特别是在单细胞蛋白质组分析中，并且特别适应于在微流体系统中执行。
[0097]
值得注意的是，本发明的方法不限于捕获带有特定标签例如his 标签的重组蛋白。它可以被执行用于捕获任何目标分子靶标。
[0098]
因此，一方面，本发明涉及一种用于捕获分子靶标的方法，所述方法包括：
[0099]
a)提供油包水乳液液滴，所述乳液液滴在所述液滴的界面处包含功能化的表面活性剂，所述功能化的表面活性剂包含连接到功能化的亲水头部的至少一个亲脂尾部；
[0100]
b)将所述功能化的表面活性剂与存在于或添加到所述液滴的水相中的化学探针接触，所述化学探针包含至少(i)一个能够特异性结合到分子靶标的捕获组成部分，和至少(ii)一个能够直接或间接结合到所述功能化的表面活性剂的结合结构域；以及
[0101]
c)将所述功能化的表面活性剂与存在于或添加到所述液滴的水相中的所述分子靶标接触，
[0102]
由此将所述分子靶标捕获在所述乳液液滴的内界面处。
[0103]
在本发明的所述方法中，步骤b)和c)同时或以任何次序顺序进行。
[0104]
在一个实施方式中，在步骤a)中提供的液滴的水相包含分子靶标和化学探针。
[0105]
在另一个实施方式中，在步骤a)中提供的液滴的水相包含分子靶标，然后向所述水相添加化学探针。
[0106]
在又一个实施方式中，在步骤a)中提供的液滴的水相包含化学探针，然后向所述水相添加分子靶标。
[0107]
在另一个实施方式中，在步骤a)中提供的液滴的水相既不包含分子靶标也不包含化学探针。在这个实施方式中，随后向所述液滴的水相同时或以任何次序顺序添加所述分子靶标和化学探针。
[0108]
化学探针或分子靶标在所述液滴的水相中的添加，可以使用专业技术人员公知的任何方法例如液滴融合或皮注射(pico-injection)来进行。
[0109]
应该指出，正如下文详细描述的，每个液滴可以包含一种或多种功能化的表面活性剂、一种或多种化学探针以及一种或多种分子靶标。
[0110]
油包水乳液液滴
[0111]
在所述方法的步骤(a)中，提供油包水乳液液滴。这些液滴被表征为在它们的界面处包含功能化的表面活性剂。在一些实施方式中，这些液滴的水相可以包含分子靶标和/或化学探针。
[0112]
当在本文中使用时，术语“液滴”或“微液滴”是指被第二流体包围的第一流体的分离的部分。取决于外部环境，液滴可以是球形的或具有其他形状。通常，所述液滴具有小于1μl，优选地小于1nl，更优选地小于500pl的体积。例如，液滴可以具有10至500pl、优选地10至250pl、更优选地10至200pl的范围内、甚至更优选地约 40pl的体积。
[0113]
术语“油包水乳液液滴”、“油包水液滴”和“w/o液滴”在本文中可互换使用，是指完全被油相包围的水相的分离的部分。术语“油包水乳液”或“w/o乳液”是指包含以液滴形式分散在油相中的水相的乳液。优选地，所述液滴具有均匀的直径分布，即所述液滴可以具有这样的直径分布，使得不超过约10％、约5％、约3％、约1％、约0.03％或约0.01％的所述液滴具有大于所述液滴的平均直径的约10％、约5％、约3％、约1％、约0.03％或约0.01％的平均直径。优选地，所述油包水乳液是单分散的乳液，即包含体积相同的液滴的乳液。用于产生这种均匀的直径分布的技术为专业技术人员公知(参见例如wo2004/091763)。通常，所述w/o液滴具有小于1nl、更优选地小于500 pl的体积。优选地，w/o液滴具有10至500pl、更优选地10至250pl、甚至更优选地10至100pl范围内的体积。在优选实施方式中，w/o液滴具有15至50pl、优选地20pl至40pl范围内的体积。
[0114]
所述水相通常为水或水性缓冲溶液例如tris hcl缓冲液、trishcl/edta(te)缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(pbs)或乙酸盐缓冲液。在一些实施方式中，所述水相可以含有水溶性有机溶剂例如乙醇、甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。优选地，所述水相是水或水性缓冲溶液。
[0115]
用于产生所述w/o液滴的油相可以选自含氟油类例如fc40油fc43fc77油fc72fc84 fc70hfe-7500hfe-7100全氟代己烷、全氟代辛烷、全氟代癸烷、galden-ht135油
(solvay solexis)、 galden-ht170油(solvay solexis)、galden-ht110油(solvay solexis)、 galden-ht90油(solvay solexis)、galden-ht70油(solvay solexis)、 galden pfpe液体、sv流体或zv流体，以及烃类油例如矿物油、轻矿物油、石蜡油(adepsine oil)、白凡士林、钢缆油、婴儿润肤油、drakeol、电绝缘油、热处理油、液压用油、褐煤油、液体石蜡、重质灯油、石蜡油(paraffin oil)、石油、工业用油、白油、硅油或植物油。优选地，所述油相是含氟油例如hfe-7500(cas编号： 297730-93-9)、fc40油(cas编号：51142-49-5)、galden-ht135油 (cas编号：69991-67-9)或fc77油(cas编号：86508-42-1)，更优选为hfe-7500(也被称为novec 7500)。专业技术人员可以容易地选择适合的相用油来执行本发明的方法。
[0116]
所述油包水乳液可以通过专业技术人员已知的任何方法来制备。特别地，所述油包水乳液可以在微流体系统上制备。
[0117]
分子靶标
[0118]
在本发明的方法中，将所述功能化的表面活性剂与存在于或添加到所述液滴的水相中的分子靶标接触。
[0119]
所述分子靶标可以溶解或悬浮在所述水相中。
[0120]
当在本文中使用时，术语“分子靶标”是指可能存在于所述乳液的水性中的待回收、检测和/或定量的任何种类的分子。所述分子靶标可以是生物分子，即存在于活生物体内的分子，或不是天然存在于活生物体内的化学化合物例如药物、毒物、重金属、污染物等。优选地，所述分子靶标是生物分子。生物分子的实例包括但不限于核酸例如 dna或rna分子，蛋白质例如抗体、酶或生长因子，脂类例如脂肪酸、糖脂、甾类或甘油脂类，维生素，激素，神经递质和糖类例如单糖、寡糖和多糖。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。所述蛋白质可以包含任何翻译后修饰，例如磷酸化、乙酰化、胺化、甲基化、糖基化或脂化。当在本文中使用时，术语“核酸”或“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，不论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸。优选地，所述分子靶标是蛋白质或核酸。更优选地，所述分子靶标是蛋白质。
[0121]
所述分子靶标可以在所述乳液形成之前或之后添加到所述水相。优选地，所述分子靶标存在于复杂介质例如细胞裂解物、细胞提取物例如dna、蛋白质、脂类提取物中，或采取细胞或遗传元件的形式，所述复杂介质被添加到所述水相。
[0122]
在特定实施方式中，所述分子靶标从包封在所述液滴内的遗传元件获得。优选地，每个液滴仅含有一个遗传元件。当在本文中使用时，遗传元件可以是包含核酸的分子或分子构建物。所述遗传元件可以包含任何核酸(例如dna、rna或其任何天然或人造的类似物)。此外，所述遗传元件的核酸组分可以被共价或非共价连接到一个或多个分子或结构，包括蛋白质、化学实体和基团、固相支持物例如磁珠等。
[0123]
在这个实施方式中，所述液滴还可以包含体外转录和/或翻译系统或核酸扩增系统。
[0124]
许多适合的体外转录和/或翻译系统是可商购的。这些系统通常将原核噬菌体rna聚合酶和启动子(例如t7、t3或sp6)与真核(例如兔网织红细胞或小麦胚芽)或原核(例如大肠埃希氏杆菌)提取物或用纯化的组分重构的无细胞翻译系统相组合，以从dna模板合成蛋白质。适合的系统可以随着多个参数而变化，所述参数例如所述分子靶标的本质例如核酸
或蛋白质，或所述遗传元件的本质例如起源生物体，启动子的本质等，正如对于专业技术人员显而易见的。
[0125]
扩增被区室化在乳液液滴中的遗传元件的方法是公知的并被专业技术人员广泛使用(参见例如chang等，lab chip.2013四月7 日；13(7):1225-42；zanoli和spoto，biosensors 2013,3,18-43)。具体来说，扩增可以通过任何已知的技术来进行，例如聚合酶链反应(pcr)、反转录聚合酶链反应(rt-pcr)、基于核酸序列的扩增(nasba)、环介导的等温扩增(lamp)、解旋酶依赖性扩增(hda)、滚环扩增 (rca)、多重置换扩增(mda)和重组酶聚合酶扩增(rpa)。适合的方法可以由专业技术人员根据所述被包封的遗传元件和分子靶标的性质容易地选择。
[0126]
在另一个特定实施方式中，所述分子靶标来自于用所述液滴包封的生物实体。优选地，每个液滴只含有一个生物实体。
[0127]
所述生物实体可以是任何目标生物体，包括但不限于原核细胞、真核细胞例如动物、植物、真菌或藻类细胞、原生质体或病毒粒子例如动物、植物或细菌病毒。
[0128]
所述分子靶标可以被包封在所述液滴内的生物实体分泌或暴露在所述生物实体的表面处。
[0129]
所述分子靶标也可以保留在所述生物实体内部，例如非分泌型蛋白质。在这种情况下，本发明的方法可以进一步包括裂解所述生物实体以释放出所述分子靶标。这种裂解可以使用物理、化学或生物手段来进行。具体来说，所述生物实体可以使用辐射(例如uv、x或γ
‑ꢀ
射线)或激光(参见例如rau等，appl.phys.lett.2004.84,2940
–
2942) 来裂解。所述裂解也可以通过渗透压冲击或通过添加去污剂或酶引起 (参见例如kintses等，chem.biol.2012.19,1001
–
1009；novak等， angew.chem.int.ed.50,390
–
395(2011)；brown,r.b.&audet,j.r. soc.interface 5,s131
–
s138(2008))。在这种情况下，可以通过任何已知的技术例如皮注射或液滴融合将改变渗透压平衡的组分或所述去污剂或酶引入到所述液滴内部。
[0130]
表面活性剂
[0131]
所述油包水乳液包含一种或多种表面活性剂。所述表面活性剂可以帮助控制或优化液滴尺寸、流动和均匀性并使水性乳液稳定。适合用于制备本发明的油包水乳液的表面活性剂通常是非离子型的，并含有至少一个亲水头部和一个或多个亲脂尾部，优选为一个或两个亲脂尾部。所述亲水头部和尾部可以直接相连或通过间隔物组成部分相连。当在本文中使用时，二嵌段表面活性剂是指包含一个亲水头部和一个亲脂链的表面活性剂。三嵌段表面活性剂是指包含一个亲水头部和两个亲脂链的表面活性剂。适合的表面活性剂的实例包括但不限于基于脱水山梨糖醇的羧酸酯例如脱水山梨糖醇单月桂酸酯(span 20)、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(span 40)、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(span 60) 和脱水山梨糖醇单油酸酯(span 80)，聚乙二醇与聚丙二醇的嵌段共聚物例如三嵌段共聚物ea-表面活性剂(raindance technologies)和 dmp(二吗啉磷酸酯)-表面活性剂(baret,kleinschmidt,等，2009)，聚合的基于硅的表面活性剂例如abil em 90，triton x-100，以及含氟表面活性剂例如pfpe-peg和全氟聚醚(例如krytox-peg、dupontkrytox 157fsl、fsm和/或esh)。在本发明的情形中，优选的表面活性剂是含氟表面活性剂即氟表面活性剂，特别是包含全氟聚醚链的氟表面活性剂。
[0132]
优选地选择所述载体油中表面活性剂(包括非功能化和功能化的表面活性剂)的总量，以便确保所述乳液的稳定性并防止液滴的自发聚结。通常，用于产生液滴的载体油包含0.5至10％(w/w)、优选地 1至8％(w/w)、更优选地1至5％(w/w)、甚至更优选地2至5％ (w/w)的表面活性剂。在一些优选实施方式中，所述用于产生液滴的载体油包含2至2.5％(w/w)的表面活性剂(包括非功能化和功能化的表面活性剂)。
[0133]
功能化的表面活性剂
[0134]
在步骤(a)中提供的油包水乳液液滴在它们的界面处包含功能化的表面活性剂。这些液滴的界面可以只包含功能化的表面活性剂或包含功能化和非功能化的表面活性剂的混合物。功能化与非功能化的表面活性剂之间的比率可以随着本发明的方法的具体用途而变，并且可以由专业技术人员容易地调整。例如，功能化的表面活性剂可以占总表面活性剂的1至50％(w/w)，优选地2至30％(w/w)，更优选地 5至20％(w/w)。
[0135]
当在本文中使用时，“功能化的表面活性剂”是指在亲水头部或亲脂尾部之一上带有至少一个功能性组成部分的表面活性剂。在本发明的情形中，所述功能性组成部分优选存在于所述表面活性剂的亲水头部上。在优选实施方式中，术语“功能化的表面活性剂”是指包含连接到功能化的亲水头部的一个或两个亲脂尾部、优选地两个亲脂尾部(即三嵌段表面活性剂)的表面活性剂。
[0136]
所述功能化的表面活性剂可以包含一个或多个(例如2、3、4、5 或6个)功能化的亲水头部，由此所述表面活性剂可以结合到一个或多个(例如2、3、4、5或6个)化学探针(或结合中间体)。在其中所述表面活性剂包含多个功能化的亲水头部的实施方式中，这些头部可以是一致或不同的，并且可以结合到一致或不同的化学探针(或结合中间体)。
[0137]
所述功能化的表面活性剂的一个或多个亲水头部可以各自包含一个或多个(例如2、3、4或5个)功能性组成部分。
[0138]
当在本文中使用时，“功能性组成部分”实际上是为所述表面活性剂提供目标功能的任何化学或生物实体。例如，所述功能性组成部分能够在所述表面活性剂与目标实体之间产生共价相互作用。换句话说，所述功能性组成部分可以包含能够促进与所述目标实体形成共价键的化学反应性基团。例如，所述功能性组成部分可以包含适合于通过点击化学或通过生物偶联反应产生共价键的化学反应性基团。生物偶联反应涵盖了氨基酸例如赖氨酸、半胱氨酸或酪氨酸与反应性基团之间的反应，如koniev,o.,wagner,a,chem.soc.rev.,44,5495(2015) 中所详述。例如，所述功能性组成部分可以包含马来酰亚胺基团或方酸(squarane)组成部分，它们分别能够与半胱氨酸或酪氨酸残基反应。生物偶联反应被例如描绘在下表中：
[0139][0140]
或者，所述功能性组成部分能够选择性且非共价地结合目标实体。
[0141]
在本发明中并且如下所解释的，所述功能化的表面活性剂通过与所述化学探针的相互作用参与捕获存在于所述乳液的水相中的分子靶标。事实上，所述功能化的表面活性剂能够通过它的功能性组成部分将所述化学探针固定化在所述液滴的内界面上，由此捕获所述分子靶标。所述功能化的表面活性剂因此能够直接或间接地(即通过结合中间体)结合所述化学探针。因此，针对所述成对化学探针/功能化的表面活性剂或根据所述化学探针/结合中间体/功能化的表面活性剂的组合来选择所述功能性组成部分。不言而喻，在本发明的情形中，所述功能性组成部分被选择成能够与所述化学探针特异性结合，即使在存在复杂介质的情况下。
[0142]
专业技术人员可以根据待结合的目标实体和在所述表面活性剂与目标实体、在本情况下是所述化学探针或结合中间体之间产生的相互作用的类型(共价或非共价相互作用)，容易地选择所述功能性组成部分。
[0143]
所述乳液的每个液滴可以包含特异性针对一种或多种化学探针或结合中间体的一种或多种功能化的表面活性剂。
[0144]
在一些实施方式中，所述功能化的表面活性剂可以包含检测手段，例如荧光团或ms标签，其可以存在于它的尾部和/或头部之一上。
[0145]
在一些其他或另外的实施方式中，所述功能化的表面活性剂可以包含一个或多个功能化的亲水头部，每个亲水头部任选地连接到至少一个尾部，并且每个亲水头部任选地带有至少一个功能性组成部分。换句话说，本发明的功能化的表面活性剂可以是多嵌段和/或多功能化的表面活性剂。表面活性剂的每个亲水头部、尾部和功能性组成部分可以是一致或不同的。
[0146]
例如，本发明的功能化的表面活性剂包含式(ia)的组成部分或由式(ia)的组成部分构成：
[0147]
其中
[0148]-funct表示功能性组成部分，
[0149]-hydro表示亲水头部，
[0150]-lipo表示亲脂尾部，
[0151]-每个a和b是独立地选自0至20、优选地0至5例如0、1、 2、3、4或5的整数，并且
[0152]-c是1至20、优选地1至10例如1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10的整数，
[0153]
前提是所述功能化的表面活性剂包含连接到带有至少一个funct的hydro组成部分的至少一个lipo基团。
[0154]
本发明人显示，所述功能化的表面活性剂的亲水部分(即hydro 头部)与亲脂部分(即lipo链)之间的重量比可能对所述功能化的表面活性剂稳定所述乳液的能力有一定影响。在一些实施方式中，所述功能化的表面活性剂中“亲脂部分”与“亲水部分”的重量比为2.5至 15，例如2.5至7.5、3.0至7.0、6至15或5.5至14。
[0155]
2.5至15的重量比涵盖2.5至5.0、5.0至6.0、6.0至7.0、7.0至 10、10至12、12至13、13至14的重量比。
[0156]
在一些实施方式中，每个hydro头部具有500至2500g.mol-1
、例如500至1500g.mol-1
、600至1500g.mol-1
、600至1000g.mol-1
或 1000至1500g.mol-1
范围内的分子量。在一些其他或另外的实施方式中，每个lipo链具有4000至8500g.mol-1
、例如6000至7000g.mol-1
、例如约6 500g.mol-1
的分子量。
[0157]
在一些实施方式中，所述功能化的表面活性剂包含式(ia)的组成部分或由其构成，所述式(ia)的组成部分包含至少两个hydro组成部分(即c为至少2)，每个hydro带有至少一个funct组成部分(即每个a为至少1)，并且其中b为0，例外的是一个hydro组成部分的情况，其中b为至少1，优选为2或3。
[0158]
在一些实施方式中，所述功能化的表面活性剂包含式(ib)的组成部分或由式(ib)的组成部分构成
[0159][0160]
其中：a、b、lipo、hydro和funct如式(ia)中所定义。
[0161]
在一些实施方式中，所述功能化的表面活性剂具有式(ib)，其中a是1或2，并且b选自1、2、3和4。
[0162]
在一些其他实施方式中，所述功能化的表面活性剂具有式(ib)，其中a是1至6、更优选地1、2或3的整数，并且b是1至3、更优选地1或2的整数。
[0163]
在另一个实施方式中，所述功能化的表面活性剂包含式(ic)的组成部分或由式(ic)的组成部分构成：
[0164][0165]-其中a、hydro和funct如式(ib)或(ia)中所定义。优选地，a是1、2或3。
[0166]
在一些优选实施方式中，存在于所述功能化的表面活性剂中，特别是如式(ia)、(ib)或(ic)任一者中所描绘的lipo、hydro和 funct组成部分如下：
[0167]-每个lipo是亲脂尾部-，其独立地选自任选地被一个或多个杂原子中断并任选地被选自c
1-c3烷基、卤素如f、cl或br、-oh、-ome 和-cf3的一个或多个基团取代的饱和或不饱和烃链，全氟聚醚链，全氟化碳链及其组合，
[0168]-每个hydro是亲水头部，其包含独立地选自二吗啉磷酸酯基团、聚醚、聚醚胺、聚甘油及其组合的组成部分，
[0169]-每个funct是所述表面活性剂的功能性组成部分，并且能够通过共价或非共价相互作用与所述化学探针或结合中间体相互作用。
[0170]
当所述表面活性剂包含多个lipo基团时，所述lipo可以是相同或不同的。
[0171]
当所述表面活性剂包含多个hydro基团时，所述hydro基团可以是相同或不同的。
[0172]
当所述表面活性剂包含多个funct组成部分时，所述funct基团可以是相同或不同的。在一些实施方式中，所述表面活性剂包含至少两个不同的funct。在所述功能化的表面活性剂中存在不同的 funct组成部分，可以对选择性捕获不同的分子靶标有用。
[0173]
一方面lipo和hydro，另一方面hydro和funct，可以直接连接或通过接头基团或连接物连接。接头基团是指包含杂原子并且能够连接两个化学基团的组成部分。优选地，所述接头基团选自-o-、 c(＝o)-oc(o)-、-c(o)o-、-oc(o)o-、-s-、-ss-、-sc(o)-、-oc(s)-、-nr
1-、
ꢀ‑
nr1c(o)-、-c(o)nr
1-、-nr1c(s)-、-c(s)nr
1-、-oc(o)s-、-oc(s)o-、
ꢀ‑
sc(o)o-、-oc(s)s-、-sc(o)s-、-sc(s)o-、-sc(s)s-、-oc(o)nr
1-、
ꢀ‑
oc(s)nr
1-、-nr1c(s)o-、-nr1c(o)s-、-nr1c(o)nr
2-、-nr1c(s)nr
2-、
ꢀ‑
sc(o)s-、-sc(s)o-、-s(o)-、-s(o)
2-、-o(cr1r2)o-、-c(o)o(cr1r2)o-、-oc(o)o(cr1r2)o-、-p(o)(r1)-、
ꢀ‑
p(o)(or1)-、-p(o)(r1)o-、-op(o)(or1)-、-op(o)(r1)o-、-nr1p(o)(r2)-、
ꢀ‑
nr1p(o)(or2)-、-nr1p(o)(r2)o-、-op(o)(or1)-和-op(o)(r1)o-，其中 r1和r2独立地是h或ch3，优选为h，或通过连接物。
[0174]
当在本文中使用时，“连接物”是指包含2至40个、优选地2至 30个碳原子和至少一个如上所述的接头基团的任何化学基团。连接物的实例被例如描述在美国专利申请2010/0240883的表4中。适合的连接物的另一个实例是亚氨基二乙酸组成部分。
[0175]
在一些实施方式中，所述连接物包含至少一个环状组成部分。所述环状组成部分通常具有5至14个环原子，并且可以包含一个或多个杂原子例如o、n或s。所述环状组成部分可以是脂族或芳族的。所述环状组成部分可以包含稠合在一起的2或3个环。优选的环状组成部分是5原子或6原子环。
[0176]
重要的环状组成部分涵盖但不限于吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、噁唑、三唑、苯基、萘、吡啶、、哒嗪、嘧啶、吡嗪、噁嗪、二噁英、三嗪、哌嗪、吗啉和噻嗪。
[0177]
在一些其他实施方式中，所述连接物是饱和或不饱和烃链，其任选地被一个或多个杂原子或被一个或多个环或杂环中断；并任选地被选自c
1-c3烷基、卤素例如f、cl或br、-oh、-ome和-cf3的一个或多个基团取代；所述连接物在其至少一个端部具有接头基团。在一些实施方式中，所述连接物可以具有下式：
[0178]-(x1)
a-(ch2)n-(y)
b-(ch2)
m-(x2)
c-，其中
[0179]-a、b和c独立地是1或0，
[0180]-n和m独立地是0至30、优选地0至10例如1、2、3、4或 5的整数，
[0181]-x1和x2独立地选自如上所述的接头基团，特别是
–
o-、-nh2、-c(＝o)-、oc(＝o)、(c＝o)o、nhc(＝o)、c(＝o)nh、 nhc(＝o)nh、nhc(＝o)o和oc(＝o)nh，
[0182]-y选自o、nh和3至8元、优选地5至6元脂族或芳族环。在一些实施方式中，y是杂环，优选为5元杂环例如三唑、吡咯、噻吩或咪唑。
[0183]
在一些可替选或另外的实施方式中，所述功能化的表面活性剂包含至少一个可切断的连接物。所述至少一个可切断的连接物优选地将 lipo组成部分和hydro组成部分连接在一起。所述可切断的连接物可以选自可酶促切断的连接物、对亲核试剂/碱敏感的连接物、对还原敏感的连接物、可光切断的连接物、对亲电试剂/酸敏感的连接物和对氧化敏感的连接物，例如如leriche等，bioorg.med.chem.20,571 (2012)中所描述。可切断的连接物的其他实例可以在west等，currentdrug discovery technologies,2,123(2005)中到。
[0184]
优选地，所述表面活性剂包含一个或两个lipo链，其可以是一致或不同的。在一些实施方式中，所述表面活性剂包含两个一致的lipo 链。
[0185]
在一些实施方式中，存在于所述表面活性剂中的每个lipo独立地选自全氟聚醚链和全氟化碳链。优选地，每个lipo是包含10至50个单体、优选地25至45个单体的全氟聚醚链。
[0186]
全氟聚醚链的实例涵盖但不限于聚(全)氟代亚甲基氧化物、聚 (全)氟代亚乙基氧化物、聚(全)氟代亚丙基氧化物(也被称为聚六氟亚丙基氧化物)和聚(全)氟代亚丁基氧化物。
[0187]
在一些实施方式中，每个lipo是包含10至50个单体的聚六氟亚丙基氧化物。例如，每个lipo可以包含下述组成部分(l1)：
[0188][0189]
其中n是25至45、优选地35至40的整数。
[0190]
在一些实施方式中，每个hydro包含至少一个聚醚链，其包含 2至50个单体，优选地2至30个单体，更优选地2至10个单体，例如2、3、4、5、6、7、8、9和10个单体。hydro可以包含多个聚醚链，例如2、3、4、5、6或7个聚醚链，每个聚醚链包含2至50个单体。所述聚醚链优选被线性连接。两个连串的聚醚链之间的连接可以是任何类型，并且可以例如通过如上所述
的接头基团或连接物来进行。每个聚醚链可以带有一个或多个funct组成部分，其可以是相同或不同的。
[0191]
适合的聚醚链的实例涵盖聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇二胺和聚丙二醇三胺。
[0192]
例如，hydro可以包含一个或多个聚乙二醇链，其包含2至30 个、优选地2至10个单体，所述聚乙二醇链被线性连接。
[0193]
正如将在下文进一步详细描述的，每个功能性组成部分funct 可以是任何类型的，前提是funct包含能够与目标化学探针或结合中间体产生共价或非共价相互作用的组成部分。
[0194]
因此，每个funct根据与所述化学探针或结合中间体实现的相互作用来选择。funct的实例在下文题为“功能性表面活性剂与化学探针之间的相互作用”的章节中进一步详细描述。
[0195]
存在于所述表面活性剂中的funct组成部分可能相同或可能不同。在一些实施方式中，所述功能化的表面活性剂包含1至4个funct 组成部分，优选地1或2个funct组成部分。
[0196]
在一些实施方式中，每个funct组成部分具有低于2000g.mol-1
、优选地低于1000g.mol-1
的分子量。
[0197]
在一些其他实施方式中，每个funct包含适合于执行点击反应的反应性化学基团，所述点击反应例如在pct/ep2015/060805和 pct/ep2015/063750中所描述的叠氮化物-炔烃偶极加成和亚氨基悉尼酮或悉尼酮衍生物-具有环张力的炔烃环加成，所述申请的公开内容通过引用并入本文。
[0198]
例如，每个funct可以包含叠氮基或炔烃例如具有环张力的炔基。具有环张力的炔基涵盖但不限于环辛炔骨架(a)-(f)：
[0199][0200]
在一些其他实施方式中，每个funct能够促进与所述化学探针的直接或间接非共价相互作用。每个func可以选自生物素、亲和素和链亲合素，优选为生物素。
[0201]
在一些实施方式中，所述功能化的表面活性剂具有式(ic)。在一些更具体的实施方式中，本发明的功能化的表面活性剂是式(ii)的二嵌段表面活性剂：
[0202][0203]
其中：
[0204]-n是25至45、优选地35至40的整数，
[0205]-p和q是独立地选自1至10、优选地2至8的整数，
[0206]-y1和y2独立地选自如上所述的接头和连接物，特别地y1和 y2选自
–
o-、-nh2、-c(＝o)-、oc(＝o)、(c＝o)o、nhc(＝o)、c(＝o)nh、nhc(＝o)nh、nhc(＝o)o和oc(＝o)nh，并且
[0207]-funct如下文进一步定义，并且是指所述功能性表面活性剂的功能性组成部分。例如，funct包含选自生物素、叠氮基、炔基、特别是如下所述的具有环张力的炔基的组成部分。
[0208]
式(ii)的功能性表面活性剂的实例是例如：
[0209][0210]
(i)其中n＝35-40，p＝5并且q＝4，
[0211][0212]
(ii)其中n＝35-40，p＝q＝5
[0213][0214]
(iii)其中n＝35-40，p＝q＝5，和
[0215][0216]
(iv)其中n＝35-40，p＝5，q＝4
[0217]
在一些其他实施方式中，本发明的功能化的表面活性剂是式(iiia) 的三嵌段表面活性剂：
[0218][0219]
其中
[0220]-p和q是独立地选自1至10、优选地2至8的整数，
[0221]-krytox是其中n为25至45，优选地n＝35-40，
[0222]-funct如下文进一步定义，并且是指所述功能性表面活性剂的功能性组成部分。例如，funct包含选自生物素、叠氮基、炔基、特别是如下所述的具有环张力的炔基的组成部分。
[0223]
式(iiia)的功能化的表面活性剂的实例是例如：
[0224][0225]
其中n＝35-40并且p＝6、5或4，和
[0226][0227]
其中n＝35-40，并且p＝6、5或4。
[0228]
在特定情况下，本发明涉及一种功能化的表面活性剂，其包含：
[0229]-一个或两个亲脂尾部(lipo)，其连接到
[0230]-亲水头部(head)，所述亲水头部带有至少一个，例如1、 2、3或4个式(h1)的组成部分：
[0231]
其中d是1至12、例如2至6的整数。
[0232]
所述lipo如上所定义。在优选实施方式中，lipo选自包含10 至50个单体、优选地25至45个单体的全氟聚醚链和全氟化碳链。全氟聚醚链的实例涵盖但不限于聚(全)氟代亚甲基氧化物、聚(全) 氟代亚乙基氧化物、聚(全)氟代亚丙基氧化物(也被称为聚六氟亚丙
基氧化物)和聚(全)氟代亚丁基氧化物。例如，所述功能化的表面活性剂中存在的每个lipo可以包含下述组成部分(l1)或由其构成：
[0233][0234]
其中n是25至45、优选地35至40的整数。
[0235]
在一些实施方式中，所述功能化的表面活性剂中的亲脂部分(即所述lipo链)与亲水部分(即所述亲水头部(head))的重量比为 2.5至15，例如6至16或6.5至14。
[0236]
在一些另外的或可替选实施方式中，所述功能化的表面活性剂的分子量为6000至20000g.mol-1
，例如6 500至16 000g.mol-1
或7 000 至15 000g.mol-1
。
[0237]
在一些实施方式中，本发明的功能化的表面活性剂包含：
[0238]-一个或两个亲脂尾部(lipo)，其包含式(l1)的组成部分或由其构成：
[0239][0240]
其中n是25至45、优选地35至40的整数，所述亲脂尾部连接到
[0241]-亲水头部(head)，所述亲水头部带有至少一个，例如1、 2、3或4个下式(h1)的组成部分：
[0242]
其中d是1至12，例如2至6的整数。
[0243]
优选地，所述功能化的表面活性剂中的亲脂部分与亲水部分的重量比为2.5至15，优选为2.5至7.5。
[0244]
在一些实施方式中，所述功能化的表面活性剂的亲水头部可以包含至少两个下式(h1)的组成部分：
[0245][0246]
例如，所述功能化的表面活性剂的亲水头部可以包含至少一个式 (h2)的组成部分：
[0247]
其中d是1至12，例如2至6的整数，例如3、4或5。
[0248]
在特定实施方式中，本发明的功能化的表面活性剂包含：
[0249]-1或2个亲脂尾部(lipo)，其包含式(l1)的组成部分或由其构成，所述1或2个lipo被连接到
[0250]-亲水头部(head)，所述亲水头部包含1或2个如上所定义的式(h2)的组成部分。
[0251]
例如，所述功能化的表面活性剂可以包含一个h2组成部分和一个 l1组成部分。或者，所述功能化的表面活性剂可以包含两个h2组成部分和一个l1组成部分。作为另一个实例，所述功能化的表面活性剂可以包含两个h2组成部分和两个l1组成部分。
[0252]
所述功能化的表面活性剂的分子量为6000至20000g.mol-1
，例如 6500至16000g.mol-1
或7000至15000g.mol-1
。
[0253]
所述亲水头部(head)通常包含中央组成部分(central)。所述中央组成部分是c
2-c
40
、优选地c
2-c
30
基团，其可以包含一个或多个杂原子例如n、o或s。所述中央组成部分带有所述h1或h2组成部分，并且被连接到所述至少一个lipo基团。所述中央组成部分通常是连接物，其可以任选地包含一个或多个聚醚链，例如1至4个聚醚链。所述聚醚链通常包含2至12个单体，例如2至6个单体。优选的聚醚链是聚乙二醇及其衍生物。存在于所述中央组成部分中的连接物可以是如上所定义的任何连接物。
[0254]
例如，所述连接物可以包含至少一个具有5至14个环原子的环状组成部分。所述环原子可以包含一个或多个杂原子例如o、n或s。所述环状组成部分可以是脂族或芳族的。所述环状组成部分可以包含稠合在一起的2或3个环。优选的环状组成部分是5原子或6原子环。重要的环状组成部分涵盖但不限于吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、噁唑、三唑、三嗪、苯基、萘、吡啶、、哒嗪、嘧啶、吡嗪、噁嗪、二噁英、哌嗪、吗啉和噻嗪。
[0255]
所述l1和/或h2组成部分可以直接地或利用接头和/或聚醚链连接到所述环状组成部分。
[0256]
作为另一个实例，所述连接物可以是在其至少一个端部具有接头基团的饱和或不饱和烃链。所述烃链任选地被一个或多个杂原子或被一个或多个碳环或杂环中断。所述烃链可以进一步被选自c
1-c3烷基、卤素如f、cl或br、-oh、-ome和-cf3的一个或多个基团取代。
[0257]
例如，所述中央组成部分可以具有下式之一：
[0258]-其中e是1至12、优选地2至6的整数，例如3、4或5，x1和y1独立地选自nh、ch2和o，
[0259]-其中y2和y3独立地选自nh、ch2或o，并且 x2、x3和x4独立地选自ch和n，以及
[0260]-其中
[0261]
o x2、x3和x4独立地选自ch和n，
[0262]
o y8是ch或n，
[0263]
o y4、y5、y6和y7独立地选自nh、o和ch2，并且
[0264]
o e1和e2是独立地选自1至12，优选地2至6，例如2、3、4、 5或6的整数。
[0265]
包含这种中央组成部分的功能化的表面活性剂是例如：
[0266][0267]
其中l1和h2如上所定义。
[0268]
为了说明，本发明的功能化的表面活性剂可以选自：
[0269]
[0270][0271]
其中n是25至45、优选地35至40的整数，并且d是1至12、优选地2至6的整数。
[0272]
优选的表面活性剂是其中n是35至45的整数并且d是3的表面活性剂。
[0273]
所述功能化的表面活性剂可以通过化学合成来制备。例如，式(ii) 的二嵌段表面活性剂可以通过带有游离胺的基于peg的亲水链与优选地被活化为其酰氯形式的全氟聚醚酸性链之间的假肽偶联反应来制备。所述亲水链可以通过偶联两个被方便地功能化、例如用生物素或炔烃基团功能化的的寡聚乙二醇衍生物来获得。
[0274]
式(iiia)的功能化的三嵌段表面活性剂可以从三功能peg衍生物通过与krytox-cocl的假肽偶联反应来制备。所述三功能peg衍生物可以通过带有叠氮化物和n-保护的氨基组成部分的寡聚乙二醇衍生物的还原叠氮化物二聚化、然后将酸peg链与中央仲胺进行假肽偶联来制备。
[0275]
一些二嵌段和三嵌段表面活性剂的合成在下文“实施例”章节中进一步描述。
[0276]
不言而喻，本发明还涉及本文中描述的功能化的表面活性剂本身，特别是式(ia)、(ib)、(ic)、(ii)和(iiia)的或包含如上所定义的h1或h2组成部分的功能化的表面活性剂。
[0277]
功能性表面活性剂与化学探针之间的相互作用
[0278]
正如上文提到的，所述功能化的表面活性剂的功能性组成部分可以促进与所述化学探针的共价或非共价相互作用。这种相互作用可以是直接的或间接的，即通过结合中间体。
[0279]
在一个实施方式中，所述功能性组成部分促进与所述化学探针或结合中间体的共
价相互作用，优选为与所述化学探针或结合中间体的特异性共价相互作用。
[0280]
当在本文中使用时，所述功能化的表面活性剂与所述化学探针或结合中间体之间的“共价相互作用”是指在所述功能化的表面活性剂的亲水头部与所述化学探针的结合结构域或结合中间体之间产生共价键(即至少一个共价键)。所述共价键可以通过存在于所述化学探针的结合结构域或结合中间体上的化学反应性基团与存在于所述功能化的表面活性剂的功能性组成部分中的另一个化学反应性基团的反应来形成。在优选实施方式中，存在于所述化学探针或结合中间体上的和存在于所述功能化的表面活性剂上的反应性基团被选择成通过尤其是如上所述的点击反应和/或生物偶联反应来一起反应。在一些特定实施方式中，存在于所述化学探针或结合中间体上的反应性基团和存在于所述功能化的表面活性剂上的反应性基团被选择成通过点击反应来一起反应。术语“特异性共价相互作用”在本文中用于表明所述表面活性剂的功能性组成部分具有与所述化学探针的结合结构域或所述结合中间体产生共价键(即至少一个共价键)的能力，同时与存在于所述水相中的其他结构具有相对很小的可检测的反应性。优选地，所述特异性共价相互作用是所述表面活性剂的功能性组成部分与存在于所述化学探针的结合结构域或所述结合中间体中的特定反应性基团之间的生物正交(biorthogonal)或生物相容的反应。
[0281]“点击反应”或“点击化学”是由sharpless在2001年引入的概念。“点击化学”通常是指以高得率、高化学选择性为特征的化学反应，其执行起来简单并产生无害的副产物。“点击反应”通常可以在复杂介质中以高效率进行。点击反应通常被用于在两个目标实体之间产生共价杂原子连接(c-x-c)。关于点击化学的综述，人们可以参考 kolb等，angew.chem.int.ed.2001,40,2004-2021和rudolf等，currentopinion in chemical biology,2013,17:110-117。
[0282]
点击反应的实例涵盖但不限于铜催化的叠氮化物-炔烃偶极环加成(cuaac)、环张力促进的炔烃-叠氮化物环加成(spaac)、使用四嗪和具有环张力的炔烃或烯烃的狄尔斯-阿尔德反应、四嗪-异腈环加成、硫醇-烯烃点击反应例如马来酰亚胺-半胱氨酸环加成、staudinger 叠氮化物-三芳基膦缀合和悉尼酮-炔烃环加成。
[0283]
在本发明的情形中，所述点击反应可以在水性介质中进行。
[0284]
正如上文提到的，在一些情况下，所述点击反应可能是“生物正交的”或“生物相容的”，这意味着参与所述点击反应的试剂可以在大量生物实体存在下彼此选择性且快速地反应。在一些实施方式中，所述点击反应可以在包含活细胞的介质中进行，而不干扰细胞的过程。
[0285]
例如，生物相容或生物正交的点击反应涵盖无金属点击反应(即其不需要金属催化剂)。无金属点击反应的实例描绘如下：
[0286][0287]
其他重要的无金属点击反应是例如在pct/ep2015/060805和 pct/ep2015/063750中所描述的亚氨基悉尼酮或悉尼酮衍生物-具有环张力的炔烃环加成，所述申请的公开内容通过引用并入本文。
[0288]
对于与生物正交化学、包括点击化学相关的综述，人们可以参考 sletten和bertozzi，angew.chem.int.ed.engl.2009,48(38):6974-6998，其公开内容通过引用并入本文。
[0289]
优选的点击反应是无金属反应，即不需要金属催化剂例如铜盐存在的点击反应。
[0290]
在本发明的情形中，优选的无金属点击反应是环张力促进的炔烃
‑ꢀ
叠氮化物1,3-偶极环加成(spaac)，这是指叠氮基与具有环张力的炔烃组成部分之间的反应，其导致三唑组成部分的形成。通常，这种点击反应不需催化剂存在即可发生。
[0291]
优选的具有环张力的炔烃是c
6-c
30
炔烃，其中叄键在空间上具有张力，特别是在环辛炔骨架中。所述具有环张力的炔烃可以包含环辛炔骨架，其可以任选地被一个或多个取代基例如卤素取代，和/或稠合到一个或多个环，包括杂环。例如，所述具有环张力的炔烃可以包含下述环辛炔骨架(a)-(f)之一：
[0292][0293]
含有所述骨架之一的具有环张力的炔烃可以从可商购的试剂例如 oct、dibo、barac、alo、difo、mofo、dibac和dimac制备：
[0294][0295]
因此，所述表面活性剂的功能性组成部分(即funct)可以带有叠氮基，而所述化学探针的结合结构域或结合中间体可以带有具有环张力的炔烃骨架，反之亦然。优选地，所述具有环张力的炔基选自如上所示的环辛炔骨架(a)-(f)，更优选为环辛炔骨架(f)。
[0296]
在一些实施方式中，所述化学探针或结合中间体可以带有多个化学反应性基团，例如2、3、4、5或6个化学反应性基团。所述化学基团可以使所述化学探针或结合中间体能够与多个功能化的表面活性剂相互作用。或者，所述化学基团可以使所述化学探针或结合中间体能够与带有多个功能性组成部分例如2、3或4个功能性组成部分的单个功能化的表面活性剂生成多个共价键。
[0297]
正如上文提到的，存在于所述化学探针的结合结构域或结合中间体中的化学反应性基团优选地选自具有环张力的炔烃和叠氮基。优选地，所述化学探针或结合中间体带有单一类型的化学反应性基团。所述化学反应性基团可以通过生物偶联反应引入。仅仅是为了说明，所述化学探针的结合结构域或结合中间体可以带有下述组成部分之一：
[0298][0299]
在另一个实施方式中，所述功能性组成部分促进与所述化学探针或结合中间体的非共价相互作用。
[0300]
当在本文中使用时，所述功能化的表面活性剂与所述化学探针或结合中间体之间的非共价相互作用是指形成包含所述表面活性剂的功能性组成部分和所述化学探针的结
合结构域或所述结合中间体的复合物。优选地，所述功能性组成部分特异性结合到所述化学探针的结合结构域或结合中间体。
[0301]
术语“特异性结合”在本文中用于表明所述表面活性剂的功能性组成部分具有特异性识别所述化学探针的结合结构域或所述结合中间体并与其相互作用的能力，同时与所述水相中存在的其他结构具有相对很小的可检测的反应性。通常，由于非共价力例如静电力、氢键、范德华力和疏水力，在任两个分子之间存在低程度的亲和，所述非共价力不限于分子上的特定位点，并且基本上独立于分子的身份。这种低程度的亲和可以引起非特异性结合。相反，当两个分子特异性结合时，亲和程度远大于这些非特异性结合相互作用。在特异性结合中，每个分子上的特定位点相互作用，所述特定位点在结构上互补，结果是形成非共价键的能力得以提高。特异性可以使用例如biacore仪器，通过结合或竞争测定法来相对确定。分子x对其配偶体y的亲和性通常可以用解离常数(kd)代表。在优选实施方式中，代表所述表面活性剂的功能性组成部分与所述化学探针的结合结构域或结合中间体的亲和性的kd为1.10-6
m或更低，优选为1.10-7
m或更低，甚至更优选为1.10-8
m或更低。
[0302]
根据所述表面活性剂的功能性组成部分与所述化学探针的结合结构域或结合中间体之间的相互作用的类型，所述功能性组成部分可以包含例如抗体或其片段或衍生物例如fab、fab'、f(ab)2、f(ab')2、f(ab)3、 fv、单链fv(scfv)、双体抗体或vhh、配体、肽或蛋白质、适体、多糖、小的有机分子、蛋白质标签或阳离子结合基团，而所述化学探针的结合结构域或所述结合中间体包含特异性结合所述功能性组成部分的基团，或者反之亦然。
[0303]
所述功能化的表面活性剂与所述化学探针或结合中间体之间的相互作用可以依赖于各种不同的相互作用系统，例如亲和系统、配体/配体抗体对或蛋白质标签。
[0304]
例如，所述功能化的表面活性剂与所述化学探针或结合中间体之间的相互作用可以依赖于阳离子结合基团(例如次氮基三乙酸酯 (nta，用于结合到his标签)、亚氨基二乙酸或三氮杂环壬烷)、蛋白质结合标签或配体/配体抗体对(例如抗体/抗原例如生物素/抗生物素抗体和/抗抗体或配体/受体)。
[0305]
在优选实施方式中，所述表面活性剂的功能性组成部分包含蛋白质结合标签，而所述化学探针或所述结合中间体包含特异性结合所述标签的蛋白质、肽或其片段，或者反之亦然。大量蛋白质标签为专业技术人员所公知(参见例如young等，biotechnol.j.2012,7,620
–
634)，并包括例如生物素(用于结合到链亲合素或亲和素衍生物)、谷胱甘肽(用于结合连接到谷胱甘肽-s-转移酶的蛋白质或其他物质)、麦芽糖(用于结合连接到麦芽糖结合蛋白的蛋白质或其他物质)、凝集素 (用于结合到糖组成部分)、c-myc标签、血凝素抗原(ha)标签、硫氧还蛋白标签、flag标签、聚arg标签、聚his标签、strep标签、 ompa信号序列标签、钙调蛋白结合肽、几丁质结合结构域、纤维素结合结构域、s标签和softag3等。
[0306]
在一些实施方式中，所述化学探针与所述功能化的表面活性剂直接一起相互作用。例如，所述表面活性剂的功能性组成部分可以包含蛋白质标签例如生物素，而所述化学探针的结合结构域包含与所述标签特异性相互作用的基团例如链亲合素或亲和素，或者反之亦然。或者，所述表面活性剂的功能性组成部分可以包含适体或抗体，而所述化学探针包含所述适体或所述抗体的配体，或者反之亦然。
[0307]
在一些其他实施方式中，所述化学探针和所述功能化的表面活性剂通过结合中间体相互作用。在这种情况下，所述结合中间体能够结合所述化学探针和所述表面活性剂两
者，并因此充当所述两个实体之间的桥。因此，所述结合中间体含有能够结合到所述化学探针的第一结合结构域和能够结合所述功能化的表面活性剂的第二结合结构域。所述中间体的结合结构域可以是任何类型的，并且根据所述表面活性剂的功能性组成部分和所述化学探针的结合结构域来选择。
[0308]
例如，所述结合中间体可以是链亲合素，而所述表面活性剂的功能性组成部分和所述化学探针的结合结构域两者包含生物素。在这个实施方式中，所述化学探针可以是特异性针对所述分子靶标的生物素化的适体或生物素化的抗体。
[0309]
所述化学探针可以包含一个或多个(例如2、3或4个)结合结构域，由此所述化学探针可以结合到一个或多个(例如2、3或4个)功能化的表面活性剂或结合中间体。在这些实施方式中，所述化学探针的结合结构域可以是一致或不同的，并且可以结合到一致或不同的功能化的表面活性剂或结合中间体。
[0310]
分子靶标与化学探针的接触
[0311]
在本发明的方法中，将存在于所述水相中的分子靶标与化学探针接触，所述化学探针包含(i)至少一个能够特异性结合到所述分子靶标的捕获组成部分，和(ii)至少一个能够直接或间接地结合到所述功能化的表面活性剂的结合结构域。
[0312]
所述化学探针可以包含一个或多个(例如2、3或4个)捕获组成部分，由此所述化学探针可以结合到一个或多个(例如2、3或4个) 分子靶标。在其中所述化学探针包含多个捕获组成部分的实施方式中，这些组成部分可以是一致或不同的，并且可以靶向一致或不同的分子靶标。
[0313]
所述化学探针的捕获组成部分可以是能够特异性结合所述分子靶标的任何基团。这些基团的实例包括但不限于所述分子靶标的抗体、抗体的片段或衍生物、适体、镜像异构适体、肽适体、配体或底物，能够杂交所述分子靶标的核酸，以及能够结合所述分子靶标的受体或受体片段。
[0314]
在一些优选实施方式中，所述化学探针的捕获组成部分是针对所述分子靶标的抗体、这种抗体的能够结合到所述分子靶标的片段或衍生物。
[0315]
所述化学探针的结合结构域，即结合所述功能化的表面活性剂或所述结合中间体的结构域，可以是任何类型，前提是它包含如上解释并详细描述的能够与所述功能化的表面活性剂或所述结合中间体产生共价或非共价相互作用的组成部分。
[0316]
所述化学探针的结合结构域可以由专业技术人员根据所述表面活性剂的功能化的组成部分的性质，或者当使用结合中间体时所述结合中间体的与所述化学探针相互作用的结构域的性质，来选择。
[0317]
在优选实施方式中，所述化学探针的结合结构域包含选自用于点击反应的反应性化学基团和蛋白质标签的基团。具体来说，所述化学探针的结合结构域可以包含选自叠氮基、炔基、具有环张力的环炔基和蛋白质标签例如生物素的组成部分。
[0318]
在一些实施方式中，所述化学探针是针对所述分子靶标的抗体，并且用蛋白质标签、优选为生物素，或者用于点击反应的化学反应性基团例如具有环张力的环炔基、叠氮基或亚氨基悉尼酮或悉尼酮衍生物功能化。
[0319]
在特定实施方式中，所述表面活性剂的功能性组成部分包含叠氮基，并且所述化学探针的结合结构域包含具有环张力的环炔基，或者反之亦然。
[0320]
在另一个特定实施方式中，所述表面活性剂的功能性组成部分是生物素，并且所述化学探针的结合结构域是链亲合素，或者反之亦然。
[0321]
在其他特定实施方式中，所述表面活性剂的功能性组成部分是生物素，所述结合中间体是链亲合素，并且所述化学探针的结合结构域是生物素。
[0322]
在一些实施方式中，所述化学探针和/或所述结合中间体可以包含至少一个可切断的连接物。所述可切断的连接物可以如上文对所述表面活性剂所定义。
[0323]
所述化学探针可以在所述液滴产生期间，任选地与所述分子靶标一起被包封在所述液滴内，或者可以通过专业技术人员已知的任何方法例如皮注射或液滴融合，添加到所述液滴。
[0324]
在其中所述化学探针能够直接与所述功能化的表面活性剂相互作用的实施方式中，所述化学探针结合所述分子靶标，并通过与所述表面活性剂的功能性组成部分相互作用将其捕获在所述液滴的内界面处。
[0325]
在其中所述化学探针通过结合中间体与所述功能化的表面活性剂相互作用的实施方式中，所述化学探针结合所述分子靶标和所述结合中间体，并通过所述结合中间体与所述表面活性剂的功能性组成部分的结合将所述分子靶标捕获在所述液滴的内界面处。
[0326]
在本发明的方法中，所述化学探针、功能化的表面活性剂、分子靶标和任选地所述结合中间体之间的结合，可以以任何顺序发生。在一个实施方式中，所述化学探针同时结合到所述分子靶标和功能化的表面活性剂，任选地通过结合中间体。在另一个实施方式中，所述化学探针首先与所述分子靶标相互作用，由此在所述分子靶标与所述化学探针之间形成复合物。然后，所述复合物通过所述化学探针实体，并任选地通过结合中间体，结合到所述功能化的表面活性剂。在另一个实施方式中，所述化学探针任选地通过结合中间体首先结合到所述表面活性剂，并且随后结合到所述分子靶标。
[0327]
所述乳液的每个液滴可以包含特异性针对一个或多个分子靶标的一个或多个化学探针。在其中每个液滴包含多个化学探针的实施方式中，这些化学探针可以结合到一致或不同的功能化的表面活性剂。
[0328]
优选地，在其中所述表面活性剂的功能性组成部分或所述化学探针的结合结构域或所述结合中间体包含具有环张力的环炔基的实施方式中，所述水相还包含泊洛沙姆，例如pluronic如f-127 (sigma)，其是一种聚丙二醇的泊洛沙姆(三嵌段共聚物)，它是疏水的并粘附于疏水表面，以防止具有环张力的环炔基吸附在微流体芯片基质、特别是pdms芯片上。
[0329]
微流体系统
[0330]
在优选实施方式中，本发明的方法使用微流体系统来执行。
[0331]
当在本文中使用时，术语“微流体装置”、“微流体芯片”或“微流体系统”是指包括至少一个微流体通道的器件、装置或系统。
[0332]
所述微流体系统可以是或包含硅基芯片，并且可以使用各种不同技术来制造，所述技术包括但不限于热压印、弹性体的模制、注射模制、liga、软蚀刻、硅制造和相关的薄膜加工技术。适用于制造微流体装置的材料包括但不限于环烯烃共聚物(coc)、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)和玻璃。优选地，微流体装置通过标准的软蚀刻技术在pdms中制备，随后粘合到显微镜载玻片。由于一些材料的亲水或疏水性质，例如
玻璃，其吸附某些蛋白质并且可以抑制某些生物过程，因此可能需要钝化剂。适合的钝化剂在本领域中是已知的，并包括但不限于硅烷、氟代硅烷、聚对二甲苯、正十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)、泊洛沙姆例如pluronics。
[0333]
当在本文中使用时，术语“通道”是指在制品(例如基材)上或所述制品中至少部分引导流体流动的特征。术语“微流体通道”是指横截面尺寸小于1mm，通常小于500μm、200μm、150μm、100μm 或50μm，并且长度与最大横截面尺寸之比为至少2:1，更通常为至少 3:1、5:1、10:1或更大的通道。应该指出，术语“微流体通道”、“微通道”和“通道”在本描述中可互换使用。所述通道可以具有任何横截面形状(圆形、椭圆形、三角形、不规则形、正方形或矩形等)。优选地，所述通道具有正方形或矩形横截面形状。所述通道可以被部分或完全覆盖，或者未覆盖。
[0334]
当在本文中使用时，术语通道的“横截面尺寸”垂直于流体流动方向测量。
[0335]
油包水乳液液滴可以在用于执行本发明的方法的装置上(“芯片上”)或在另一个系统上(“芯片外”)产生。
[0336]
在一个实施方式中，w/o液滴的生产在芯片上液滴产生模块中进行。液滴可以通过专业技术人员已知的用于在微流体装置上产生液滴的任何技术来生产，例如同流液流中的液滴中断、t型汇流口中的交叉流动的液流和流体力学流动聚焦(由christopher和anna，2007，j.phys. d:appl.phys.40,r319-r336综述)。
[0337]
在另一个实施方式中，w/o液滴在另一个系统上产生，然后被重新注射到所述芯片上。在特定实施方式中，所述液滴在另一个系统上的液滴产生模块上产生，然后通过乳液重新注射模块重新注射在用于执行本发明的方法的系统上。通常，液滴可以通过包含ψ型结构的乳液重新注射模块重新注射，在所述ψ型结构中，注射的液滴被载体油分隔开，所述载体油通过与所述重新注射通道相连的至少一个、优选地两个侧面通道供应。
[0338]
在优选实施方式中，所述w/o液滴具有与所述液滴所在通道的与流体流动垂直的最大尺寸基本上相等的横截面尺寸。
[0339]
在一个实施方式中，所述w/o液滴以0.01hz至10khz、优选地 0.1khz至5khz、更优选地0.5khz至2.5khz范围内的频率提供(产生或重新注射)到所述流体系统。1khz的频率意味着液滴以每秒1000 个液滴的速率提供。这个频率可以由专业技术人员容易地选择和调整。
[0340]
在特定实施方式中，在本发明的方法中使用的微流体芯片包含与混合模块流体连通的液滴产生模块或乳液重新注射模块。该混合模块可以确保所述液滴内含物的均匀混合，并因此优化分子靶标在所述界面处的捕获。示例性的混合模块包括但不限于混沌混合器(stroock等， science,vol.295,pp.647
–
651,2002)或蛇形混合模块(liu等，j. microelectromech.syst,9,pp.190
–
197,2000)。
[0341]
可替选地或另外地，在本发明的方法中使用的微流体芯片可以包含延迟线，特别是允许可靠的温育时间的延迟线，例如在专利申请wo 2010/042744中所公开的。
[0342]
相反转
[0343]
发明人开发并在这里提供了用于特别是在微流体系统中可靠地进行油包水乳液液滴的相反转的系统和方法。他们证实了可以通过产生双重乳液并使所述乳液去稳定而高效地反转油包水乳液，由此产生水包油乳液。
[0344]
此外，他们显示，通过与所述功能化的表面活性剂的相互作用而捕获在所述油包水液滴的内界面上的分子，在相反转后仍然保持附连。因此这些分子暴露在所述液滴的外表面上，并且可以被用于进一步的表征或测定法。
[0345]
因此，油包水乳液液滴的相反转的方法包括：
[0346]
(i)从所述油包水乳液液滴形成双重乳液液滴；并且
[0347]
(ii)使所述乳液去稳定以便产生水包油乳液。
[0348]
当在本文中使用时，术语“双重乳液液滴”是指水包油包水液滴 (也被称为w/o/w液滴)，并且由被水性载体流体包围的油液滴内部的水性液滴(即水性核心和油外壳)构成。优选地，所述双重乳液液滴具有均匀的直径分布，即所述液滴可以具有使得不超过约10％、约 5％、约3％、约1％、约0.03％或约0.01％的所述液滴具有比所述液滴的平均直径的约10％、约5％、约3％、约1％、约0.03％或约0.01％更大的平均直径的直径分布。优选地，所述双重乳液是单分散的乳液，即包含体积相同的液滴的乳液。通常，所述w/o/w液滴具有小于2000 pl、优选地小于1500pl的体积。优选地，w/o/w液滴具有40pl至1500 pl、更优选地40pl至500pl、甚至更优选地40pl至200pl、特别是40pl至150pl范围内的体积。在优选实施方式中，油外壳与水性核心的比率在1至10(v/v)之间，优选地在1.5至5(v/v)之间。
[0349]
所述水性载体流体通常是水或水性缓冲溶液，例如tris hcl缓冲液、tris hcl/edta(te)缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(pbs)或乙酸盐缓冲液。在一些实施方式中，所述水相也可以选自有机溶液例如乙醇、甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。在优选实施方式中，所述水性载体流体是水。甚至更优选地，所述水性载体流体是低盐度的缓冲介质，例如包含tris或hepes的缓冲液，优选地浓度为100mm或更低，更优选地浓度为10mm或更低。
[0350]
所述水性载体流体可以包含一种或多种水溶性表面活性剂，例如 tween 20、tween 80、sds、triton x-100、pluronics、全氟代辛醇、 np40或chaps。优选地，所述水性载体流体包含triton x-100和/或 tween 20。优选地，所述水溶性表面活性剂以0.05％至2％、优选地0.1 至1％(w/w)范围内的浓度存在于所述水性载体流体中。
[0351]
用于在微流体系统中产生双重乳液、特别是单分散的双重乳液的方法为专业技术人员公知。具体来说，双重乳液液滴可以使用流动聚焦汇合(参见例如yan等，2013，micromachines,4,402-413和专利申请wo 2011/028764)或t型汇流口(参见例如okushima等，2004， langmuir,20,9905-9908)来产生。在优选实施方式中，双重乳液液滴使用流动聚焦汇合来形成。
[0352]
双重乳液可以通过控制用于形成这种乳液的通道的亲水性和/或疏水性来制备。具体来说，双重乳液可以使用部分亲水并且部分疏水的微流体装置来产生。
[0353]
正如由发明人在实验部分中证实的，水包油乳液可以通过电去稳定、电穿孔或自发去稳定从双重乳液液滴获得。
[0354]
在第一个实施方式中，通过施加电场使双重乳液液滴去稳定。在这个实施方式中，油包水乳液液滴的相反转的方法包括：
[0355]
(i)从所述油包水乳液液滴形成双重乳液液滴；并且
[0356]
(ii)使所述双重乳液液滴在流体系统、优选为微流体系统的亲水通道内移动，所述亲水通道的横截面与双重乳液液滴的横截面基本上相近，以及
[0357]
(iii)向所述双重乳液液滴施加电场，使得所述内部水相与外部水相合并，由此产
生水包油乳液液滴。
[0358]
所述电场被用于使w/o/w液滴的油囊去稳定或破裂，以便获得水包油乳液液滴。主要困难是保护所述油囊与水性核心之间的界面的完整性。具体来说，重要的是被捕获的分子靶标仍附连在所述反转的液滴的外表面上，用于进一步表征或测定。
[0359]
发明人观察到，如果所述w/o/w液滴的横截面显著大于所述通道的横截面，则液滴过于紧绷，并且这种几何形状导致在通道壁附近形成两个薄膜和两个水包油液滴而不是一个。相反，如果所述w/o/w液滴的横截面显著小于所述通道的横截面，液滴在所述连续相流动的影响下自身旋转。这种几何形状导致在通道壁附近形成多个薄膜和多个水包油液滴而不是一个。当所述液滴的横截面被调整到所述通道的横截面时，相界面的破裂在仅仅一个点处发生，并产生仅仅一个水包油液滴。因此，在本发明中，所述电场被施加到在具有与双重乳液液滴的横截面基本上相近的横截面的亲水通道中流动的双重乳液。
[0360]
当在本文中使用时，术语“基本上相近”表示两个数值之间足够高的相似性程度，使得本领域技术人员将认为在用所述值度量的特征 (例如横截面的尺寸)的背景中，所述两个值之间的差异是很小的或没有统计学显著性。所述两个值之间的差异是例如小于约30％、20％、 10％或5％。优选地，所述亲水通道的横截面比所述双重乳液液滴的横截面小约30％。
[0361]
施加到双重乳液液滴的所述电场诱导内部水相(即水性核心)与外部水相(即水性载体流体)的聚结，由此产生水包油乳液液滴。
[0362]
所述电场可以从电场发生器、即能够产生电场的装置或系统产生。所述电场发生器可以产生ac场(即随着时间周期性例如正弦曲线、锯齿、正方形等变化的场)、dc场(即随着时间恒定的场)、脉冲场等。
[0363]
用于产生适合的电场(其可以是ac、dc等)的方法对于本领域普通技术人员来说是公知的。具体来说，电场可以通过跨过一对电极施加电压来产生，所述电极可以位于流体系统上或包埋在所述流体系统内(例如在限定所述通道的基质内或使用金或ito气相沉积在所述通道下)，和/或位于所述通道附近，使得至少一部分所述电场与所述双重乳液相互作用(例如，电极可以由所述流体通道旁边的微通道构成，并且所述微通道装填有被施加所述电场的焊料或盐溶液)。优选地，所述电场发生器施加正弦曲线或正方形电流。
[0364]
所述电场发生器可以以1khz至1ghz之间、优选地1khz至50 khz之间的频率，更优选地10khz至30khz之间的频率，甚至更优选地20khz至30khz之间的频率，以及100v至10 000v之间、优选地1 500v至3000v、更优选地2000v至3000v的幅度施加电压。
[0365]
在特定实施方式中，所述电场发生器施加频率为约10khz、幅度为约300v的正弦曲线电压。
[0366]
在优选实施方式中，所述电场发生器施加ac场，优选为正方形电流。优选地，所述频率为20khz至30khz，并且所述幅度为2,000v 至3,000v。
[0367]
在优选实施方式中，并且为了提供最佳液滴反转，w/o/w液滴以每秒10至1000个液滴的频率，优选地以每秒100至500个液滴的频率，更优选地以每秒250至350个液滴的频率通过所述电极。所述液滴的频率可以通过例如使用ψ型结构注射油隔离液、优选为无表面活性剂的油来调整。
[0368]
优选地，为了在该相反转模块上游避免不想要的聚结，通常使用一个或多个屏蔽
电极提供电屏蔽。这些屏蔽电极被接地，并因此为芯片的其余部分，特别是为上游模块例如重新注射或液滴产生模块和用于产生双重乳液的模块，或下游模块例如乳液收集模块强加了零电压边界条件。这些屏蔽电极被专业技术人员经常使用。
[0369]
优选地，所述亲水通道在所述用于产生双重乳液的模块例如喷嘴或t型汇流口与所述施加电场的相反转模块之间的区段超过4mm，优选地超过4.1、4.2、4.5或5mm，即双重乳液液滴因此在通过所述电场之前必须流动超过4mm。
[0370]
在第二个实施方式中，通过电穿孔使双重乳液液滴去稳定。在这个实施方式中，所述油包水乳液液滴的相反转方法包括：
[0371]
(i)从所述油包水乳液液滴形成双重乳液液滴；并且
[0372]
(ii)向所述双重乳液液滴施加足以破裂双重乳液液滴的油囊的电压，由此产生水包油乳液液滴。
[0373]
优选地，在这个实施方式中，所述双重乳液在微流体芯片中产生，然后被放置在电穿孔杯中，在所述电穿孔杯中使用电穿孔仪施加电压。
[0374]
所述施加的电压为20v至500v，持续时间10ms至1000ms。在优选实施方式中，所述施加的电压为约50v，持续时间为约100ms。
[0375]
在第三个实施方式中，使双重乳液液滴自发去稳定。在这个实施方式中，所述油包水乳液液滴的相反转方法包括：
[0376]
(i)从所述油包水乳液液滴形成双重乳液液滴；并且
[0377]
(ii)温育这些液滴直至油囊自发破裂。
[0378]
优选地，使用延迟线将双重乳液液滴在微流体芯片中温育。这些延迟线是公知的并被专业技术人员经常使用(参见例如欧洲专利申请 ep 2 340 435)。
[0379]
优选地，将双重乳液液滴温育至少2min，更优选地至少5min，甚至更优选地至少10min。
[0380]
任选地，在未经相反转的液滴的尺寸比相反转的液滴更大的基础上，可以进一步清除未经相反转的液滴。
[0381]
任选地，在相反转之后，可以通过向所述水性载体流体添加表面活性剂，使水包油乳液液滴稳定。表面活性剂可以通过所述相反转模块下游的入口提供。
[0382]
水包油乳液液滴可以被收集，特别是送往进一步分析。优选地，在收集之前，通过表面活性剂使o/w液滴稳定，以便防止在储存期间的任何聚结。
[0383]
在本发明中使用的、特别是用于相反转的微流体系统，可以将双重乳液(即w/o/w乳液)的生产及其反转合并。因此，所述系统可以包含：
[0384]
用于产生油包水乳液液滴的模块(即使用任何已知技术例如在同流液流中中断、在交叉流动的液流中例如在t型汇流口处中断、在细长或拉伸主导型液流中的中断，例如在流体力学流动聚焦中生产液滴的模块)，或用于重新注射油包水乳液的模块(例如包含ψ型结构的乳液重新注射模块)，
[0385]
与所述用于产生油包水乳液液滴或重新注射油包水乳液的模块流体连通并在其下游的用于产生双重乳液(例如使用流动聚焦汇合或t 型汇流口)的模块，和
[0386]
与所述用于产生双重乳液的模块流体连通并在其下游的相反转模块。
[0387]
这种系统的说明性实例呈现在图29中。
[0388]
可替选地，双重乳液的生产和所述相反转过程可以解偶联，并在不同的微流体芯片上进行。在这种情况下，所述双重乳液在第一微流体系统上产生，所述第一微流体系统包含：
[0389]-如上所定义的用于产生油包水乳液液滴或重新注射油包水乳液的模块，
[0390]-与所述用于产生油包水乳液液滴或重新注射油包水乳液的模块流体连通并在其下游的如上所定义的用于产生双重乳液的模块，以及
[0391]-与所述用于产生双重乳液的模块流体连通并在其下游的乳液收集模块(即收集双重乳液液滴的模块)。
[0392]
然后将所述双重乳液重新注射到第二微流体系统中，所述第二微流体系统包含：
[0393]-用于重新注射双重乳液的模块(例如包含ψ型结构的乳液重新注射模块)，以及
[0394]-与所述用于重新注射双重乳液的模块流体连通并在其下游的相反转模块。
[0395]
优选地，所述相反转模块包含一个或多个电极，其产生导向亲水通道的电场。正如上文详细说明的，所述电极可以放置在所述流体系统上或包埋在其中，或放置在所述通道附近，使得至少一部分所述电场与所述双重乳液相互作用。
[0396]
当在本文中使用时，术语“上游”是指在微流体系统中从给定参照点起在与流体流动相反的方向上的组件或模块。
[0397]
当在本文中使用时，术语“下游”是指在微流体系统中从给定参照点起在流体流动的方向上的组件或模块。
[0398]
在其中双重乳液在用于相反转的微流体系统上生产的实施方式中，所述系统的通道是部分亲水和部分疏水的。在所述用于产生或重新注射油包水乳液液滴的模块下游和在所述用于产生双重乳液液滴的模块上游的区域是疏水的。相反，在所述用于产生双重乳液液滴的模块下游的区域是亲水的。
[0399]
可以通过本领域技术人员已知并领会的各种不同方法，在疏水微流体通道中产生局部亲水区域，所述方法包括但不限于施用各种不同处理例如氧等离子体，施加亲水涂层例如聚乙二醇或活化的氟代硅烷，将小分子或聚合物化学接枝在介电层上以提高所述表面的亲水性，和/ 或使用具有可以用紫外(uv)光引发的表面化学的材料来构建所述微流体通道，使得向局部区域照射uv光将诱导所述表面化学，导致所述区域的材料表面性质从相对疏水改变到相对亲水。所有这些控制微流体装置的润湿性质的技术都被专业技术人员公知，并描述在例如专利申请wo 2011/028764和wo 2009/120254中。
[0400]
相反，可以通过各种不同的公知方法使通道的局部区域更加疏水，所述方法包括但不限于施加涂层材料例如多晶硅和/或疏水涂层材料例如聚二甲基硅氧烷组合物或聚四氟乙烯组合物(例如teflon-af)。
[0401]
在其中双重乳液在与用于相反转的微流体系统不同的系统上生产的实施方式中，所述第一系统(即生产所述双重乳液)的通道是疏水的，并且所述第二系统(即相反转系统)的通道是亲水的。
[0402]
在一些实施方式中，所述相反转模块是所述微流体系统的其中将电场施加在双重乳液液滴上以便获得水包油乳液的区域。这个模块与所述用于产生双重乳液的模块流体连通并在其下游，并包含亲水通道和一个或多个电极，所述电极产生导向双重乳液液滴在其中流动的所述亲水通道的电场。
[0403]
通常，所述电场通过跨过一对电极施加电压来产生。这些电极可以被放置在所述流体系统上或包埋在其中(例如在界定所述通道的基底内)，和/或放置在所述通道附近(例如约50μm处)，使得至少一部分所述电场与所述双重乳液相互作用。所述电极可以从本领域普通技术人员已知的任一种或多种适合的电极材料打造，所述材料包括但不限于银、金、铜、碳、铂、铜、钨、锡、镉、镍、铟锡氧化物等，以及它们的组合。所述电极可以由同一材料或不同材料形成。所述电极也可以是由盐溶液(例如nacl)制成的液体电极，其被模制在液滴在其中流动的亲水通道周围。
[0404]
所述电场发生器可以与含有所述亲水通道的流体系统整合或分开。当在本文中使用时，“整合”意味着彼此整合的部分组件被联合，使得在不切割或断裂至少一个所述组件的情况下所述组件不能被手动地彼此分开。
[0405]
优选地，提供一个或多个屏蔽电极，以防止所述电场四处蔓延。这些电极是接地的，因此为上游和/或下游区域，特别是为所述重新注射或液滴产生模块和所述用于产生双重乳液的模块强加零电压边界条件。
[0406]
优选地，即使提供屏蔽电极，所述相反转模块与所述用于产生双重乳液的模块之间的距离也大于4mm，优选地大于4.1、4.2、4.5或5 mm。
[0407]
所述微流体系统还可以包含与所述用于产生或重新注射油包水乳液液滴的模块流体连通并在其下游的间隔模块，其目的是为了在产生双重乳液之前改变液滴之间的间隔。该间隔模块包含一个或多个入口通道，以注射或移除流体系统中液滴之间的流体，优选为油相。
[0408]
所述微流体系统还可以包含与所述用于产生双重乳液液滴的模块流体连通并在其下游的间隔模块，其目的是为了在所述相反转模块之前改变液滴之间的间隔。该间隔模块包含一个或多个入口通道，以注射或移除流体系统中液滴之间的流体，优选为水相。
[0409]
所述微流体系统还可以包含检测模块(例如检测信号例如荧光信号的模块)、稳定化模块(例如其中向所述水性载体相添加表面活性剂以便使所述反转的乳液稳定的模块)、液滴分拣模块(例如在任何可检测信号例如荧光信号的基础上分拣液滴的模块)和/或液滴收集模块(收集液滴以例如进行进一步的芯片外分析的模块)。
[0410]
被捕获的分子靶标的检测、回收和/或定量
[0411]
由于i)所述分子靶标与所述化学探针之间，以及ii)所述化学探针与所述功能化的表面活性剂之间(任选地通过与结合中间体相互作用)的相互作用，从而将所述分子靶标捕获在所述液滴的内界面处之后，所述被捕获的分子靶标可以被检测、回收和/或定量。
[0412]
因此，本发明的方法还包括检测、回收和/或定量所述被捕获的分子靶标的步骤。
[0413]
该步骤可以在所述w/o液滴中直接进行，或者在如上所述将液滴相反转以产生水包油乳液液滴并将捕获的靶暴露在液滴的外表面处之后进行。
[0414]
用于检测、回收或定量所述分子靶标的方法的选择依赖于多种参数，例如所述功能化的表面活性剂、化学探针或分子靶标的性质，以及将所述乳液相反转的步骤的存在或不存在。
[0415]
在一个实施方式中，在相反转之后检测、回收和/或定量被捕获的分子靶标。任选地，所述方法还可以在检测、回收或定量之前包括清洗o/w液滴以便清除未被捕获的分子。
[0416]
在这个实施方式中，被捕获的分子靶标可以通过专业技术人员已知的任何方法从
所述液滴的界面回收，例如通过破坏所述化学探针与所述分子靶标之间的相互作用或通过破坏所述化学探针与所述功能化的表面活性剂和/或所述结合中间体之间的相互作用。
[0417]
或者，在其中所述功能化的表面活性剂、化学探针和/或结合中间体包含可切断的连接物的实施方式中，可以将该连接物切开以允许所述被捕获的分子靶标的释放和回收。
[0418]
在相反转后，被捕获的分子靶标暴露在液滴的外表面处，并且因此可以使用专业技术人员已知的任何方法容易地检测，例如使用特异性针对所述分子靶标并且包含用于检测的手段的抗体或另一种配体。
[0419]
当在本文中使用时，“检测手段”是指从检测或校准的角度来说可用于检测目的的任何实体。例如，所述检测手段可以是ms标签或荧光团。
[0420]
在特定实施方式中，被捕获的分子靶标使用针对所述靶标并包含 ms标签的一种或多种抗体来检测/定量。不同的ms标签可用于同时检测/定量不同的靶。优选地，在这种情况下，所述w/o乳液包括含有连接到ms标签的亲水头部的表面活性剂。靶的检测或定量可以在切开 ms标签后通过质谱分析来进行。所述表面活性剂的标签可作为校准物用于质谱分析。
[0421]
在另一个实施方式中，直接在所述w/o液滴中检测、回收和/或定量被捕获的分子靶标。
[0422]
为了回收捕获在所述液滴的内表面处的分子靶标，可以通过专业技术人员已知的任何方法将所述乳液打破，例如在mazutis等，nat. protoc.,2013,8,870或chokkalingam等，lab chip,2014,14,2398中描述的方法。
[0423]
在乳液打破后，所述被捕获的分子靶标可以通过专业技术人员已知的任何方法来回收，例如通过破坏所述化学探针与所述分子靶标之间的相互作用或通过破坏所述化学探针与所述功能化的表面活性剂和/ 或所述结合中间体之间的相互作用。当所述功能化的表面活性剂、化学探针和/或结合中间体包含可切断的连接物时，可以将该连接物切开，以允许所述被捕获的分子靶标的释放和回收。
[0424]
被捕获的分子靶标的检测和定量，可以使用特异性针对所述分子靶标并包含检测手段的抗体或另一种配体，直接在所述w/o液滴中进行。
[0425]
在特定实施方式中，受益于特异性针对所述分子靶标并且可以通过激光/pmt检测的配体例如偶联到荧光团的抗体，被捕获的分子靶标的检测和定量使用微流体激光/pmt检测，直接在所述w/o液滴中进行。
[0426]
在另一个特定实施方式中，被捕获的分子靶标的检测和定量使用邻位连接测定法(pla，gullberg等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2004； soderberg等，nature methods,2006)，直接在所述w/o液滴中进行。通过将特定蛋白的检测转变成dna序列的检测，这种技术能够进行高度灵敏的蛋白质分析。简单来说，这种方法需要针对所述分子靶标的抗体和针对所述化学探针的抗体，每种抗体含有寡核苷酸延伸作为探针。当所述分子靶标被所述化学探针捕获时，这些带有寡核苷酸序列的探针的邻近引起连接反应，导致形成可扩增的靶。扩增可以通过专业技术人员已知的任何方法例如滚环扩增，使用可检测的探针例如荧光探针来进行。使用校准曲线，在所述液滴的内界面处的信号强度允许所述分子靶标的检测和定量。对于多个靶来说，pla分析可以在同一液滴中使用不同的可检测探针同时进行。
[0427]
在另一个特定实施方式中，所述被捕获的分子靶标是核酸，并且所述靶标的检测
或定量使用体外转录和/或翻译系统和/或核酸扩增系统，直接在所述w/o液滴中进行。然后通过检测或定量所述转录和/或翻译系统或所述核酸扩增系统的产物来进行检测和/或定量。在液滴中进行体外转录和/或翻译或核酸扩增的方法，为专业技术人员所公知。
[0428]
本发明的方法还可以包括分拣包含所需的被捕获的分子靶标的 w/o液滴。专业技术人员可以使用本领域中已知的任何方法，例如在wyatt shields等人的文章(lab chip.2015feb 16；15(5):1230
–
1249) 中综述的方法。
[0429]
本发明的方法的用途
[0430]
由于可以通过结合到所述功能化的表面活性剂而被捕获在所述液滴的界面处的分子靶标的繁多种类，本发明的方法可用于各种不同应用。例如，所述方法可用于基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、脂质组学、相互作用物组学、分泌组学方法中，特别是在单细胞“组学”中，以理解细胞多样性和非均质性。应用尤其是可以确定正常的细胞间差异，将所述差异与生物功能和疾病过程相关联，并最终鉴定个性化疗法。
[0431]
本发明的方法也可用于检测、回收和/或定量一种或多种目标分子靶标，特别是在诊断/预后/诊疗上重要的分子靶标。
[0432]
本发明的方法还可以包括提供来自于对象的样品，所述样品包含将要按照本发明的方法被捕获在液滴界面处的目标分子靶标。
[0433]
当在本文中使用时，术语“样品”意味着源自于对象的含有细胞的任何样品，优选为含有核酸的样品。这些样品的实例包括流体例如血液、血浆、唾液、尿液、脑脊液和羊水样品，以及组织活检、器官、组织或细胞样品。它可以是新鲜、冷冻或固定的(例如甲醛或石蜡固定的)样品。在一些特定实施方式中，所述样品可以是疾病样品，优选为癌症样品，即含有源自于患者的肿瘤细胞的样品。
[0434]
当在本文中使用时，术语“对象”或“患者”是指动物，优选为哺乳动物，甚至更优选为人类，包括成人、儿童和在产前期的人。
[0435]
在用于本发明的方法之前，所述样品可以被处理，以例如提取核酸、蛋白质、脂类等，清洗细胞，从组织或器官分离细胞等。
[0436]
在优选实施方式中，在本发明的方法中使用的每个w/o液滴包含从患者样品获得的单个细胞，并且可以使用本发明的方法捕获/检测和/ 或定量一种或多种在诊断/预后/诊疗上重要的分子靶标。
[0437]
试剂盒及其用途
[0438]
另一方面，本发明还涉及一种用于捕获分子靶标的试剂盒，其包含：
[0439]-功能化的表面活性剂，其包含连接到功能化的亲水头部的至少一个亲脂尾部；和
[0440]-化学探针，其包含至少(i)一个能够特异性结合到分子靶标的捕获组成部分，和至少(ii)一个能够直接或间接结合到所述功能化的表面活性剂的结合结构域。
[0441]
具体来说，所述试剂盒可以包含：
[0442]-如上所定义的任一功能化的表面活性剂，特别是在式(ia)、(ib)、 (ic)、(ii)和(iiia)任一者中所描绘的或包含如上所描述的h1或 h2组成部分的功能化的表面活性剂；
[0443]-如上所定义的化学探针，即包含下述两者的化学探针：(i)能够特异性结合到所述分子靶标的捕获组成部分，和(ii)能够直接或间接结合到所述功能化的表面活性剂、即结合到所述表面活性剂的 funct基团的结合结构域；
[0444]-任选地，如上所定义的结合中间体，即能够结合所述化学探针和功能化的表面活性剂两者，由此充当所述两个实体之间的桥的结合中间体。
[0445]
上文为本发明的方法所描述的所有实施方式，也被涵盖在这一方面中。
[0446]
在一个实施方式中，所述功能化的表面活性剂和所述化学探针的结合结构域包含功能性组成部分，其具有适合于通过点击化学产生共价键的化学反应性基团。优选地，所述适合于通过点击化学产生共价键的化学反应性基团选自叠氮基和炔基例如具有环张力的环炔基。
[0447]
在特定实施方式中，所述表面活性剂的功能性组成部分是叠氮基，并且所述化学探针的结合结构域是具有环张力的环炔基，或者反之亦然。
[0448]
在另一个实施方式中，所述试剂盒包括具有包含蛋白质标签、优选为生物素的功能性组成部分的功能化的表面活性剂，以及具有结合结构域的化学探针，所述结合结构域包含可以与所述表面活性剂的蛋白质标签特异性相互作用的基团，优选为链亲合素或亲和素，或者反之亦然。
[0449]
在特定实施方式中，所述试剂盒包含：
[0450]-功能化的表面活性剂，其具有包含生物素的功能性组成部分；
[0451]-化学探针，其具有包含生物素的结合结构域，和
[0452]-结合中间体，其是链亲合素。
[0453]
优选地，所述化学探针是特异性针对所述分子靶标的生物素化的适体或生物素化的抗体。
[0454]
任选地，所述试剂盒还可以包含：
[0455]-非功能化的表面活性剂；
[0456]-水相和/或油相；
[0457]-如上所述的微流体芯片，特别是包含相反转模块的微流体芯片；和/或
[0458]-为使用这种试剂盒提供指导的小册子。
[0459]
本发明还涉及本发明的试剂盒的用途，其用于按照本发明的方法捕获分子靶标。
[0460]
当在本文中使用时，动词“包含”以其非限制性意义使用，意味着包括在该词后的项目，但不排除没有具体提及的项目。
[0461]
此外，通过不定冠词对要素的指称不排除存在超过一个所述要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅仅一个所述要素。因此，不定冠词通常意味着“至少一个”。
[0462]
当在本文中使用时，术语“约”是指
±
所述指定值的10％的值范围。例如，“约20”包括
±
20的10％，或从18至22。优选地，术语“约”是指
±
所述指定值的5％的值范围。
[0463]
在本说明书中引用的所有专利和参考文献通过引用以整体并入本文。
实施例
[0464][0465][0466]
1.材料和方法
[0467]
实验程序
[0468]
除非另有指明，否则反应在氩气气氛下，在火焰干燥的玻璃器皿中，使用磁力搅拌来进行。空气和/或湿气敏感的液体通过注射器转移。在需要时，通过经针头进行氩气鼓泡
将溶液脱气。有机溶液在25-80℃和15-30torr下通过旋转蒸发来浓缩。分析薄层谱(tlc)使用从铝片(alugram xtra sil g/uv
254
，来自于macherey-nagel)切下的板来进行。可视化在254或365nm uv光下和通过浸泡在适合的显溶液中来实现。
[0469]
材料
[0470]
所有试剂从商业化来源获得并且不需任何进一步纯化直接使用。在实验中使用的无水溶剂从sigma-aldrich或alfa aesar获得。含氟溶剂(novec 7100、novec 7500和fc 3283)购自3m。在所述实验中使用的所有试剂购自aldrich、alfa aesar、acros或tci，并且不需任何进一步纯化直接使用。krytox157fs(h)购自dupond。用于柱谱的硅胶购自merck(si 60，40-63μm)。快速柱谱使用来自于macherey-nagel的硅胶g-25(40-63μm)进行。
[0471]
仪器
[0472]
nmr波谱术，1h和
13
c nmr波谱在bruker 400波谱仪上，在23 ℃下记录。记录到的位移以百万分数(δ)为单位报告，并使用残留的非氘化溶剂校准。数据表示如下：化学位移，多重性(s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，m＝多重峰，br＝宽峰)，耦合常数(j,hz)和积分。
[0473]
高分辨率质谱(hrms)使用agilent q-tof(飞行时间)6520获得，并且低分辨率质谱使用带有agilent hplc1200 sl的agilent msd 1200sl(esi/apci)获得。
[0474]
低分辨率质谱使用带有agilent hplc1200 sl的agilent msd 1200sl(esi/apci)和带有waters alliance 2695hplc的watersacquity qda(esi)获得。
[0475]
制备hplc程序在半制备型hplc shimadzu自动进样器sil-10a (泵：shimadzu lc-8a，uv-vis检测器：shimadzu spd-10a，收集器： shimadzu级分收集器frc-10a)上，使用sunfire c18(150mm
×
19mmi.d.，5μm，waters)以17ml/min的流速进行。每个样品进样1ml，并使用水/含有0.05％ tfa的acn作为洗脱系统。施加的梯度是在40 分钟内5％至95％ acn和10分钟的重新平衡。对于tamra衍生物来说检测在550nm处进行。
[0476]
2.功能化的二嵌段表面活性剂的合成
[0477]
合成了4种功能化的二嵌段表面活性剂，以通过两种不同策略进行在微液滴内表面处的捕获。合成了炔烃二嵌段表面活性剂 (krytox-peg
10-炔烃，6)和叠氮化物二嵌段表面活性剂(krytox-peg
12
‑ꢀ
叠氮化物，14)以开发通过点击化学的捕获，并制备了两种生物素化的二嵌段表面活性剂(krytox-peg
10-生物素10和krytox-peg
12-生物素18)以通过免疫夹心进行捕获。二嵌段表面活性剂通过带有游离胺的基于peg的亲水链与活化为其酰氯形式的全氟聚醚酸性链 (krytox157-cocl，5)之间的假肽偶联反应获得。所述亲水链通过将两个被方便地功能化的寡聚乙二醇衍生物偶联来获得(图1)。
[0478]
首先，通过事先分别从六乙二醇和四乙二醇获得的结构块1和2之间的假肽偶联反应，合成带有n-boc保护的氨基和炔烃的peg
10
衍生物3。这种中间体在n-boc裂解并与krytox-cocl 5偶联之后，导致合成炔烃二嵌段表面活性剂6。从中间体3开始，在与生物素-n
3 7的点击反应、n-boc去保护和与krytox-cocl 5偶联之后，获得生物素化的二嵌段表面活性剂10。
[0479]
其次，通过均从六乙二醇获得的寡聚乙二醇衍生物1和12的偶联，制备含有叠氮化物和n-boc氨基组成部分的peg
12
衍生物(图2)。在 n-boc去保护并与所述氟化链偶联之后，
获得叠氮化物二嵌段表面活性剂14。在与生物素-炔烃15的点击反应、n-boc裂解和与krytox-cocl 5偶联之后，也合成了第二种生物素化的表面活性剂18。
[0480]
n-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯1 (walton,j.g.a.；patterson,s.；liu,g.；haraldsen,j.d.；hollick,j.j.； slawin,a.m.z.；ward,g.e.；westwood,n.j.org.biomol.chem.,2009,7, 3049-3060)、4,7,10,13,16-五氧杂十九-18-炔酸2(kumar,a.；erasquin, u.j.；qin,g.；li,k.；cai,c.chemmun.,2010,46,5746-5748)、 (3as,4s,6ar)-4-(7-(2-叠氮基乙氧基)-5-氧庚基)四氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-2(3h)-酮(生物素-n3)7(azagarsamy,m.a.；yesilyurt,v.； thayumanavan,s.j.am.chem.soc.,2010,132,4550-4551)、n-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-基)氨基甲酸酯11a(tamura,s.；inomata, s.；ebine,m.；genji,t.；iwakura,i.；mukai,m.；shoji,m.；sugai,t.； ueda,m.bioorg.med.chem.lett.,2013,23,188-193)和5-((3as,4s,6ar)-2-氧六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-n-(丙-2-炔-1-基) 戊酰胺(生物素-炔烃)15(decuypere,e.；specklin,s.；gabillet,s.； audisio,d.；liu,h.；plougastel,l.；kolodych,s.；taran,f.org.lett., 2015,17,362-365)，按照文献中描述的程序来合成。
[0481]
bocnh-peg
10-炔烃，3
[0482]
(n-[17-(4,7,10,13,16-五氧杂十九-18-炔酰胺基)-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯)
[0483][0484]c31h58
n2o
13
mw＝666.80g/mol
[0485]
在氩气下向4,7,10,13,16-五氧杂十九-18-炔酸2(1.2eq.，0.77g， 2.54mmol)在dcm(7ml)中的溶液添加1-(3-二甲基氨基丙基)-3
‑ꢀ
乙基碳二亚胺盐酸盐(1.5eq.，0.61g，3.17mmol)和hobt(1.5eq.， 0.43g，3.17mmol)。将得到的混合物在室温搅拌20分钟。添加n-(17
‑ꢀ
氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯1(1eq.，0.81g， 2.12mmol)和diea(2.5eq.，0.87ml，5.29mmol)在dcm(7ml) 中的溶液，并将反应在室温搅拌12小时。将得到的溶液用水(50ml) 稀释并用dcm(2x 50ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并在减压下浓缩。将所述粗品材料通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从dcm到dcm/meoh 9/1)，得到作为黄油状物的bocnh-peg
10
‑ꢀ
炔烃3(0.905g，1.36mmol，64％)。
[0486]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ6.69(brs,1h),5.07(brs,1h),4.01 (d,j＝2.0hz,2h),3.57
–
3.34(m,38h),3.27
–
3.22(m,2h),3.14
ꢀ–
3.08(m,2h),2.34(t,j＝2.4hz,1h),2.28(t,j＝6.2hz,2h),1.25 (s,9h)。
[0487]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ171.8,156.4,79.9,75.0,70.6
–
69.6, 69.1,67.5,66.4,58.3,53.1,40.2,39.0,36.1,28.7(3c)。
[0488]
ms(esi)m/z：667.5[m+h]
+
。
[0489]
nh
2-peg
10-炔烃(盐酸盐)，4
[0490]
(19-氧-3,6,9,12,15,22,25,28,31,34-十氧杂-18-氮杂三十七-36-炔-1-氯化铵)
[0491]
[0492]c26h51
cln2o
11
mw＝603.14g/mol
[0493]
向bocnh-peg
10-炔烃3(0.37g，0.55mmol)在dcm(6ml)中的溶液添加二噁烷中的4m hcl溶液(6eq.，0.83ml，3.33mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌12小时。在减压下蒸发溶剂，得到作为黄油状物的nh
2-peg
10-炔烃4(0.31g，0.55mmol，定量)。
[0494]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ7.92(brs,3h),4.16(d,j＝2.4hz, 2h),3.86
–
3.92(m,2h),3.77
–
3.57(m,36h),3.46
–
3.40(m,2h), 3.14
–
3.05(m,2h),2.65(t,j＝5.6hz,2h),2.41(t,j＝2.2hz,1h)。
[0495]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ172.0,79.7,74.8,70.5
–
70.0,69.8, 69.6,69.1,67.4,66.9,58.4,53.6,40.3,39.0,36.7。
[0496]
hrms(esi)m/z：为c
26h52
n2o
11
计算的[m+h]
+
567.3487，实测值为567.3493。
[0497]
krytox-cocl，5
[0498][0499]
向krytox-157fsh-co2h(5g)在novec 7100(40ml)中的溶液添加草酰氯(3.4ml)，并将所述反应混合物在65℃搅拌24小时。在冷却至室温后，将所述溶液在减压下浓缩以除去溶剂和过量的草酰氯。得到的粗品krytox酰氯5不需任何进一步的纯化步骤直接使用。
[0500]
krytox-peg
10-炔烃，6
[0501][0502]
向krytox-cocl 5(1.23g)在novec 7100(25ml)中的溶液添加nh
2-peg
10-炔烃4(0.15g)和tea(92μl)在thf(15ml)中的溶液。将得到的混合物在室温下剧烈搅拌24小时。将在蒸发掉溶剂后获得的粗产物溶解在fc 3283(80ml)中。将得到的溶液转移到分液漏斗中，并添加dcm(60ml)形成乳液。在分离所述层后，所需化合物被萃取在fc 3283层中。将后者在减压下浓缩，得到作为粘性白油状物的krytox-peg
10-炔烃6。
[0503]
bocnh-peg
10-生物素，8
[0504]
((17-氧-1-(1-(2-(2-(5-((3as,4s,6ar)-2-氧六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4
‑ꢀ
基)戊酰胺基)乙氧基)乙基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)-2,5,8,11,14,21,24,27,30,
[0505]
33-十氧杂-18-氮杂三十五-35-基)氨基甲酸叔丁酯)
[0506][0507]c45h82
n8o
16
s mw＝1023.24g/mol
[0508]
向bocnh-peg
10-炔烃3(300mg,0.45mmol)在thf/h2o(10ml， 1:1)中的溶液相继添
加(d)-生物素-n
3 7(1.5eq.，240mg，0.67mmol)、抗坏血酸钠(0.8eq.，71mg，0.36mmol)和硫酸铜(ii)(0.3eq.，21mg， 0.13mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌48小时。将得到的溶液用水(50ml)稀释，用dcm(4
×
50ml)萃取，用mgso4干燥并在减压下浓缩。将所述粗品材料通过硅胶快速谱进行纯化(在30min内从dcm到dcm/meoh 90/10)，得到作为无油状物的bocnh-peg
10
‑ꢀ
生物素8(327mg，0.32mmol，71％得率)。
[0509]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ7.71(s,1h),6.89(brs,1h),6.64 (brs,1h),6.18(brs,1h),5.45(brs,1h),5.15(brs,1h),4.64(s, 2h),4.49(t,j＝5.0hz,2h),4.45(dd,j＝4.8和7.6hz,1h),4.26 (dd,j＝4.4和7.6hz,1h),3.81(t,j＝5.2hz,2h),3.70
–
3.55(m, 34h),3.51
–
3.46(m,6h),3.41
–
3.31(m,4h),3.28
–
3.23(m,2h), 3.12
–
3.06(m,1h),2.85(dd,j＝4.8和12.8hz,1h),2.68(d,j＝12.8 hz,1h),2.42(t,j＝6.0hz,2h),2.16(t,j＝7.2hz,2h),1.74
–
1.54 (m,4h),1.43
–
1.34(m,2h),1.39(s,9h)。
[0510]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ173.8,171.6,163.9,156.2,145.0, 124.2,70.7
–
70.0,69.0,67.5,64.7,62.1,60.4,55.8,50.4,40.7,40.6,39.4, 39.2,37.0,35.7,28.6,28.2(3c),28.2,25.7。
[0511]
ms(esi)m/z：1023.4[m+h]
+
,1045.3[m+na]
+
。
[0512]
nh
2-peg
10-生物素(盐酸盐)，9
[0513]
(17-氧-1-(1-(2-(2-(5-((3as,4s,6ar)-2-氧六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4
‑ꢀ
基)戊酰胺基)乙氧基)乙基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)-2,5,8,11,14,21,24,27,30, 33-十氧杂-18-氮杂三十五-35-氯化铵)
[0514][0515]c40h75
cln5o
14
s mw＝959.59g/mol
[0516]
向bocnh-peg
10-生物素8(0.23g，0.22mmol)在dcm(6ml) 中的溶液添加二噁烷中的4m hcl溶液(15eq.，0.84ml，3.37mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌5小时。在减压下蒸发溶剂，得到作为无油状物的nh
2-peg
10-生物素9(0.21g，0.22mmol，定量得率)。
[0517]1h nmr(cd3od,400mhz)δ8.72(s,1h),4.91
–
4.85(m,4h), 4.76(dd,j＝4.8和8.0hz,1h),4.57(dd,j＝4.4和8.0hz,1h),3.99 (t,j＝4.8hz,2h),3.80
–
3.58(m,40h),3.46
–
3.41(m,4h),3.32
ꢀ–
3.38(m,1h),3.13
–
3.18(m,2h),3.04(dd,j＝4.8和13.2hz,1h), 2.85(d,j＝13.2hz,1h),2.59(t,j＝6.0hz,2h),2.39(t,j＝7.2hz, 2h),1.85
–
1.44(m,6h)。nh2和nh信号丢失。
[0518]
13
c nmr(cd3od,100mhz)δ176.3,174.3,164.1,145.3,126.6, 71.8
–
70.7),70.0,68.4,68.1,64.6,63.7,62.0,57.1,52.2,41.13,40.8, 40.5,40.3,37.7,36.8,29.9,29.6,27.0。
[0519]
hrms(esi)m/z：为c
40h76
n8o
14
s计算的[m+2h]
2+
462.2595，实测值为462.2597。
[0520]
krytox-peg
10-生物素，10
[0521][0522]
向krytox-cocl 5(1.00g)在novec 7100(25ml)中的溶液添加nh
2-peg
10-生物素9(0.20g)和tea(75μl)在thf(15ml)中的溶液。将得到的混合物在室温下剧烈搅拌48h。将在蒸发掉溶剂后获得的粗产物溶解在fc 3283(80ml)中。将所述得到的溶液转移到分液漏斗中并添加dcm(60ml)形成乳液。在分离所述层后，所需化合物被萃取在fc 3283层中。将后者在减压下浓缩，得到作为粘性白油状物的krytox-peg
10-生物素10。
[0523]
bocnh-peg
12-叠氮化物，12
[0524]
((39-叠氮基-19-氧-3,6,9,12,15,22,25,28,31,34,37-十一氧杂-18-氮杂三十九基)氨基甲酸叔丁酯)
[0525][0526]c32h63
n5o
14
mw＝741.87g/mol
[0527]
向1-叠氮基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸11a(1eq.，1.00 g，2.64mmol)在chcl3(15ml)中的溶液添加1-(3-二甲基氨基丙基)-3
‑ꢀ
乙基碳二亚胺盐酸盐(1.5eq.，0.76g，3.95mmol)和hobt(1.5eq.， 0.53g，3.95mmol)。将得到的混合物在室温搅拌20分钟。添加n-(17
‑ꢀ
氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯1(1.2eq.，1.20g， 3.16mmol)和diea(2.5eq.，1.09ml，6.59mmol)在chcl3(10ml) 中的溶液，并将所述反应在室温搅拌14小时。将得到的溶液用水(50 ml)稀释并用dcm(3
×
50ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并在减压下浓缩。通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从dcm 到dcm/meoh 95/5)，得到作为黄油状物的bocnh-peg
12-叠氮化物12(1.62g，2.19mmol，83％)。
[0528]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.62(brs,1h),5.05(brs,1h),3.74 (t,j＝6.0hz,2h),3.70
–
3.58(m,38h),3.54(q,j＝5.4hz,4h),3.44 (dd,j＝5.4和10.8hz,2h),3.39(d,j＝5.0hz,2h),3.31(dd,j＝5.0 和10.0hz,2h),2.47(t,j＝6.0hz,2h),1.44(s,9h)。
[0529]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ171.2,155.8,78.7,70.5
–
69.7,67.1, 50.5,40.2,39.0,36.8,28.3(3c)。
[0530]
ms(esi)m/z：764.2[m+na]
+
。
[0531]
nh
2-peg
12-叠氮化物，13
[0532]
(n-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)-1-叠氮基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酰胺)
[0533][0534]c27h55
n5o
12
mw＝641.75g/mol
[0535]
向bocnh-peg
12-叠氮化物12(1eq.，0.40g，0.54mmol)在dcm (15ml)中的溶液添加二噁烷中的4m hcl溶液(15eq.，2.02ml， 8.09mmol)，并将所述反应混合物在室温搅拌4小时。在蒸发后，将所述粗产物通过硅胶快速谱进行纯化(从dcm到 dcm/meoh/nh4oh 9/1.8/0.2)，得到作为黄油状物的nh
2-peg
12-叠氮化物13(0.34g，0.53mmol，98％)。
[0536]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.55(brs,1h),3.82
–
3.56(m,46h), 3.44(dd,j＝5.3和10.5hz,2h),3.38(t,j＝5.0hz,2h),3.01(t,j＝ 5.0hz,2h),2.55(t,j＝6.2hz,2h)。
[0537]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ171.4,70.4
–
70.0,69.7,69.6,69.5, 69.0,67.1,50.4,40.4,38.8,36.5。
[0538]
ms(esi)m/z：664.3[m+na]
+
。
[0539]
krytox-peg
12-叠氮化物，14
[0540][0541]
向krytox157fsh-cocl 5(2.30g)在novec 7100(45ml)中的溶液逐滴添加nh
2-peg
12-叠氮化物(0.25g)和tea(148μl)在dcm (25ml)中的溶液。将得到的混合物在室温下剧烈搅拌36小时。将在蒸发掉溶剂后获得的粗品材料溶解在fc 3283(150ml)中。将得到的溶液转移到分液漏斗中并添加dcm(100ml)，形成乳液。在分离所述层后，所需化合物被萃取在fc 3283层中。将后者在减压下浓缩，得到作为粘性黄油状物的krytox-peg
12-叠氮化物14。
[0542]
bocnh-peg
12-生物素，16
[0543]
((19-氧-39-(4-((5-((3as,4s,6ar)-2-氧六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基) 戊酰胺基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,22,25,28,31,34,37-十一氧杂-18-氮杂三十九基)氨基甲酸叔丁酯)
[0544][0545]c45h82
n8o
16
s mw＝1023.24g/mol
[0546]
在圆底烧瓶中添加bocnh-peg
12-叠氮化物12(1eq.，350mg，0.47 mmol)、5-((3as,4s,6ar)-2-氧六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-n-(丙-2
‑ꢀ
炔-1-基)戊酰胺15(1.3eq.，172mg，0.61mmol)、thf(6ml)和水 (6ml)。将所述烧瓶排气并用氩气回充。将排气和充气的过程重复三次。向所述混合物添加cuso4.5h2o(0.3eq.，35mg，0.14mmol) 和抗坏血酸钠(0.8eq.，75mg，0.38mmol)，并将烧瓶抽气并用氩气回充。将得到的混合物在室温搅拌4小时。将得到的溶液用水(50ml) 稀释，用dcm(4
×
50ml)萃取，用mgso4干燥并在减压下浓缩。通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从dcm到dcm/meoh 8/2)，得到作为微黄油状物的bocnh-peg
12-生物素16(405mg，0.40mmol， 84％)。
[0547]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.74(s,1h),7.40(brs,1h),6.76 (brs,1h),6.49(brs,1h),5.87(brs,1h),5.08(brs,1h),4.62
–
4.47 (m,4h),4.41(dd,j＝5.5和15.0hz,1h),
生物素17(0.285g)和tea(107μl)在dcm(20 ml)中的溶液。将在蒸发掉溶剂后获得的粗产物溶解在fc 3283(100 ml)中。将得到的溶液转移到分液漏斗中并添加dcm(100ml)，形成乳液。在分离所述两层后，所需化合物被萃取在fc 3283层中。将后者在减压下浓缩，得到作为粘性白油状物的krytox-peg
12-生物素18。
[0561]
3.功能化的三嵌段表面活性剂的合成
[0562]
带有叠氮化物和生物素组成部分的功能化的三嵌段表面活性剂按照图3中报道的合成策略来合成。这一合成的关键步骤在于通过还原性叠氮化物二聚化制备三功能的peg衍生物(lange,m.,pettersen,a.l., undheim,k.tetrahedron,1998,54,5745-5752；an,i.-h.,seong,h.-r., ahn,k.h.bull.korean chem.soc.,2003,25,420-422)。该反应的底物 (19a和19b)首先通过将酸性寡聚乙二醇叠氮化物衍生物与n-boc乙二胺偶联来获得。将这些得到的化合物送去在加氢条件下进行还原性叠氮化物二聚化，以获得三功能的peg连接物20a和20b。从这些三功能连接物开始，将第三个酸性peg叠氮化物链偶联到中央仲胺，得到带有叠氮化物组成部分的三peg衍生物21a和21b。这些中间体在n-boc 裂解并随后与krytox-cocl 5进行假肽偶联反应之后，导致叠氮化物三嵌段表面活性剂23a和23b的合成。生物素化的三嵌段表面活性剂也从三peg6叠氮化物中间体21a开始，在与生物素-炔烃15的点击反应、 n-boc组成部分去保护和与krytox-cocl 5偶联之后获得。
[0563][0564]
19a，(1-叠氮基-21-氧-3,6,9,12,15,18-六氧杂-22-氮杂二十四烷-24-基)氨基甲酸叔丁酯，c
22h43
n5o9，mw＝521,6g/mol。
[0565]
19b，(1-叠氮基-15-氧-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷-18-基)氨基甲酸叔丁酯，c
18h35
n5o7，mw＝433.5g/mol。
[0566]
通用程序：向酸性寡聚乙二醇衍生物(11a或11b)在dcm中的溶液(0.5mmol/ml)添加hobt(1.3eq.)和edc(1.3eq.)。将所述溶液在室温下搅拌15分钟。添加n-boc乙二胺(1.1eq.)和tea(3eq.) 在dcm中的溶液(0.5mmol/ml的n-boc乙二胺)，并将所述反应在室温搅拌12小时。所述反应的完成通过tlc来监测 (dcm/meoh/hco2h 9/1/0.1，pma显剂)。在浓缩后添加水，并将所述溶液用dcm萃取。将粗品材料通过硅胶快速谱进行纯化。
[0567]
19a，用于快速谱的梯度洗脱剂：在30分钟内从etoac到 etoac/meoh 9/1。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.87(s,1h),5.24 (s,1h),3.75
–
3.62(m,24h),3.40(s,4h),3.29
–
3.20(m,2h),2.46 (t,j＝5.7hz,2h),1.44(s,9h)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ 172.2,156.4,79.2,70.8
–
70.5,70.4,70.3,70.0,67.3,50.7,40.7,39.7, 37.0,28.5。ms(esi)m/z：434.2[m+h]
+
。
[0568]
19b，用于快速谱的梯度洗脱剂：在30分钟内从dcm到 dcm/meoh 9/1。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.92(brs,1h),5.19 (brs,1h),3.84
–
3.58(m,16h),3.45
–
3.30(m,4h),3.29
–
3.18(m, 2h),2.46(t,j＝5.4hz,2h),1.46(s,9h)。
13
c nmr(100mhz,cdcl3) δ172.1,156.4,79.1,77.4,77.1,76.8,70.6,70.6,70.5,70.5,70.3,70.2, 79.0,67.2,50.7,40.5,39.1,37.0,28.4,28.3。ms(esi)m/z：522.1[m+ h]
+
。
[0569][0570]
20a，(4,46-二氧代-7,10,13,16,19,22,28,31,34,37,40,43-十二氧杂-3,25,47
‑ꢀ
三氮杂四十九烷-1,49-二基)二氨基甲酸二叔丁酯，c
44h87
n5o
18
，mw＝ 974.2g/mol。
[0571]
20b，(4,34-二氧代-7,10,13,16,22,25,28,31-八氧杂-3,19,35-三氮杂三十七烷-1,37-二基)二氨基甲酸二叔丁酯，c
36h71
n5o
14
，mw＝798.0g/mol。
[0572]
通用程序：向叠氮化物衍生物(19a或19b)在脱气二噁烷中的溶液(0.5mmol/ml)添加pd/c(0.05eq.)。将所述溶液在氢气气氛下在60℃搅拌4小时。在冷却至室温后，将所述混合物在dcm中稀释并通过垫过滤。在浓缩后，将所述粗品材料通过快速谱进行纯化(sioh，优选地用dcm/meoh/nh4oh 9/0.9/0.1溶液去活化，在 30分钟内从dcm到dcm/meoh/nh4oh 9/0.9/0.1)。
[0573]
20a，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.93(s,2h),5.30(s,2h), 3.72(t,j＝5.7hz,4h),3.68
–
3.54(m,44h),3.38
–
3.30(m,4h),3.28
ꢀ–
3.18(m,4h),2.81(t,j＝5.2hz,4h),2.46(t,j＝5.7hz,4h),1.43 (s,18h)。nh信号丢失。
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ171.7(2c), 156.2(2c),78.5(2c),77.8(2c),77.5(2c),77.2(2c),70.3
–
70.0, 67.0(2c),48.9(2c),40.2(2c),39.5(2c),36.7(2c),28.3(6c)。 ms(esi)m/z：798.4[m+h]
+
。
[0574]
20b，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.95(s,2h),5.31(d,j＝12.5 hz,2h),3.74
–
3.55(m,32h),3.38
–
3.32(m,4h),3.27
–
3.19(m, j＝5.3hz,4h),2.80(t,j＝5.3hz,4h),2.46(t,j＝5.8hz,4h),1.43 (s,18h)。nh信号丢失。
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ172.2(2c), 156.4(2c),79.2(2c),77.4(2c),77.2(2c),77.0(2c),76.7(2c), 70.6
–
70.2(6c),67.3(2c),49.2(2c),40.6(2c),39.7(2c),37.0 (2c),28.5(6c)。ms(esi)m/z：974.4[m+h]
+
。
[0575][0576]
21a，(25-(1-叠氮基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酰基)-4,46-二氧代-7,10,13,16,19,22,28,31,34,37,40,43-十二氧杂-3,25,47-三氮杂四十九烷-1,49-二基)二氨基甲酸二叔丁酯，c
59h114
n8o
25
，mw＝1335.6g/mol。21b，(19-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰基)-4,34-二氧代-7,10, 13,16,22,25,28,31-八氧杂-3,19,35-三氮杂三十七烷-1,37-二基)二氨基甲酸二叔丁酯，c
47h90
n8o
19
，mw＝1071.3g/mol。
[0577]
通用程序：向酸性衍生物(11a或11b，1.05eq.)在dcm中的溶液(0.5mmol/ml)添加hobt(1.3eq.)和edc(1.3eq)。将所述溶液在室温搅拌15分钟。添加二烷基胺衍生物(20a或
20b，1.0eq.)和 tea(3eq.)在dcm中的溶液(0.5mmol/ml的二烷基胺)，并将所述反应在室温搅拌12小时。所述反应的完成通过tlc来监测 (dcm/meoh/hco2h 9/1/0.1，pma显剂)。在浓缩后，将所述粗品材料通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从dcm到 dcm/meoh 85/15)。
[0578]
21a,1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.89(s,2h),5.27(s,2h), 3.79
–
3.53(m,76h),3.41
–
3.32(m,6h),3.24(d,j＝5.3hz,4h), 2.68(t,j＝7.0hz,2h),2.46(t,j＝5.7hz,4h),1.43(s,18h)。
13
cnmr (100mhz,cdcl3)δ172.0,171.2,156.3,78.9,77.6,77.3,77.0,70.6
–ꢀ
70.2,70.1,69.9,69.3,69.2,67.4,67.2,50.6,48.7,46.1,40.4,39.6,36.8, 33.4,28.4。ms(esi)m/z：1071.4[m+h]
+
。
[0579]
21b,1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.91(s,2h),5.27(s,2h), 3.81
–
3.52(m,52h),3.41
–
3.30(m,6h),3.24(s,4h),2.68(t,j＝ 6.4hz,2h),2.45(t,j＝5.2hz,4h),1.43(s,18h)。
13
cnmr(100 mhz,cdcl3)δ171.1,171.7,171.1,156.1,78.7,70.4
–
69.9,69.7,69.0, 67.2,67.0,53.3,50.4,48.5,46.0,40.2,39.5,36.6,33.3,28.2。ms(esi) m/z：668.6[(m+2h)/2]
2+
。
[0580][0581]
22a,25-(1-叠氮基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酰基)-4,46-二氧代-7,10,13,16,19,22,28,31,34,37,40,43-十二氧杂-3,25,47-三氮杂四十九烷-1,49-二铵氯化物，c
49h100
cl2n8o
21
，mw＝1208.3g/mol。
[0582]
22b,19-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰基)-4,34-二氧代-7,10, 13,16,22,25,28,31-八氧杂-3,19,35-三氮杂三十七烷-1,37-二铵氯化物， c
37h76
cl2n8o
15
，mw＝943.9g/mol。
[0583]
通用程序：向三peg
6-叠氮化物(21a或21b，1.0eq.)在dcm中的溶液(0.05mmol/ml)添加二噁烷中的4m hcl溶液(20eq.)。将所述溶液在室温搅拌3小时并在减压下浓缩。所述粗品材料不需任何进一步纯化用于下一步骤中。反应的完成通过tlc(dcm/meoh 9/1， pma或茚三酮(nihydrine)显剂)和1h nmr来检查。
[0584]
22a,1h nmr(400mhz,cd3od)δ3.87
–
3.45(m,80h),3.39 (s,2h),3.12(s,4h),2.76(s,2h),2.50(s,4h)。nh2和nh信号丢失。
[0585]
22b,1h nmr(400mhz,cd3od)δ3.81
–
3.59(m,52h),3.50 (dd,j＝6.3和12.5hz,4h),3.43
–
3.37(m,2h),3.09(d,j＝5.3hz, 4h),2.76(t,j＝6.2hz,2h),2.51(t,j＝5.9hz,4h)。nh2和nh 信号丢失。
[0586][0587]
23a,二krytox-peg
18-叠氮化物
[0588]
23b,二krytox-peg
12-叠氮化物
[0589]
通用程序：向krytox157fsh-cocl 5(2eq.)在novec 7100中的溶液(0.1g/ml)添加胺衍生物(22a或22b,1eq.)和tea(3eq.)在dcm(20ml)中的溶液。将在蒸发掉溶剂后获得的粗产物溶解在novec 7500/fc 3283(1/1)混合物中。将含氟层用chcl3洗涤三次并在减压下浓缩，得到作为微黄油状物的二krytox-peg-叠氮化物表面活性剂23a和23b。
[0590][0591]
24a,(4,46-二氧代-25-(1-(4-((5-((3as,4s,6ar)-2-氧六氢-1h-噻吩并[3,4-d] 咪唑-4-基)戊酰胺基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酰基)-7,10,13,16,19,22,28,31,34,37,40,43-十二氧杂-3,25, 47-三氮杂四十九烷-1,49-二基)二氨基甲酸二叔丁酯，c
72h133n11o27
s， mw＝1616.9g/mol。
[0592]
在氩气下在shlenk烧瓶中添加生物素-炔烃(1.5eq.，158mg，0.56 mmol)、三peg
6-n
3 22a(1eq.，500mg，0.37mmol)、thf(3ml) 和水(3ml)。将所述烧瓶排气并用氩气回充。将所述排气和充气的过程重复三次。向所述混合物添加抗坏血酸钠(0.8eq.，59.3mg，0.30 mmol)和cuso4.5h2o(30％，28mg，0.11mmol)，并将所述烧瓶排气并用氩气回充。将得到的混合物在室温搅拌4小时。tlc监测： dcm/meoh 15％，显剂kmno4。将得到的溶液用水(50ml)稀释，用dcm(4
×
50ml)萃取，用mgso4干燥并在减压下浓缩。通过快速谱进行纯化(rp-c18 16g；在30分钟内从h2o到h2o/acn 6/4)，得到作为微黄油状物的三peg
6-生物素24a。
[0593]
24a,1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.73(s,1h),7.51(d,j＝9.5 hz,1h),6.94(s,2h),6.62(s,1h),6.06(s,1h),5.30(d,j＝4.0hz, 2h),4.58
–
4.47(m,4h),4.43
–
4.32(m,2h),3.85(t,j＝5.2hz,2h), 3.79
–
3.51(m,74h),3.34(dd,j＝5.5和11.2hz,4h),3.23(d,j＝5.4 hz,4h),3.14(dd,j＝7.3和11.8hz,1h),2.93(dd,j＝5.0和12.8hz, 1h),2.77(d,j＝12.6hz,1h),2.68(t,j＝6.9hz,2h),2.45(t,j＝5.8 hz,4h),2.31
–
2.14(m,2h),1.81
–
1.61(m,4h),1.43(s,18h),1.41
ꢀ–
1.18(m,2h)。
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ173.2,171.9,171.2,
9h)。
[0611]
ms(esi)m/z：793.4[m]
+
。
[0612]
tamra-peg
6-nh2(tfa盐)，28
[0613]
(1-(4-羧基-3-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3h-呫吨-9-基)苯基)-1-氧-5,8,11,14,17-五氧杂-2-氮杂十九烷-19-胺2,2,2-三氟乙酸盐)
[0614][0615]c41h50
f6n4o
13 mw＝920.84g/mol
[0616]
向tamra-peg
6-nhboc 27(1eq.，60mg，0.076mmol)在meoh (3ml)中的溶液添加二噁烷中的4m hcl溶液(15eq.，0.28ml，1.14 mmol)，并将所述反应在室温搅拌3小时。在减压下浓缩后，将所述混合物溶解在极少量meoh中，并通过快速谱进行纯化(rp 16g， h2o(0.05％ tfa)到acn，30分钟)，得到作为粉红固体的 tamra-peg
6-nh2(tfa盐)28(59.2mg，0.0643mmol，85％)。
[0617]1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.40(d,j＝8.2hz,1h),8.21(dd, j＝1.8,8.2hz,1h),7.88(dd,j＝33.9,10.5hz,1h),7.16(d,j＝9.5hz, 2h),7.06(dd,j＝2.4,9.5hz,2h),6.99(d,j＝2.4hz,2h),3.75
–
3.70 (m,2h),3.69
–
3.55(m,20h),3.31(s,12h),3.15
–
3.11(m,2h)。 co2h、nh和nh2信号丢失。
[0618]
ms(esi)m/z：693.2[m]
+
。
[0619]
tamra-peg
6-bcn(tfa盐)，30
[0620]
(n-(9-(5-((1-((1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)-3-氧-2,7,10,13,16,19
‑ꢀ
六氧杂-4-氮杂二十一烷-21-基)氨基甲酰基)-2-羧基苯基)-6-(二甲基氨基)-3h-呫吨-3-亚基)-n-甲基甲胺2,2,2-三氟乙酸盐)
[0621][0622]c50h61
f3n4o
13 mw＝983.03g/mol
[0623]
向tamra-peg
6-nh
2 28(tfa盐)(1eq.，17mg，0.018mmol) 和tea(5eq.，0.013ml，0.092mmol)在dmf(2ml)中的溶液添加(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯基)碳酸酯29(1.1 eq.，6.4mg，0.020mmol)。将所述反应在室温搅拌3小时。在减压下蒸发后，将所述粗品材料通过制备hplc进行纯化，得到作为粉红固体的tamra-peg
6-bcn(tfa盐)30(12.2mg，0.012mmol，67％)。
[0624]1h nmr(400mhz,d
6-dmso)δ8.82(t,j＝5.5hz,1h),8.29 (d,j＝8.2hz,1h),8.24
75mm载玻片(fisher bioblock)。使用商品化表面涂层剂(abcr，ab111155)使通道亲氟。通道的高度为40μm，喷嘴尺寸为25μm，通道宽度为40μm。第二个芯片被用于重新注射收集到的乳液，其具有50μm的通道宽度。
[0636]
微流体站：
[0637]
如果没有提到，则所有光学材料都购自thorlab。光学装置包括安装在光学实验台上的eclipse ti倒置显微镜(nikon)，并包括4个激光器(strasus-375nm 16mw，stradus-488nm 50mw，stradus-532nm 40 mw和stradus-642nm 110mw)。发射的荧光通过光电倍增管(pmt， hamamatsu photosensor h10722-20)检测。来自于pmt的输出信号使用执行在labview 2013(fpga模块，national instruments corporation) 中写出的程序的pci-7852r virtex-5 lx50r fpga卡(nationalinstruments corporation)来分析。所述光学实验台还包括相机(guppyf-080，allied vision technologies)。
[0638]
实验装置和材料：
[0639]
流速通过注射泵(harvard apparatus phd 2000)来控制。
[0640]
使用500μl/h的水相流速和500μl/h的含氟油相(3m novec7500)流速来产生40-50pl的液滴。乳液被收集在装有油的eppendorf 管中，并用pdms塞封闭以防止由于接触空气而聚结。对于对照和表面活性剂稀释实验来说，在油相中使用2.5％w/w的非功能化的表面活性剂(008-氟表面活性剂，ran biotechnologies)。对于spaac反应来说，在油相中以2.5％w/w使用叠氮化物二嵌段表面活性剂 krytox-peg
12-叠氮化物14和叠氮化物三嵌段表面活性剂二 krytox-peg
12-叠氮化物23b。对于水相来说，将tamra-peg
6-bcn 30、磺基cy5-bcn 32和对照荧光团(tamra-6-co2h和cy5-炔烃)溶解在pluronic f-127(0.01％，在pbs 1x中)中。
[0641]
将w/o乳液重新注射在第二个芯片中，并用含氟油(3m novec 7500)间隔。使用200μl/h的novec 7500流速和100μl/h的乳液样品流速。
[0642]
用作荧光团对照的acms按照文献合成(woronoff,g.,el harrak, a.,mayot,e.,schicke,o.,miller,o.j.,soumillion,p.,griffiths,a.d., ryckelynck m.anal.chem.,2011,83,2852-2857)。
[0643]
共聚焦显微术：
[0644]
w/o乳液使用leica spe共聚焦显微镜来分析(所使用的激光： 405nm(acms)，561nm(tamra衍生物)和635nm(磺基cy5 衍生物)，物镜20x，leica 11506513)。
[0645]
荧光偏振：
[0646]
将w/o乳液(15
–
30μl)置于96孔半区微孔板3686 上。荧光偏振分析使用victor 3多标记物读板器进行一式三份 (激发/发射波长为620/665nm)。
[0647]
2.结果
[0648]
2.1使用krytox-peg
12-叠氮化物14在液滴内表面处的spaac反应
[0649]
使用krytox-peg
12-叠氮化物14和两种荧光bcn衍生物(磺基 cy5-bcn 32图6和tamra peg6-bcn30图7)评估在液滴内表面处的spaac反应。
[0650]
使用novec 7500中2.5％的叠氮化物二嵌段表面活性剂 (krytox-peg
12-叠氮化物14)和作为水相的pluronic 0.01％中300nm 的磺基cy5-bcn 32制备第一乳液(图6a)。在乳
液重新注射期间获得的信号显示，磺基cy5荧光在所述液滴的前面和背面更高，表明所述探针优选地位于所述水液滴的内表面处。这一结果通过共聚焦显微术得以验证，其清楚地证实，作为叠氮化物氟表面活性剂14与具有环张力的荧光环炔烃32之间的点击反应的结果，荧光集中在微液滴的内表面处。为了证实所述反应的特异性，还进行了两个阴性对照。首先将非功能化的商品化氟表面活性剂(008-f，ran biotechnologies)和荧光bcn衍生物32用于制备第二乳液(图6b)。最后，在磺基cy5
‑ꢀ
炔烃荧光团存在下使用叠氮化物二嵌段表面活性剂14产生微液滴(图 6c)。这种荧光团对照没有用具有环张力的炔烃功能化，并且在没有铜催化剂的情况下不能发生点击反应。在两种情况下，来自于pmt的信号和共聚焦显微术显示荧光在所述液滴内是均匀的，证实了在这些条件下不发生点击反应。
[0651]
使用第二种荧光bcn衍生物tamra-peg
6-bcn 30获得了类似的结果。只有在tamra-peg
6-bcn 30存在下使用krytox-peg
12-叠氮化物14时才发生spaac反应，正如由荧光集中在液滴内表面处所显示的 (图7a)。使用非功能化的表面活性剂(008-f，图7b)或非功能化的荧光团(tamra-6-co2h，图7c)产生具有均匀荧光浓度的微液滴，证实了spaac反应没有发生。
[0652]
通过在用二嵌段-叠氮化物14作为氟表面活性剂稳定化的微液滴中共同包封两种荧光探针，评估了微液滴表面多功能化。将磺基 cy5-bcn 32和tamra-peg
6-bcn 30在pluronic 0.01％(在pbs 1x中) 中稀释到200nm，并将novec 7500中2.5％的krytox-peg
12-叠氮化物14用作油相。在乳液重新注射期间来自于pmt的信号和共聚焦显微术显示，两种探针的荧光都优选地位于微液滴内表面处(图8)。
[0653]
2.2二嵌段-叠氮化物在商品化的非功能化表面活性剂008-f中的稀释
[0654]
为了调节叠氮化物基团的表面密度，将二嵌段-叠氮化物14在商品化的非功能化氟表面活性剂(008-f，ran biotechnologies)中稀释。评估三种浓度的在商品化氟表面活性剂(008-f)中的krytox-peg
12-叠氮化物14(a：20％，b：10％和c：5％)的spaac反应。水相在 pluronic 0.01％中装载有300nm的磺基cy5-bcn 32和1μm的对照荧光团acms。对于浓度a(14 20％)和b(14 10％)来说获得了表面定位的荧光的特征性pmt信号，但对于浓度c(14 5％)来说没有获得。对于所有条件来说，共聚焦显微术揭示出在二嵌段-叠氮化物在商品化的非功能化表面活性剂中稀释之后，发生了spaac反应(图9)。在所有条件中，对照荧光团分布在所述液滴内，这通过乳液重新注射期间的pmt信号和共聚焦显微术得以证实。
[0655]
2.3通过荧光偏振进行表面功能化的表征
[0656]
为了表征在界面处叠氮化物表面密度的调节，在与具有环张力的荧光炔烃衍生物反应后对收集到的乳液进行了荧光偏振分析。第一批实验在维持荧光磺基cy5-bcn探针的浓度恒定的同时，使用在商品化的非功能化表面活性剂中的多种浓度的二嵌段-叠氮化物14进行。制备了7种乳液，其将非功能化的表面活性剂(008-f)中浓度逐渐提高的 krytox-peg
12-叠氮化物14(0、1、5、10、20、50和100％)用于油相，并且将pluronic 0.01％中250nm的磺基cy5-bcn 32用于水相。结果描绘在图10中。浓度逐渐提高的二嵌段-叠氮化物14导致偏振荧光增加，表明更高浓度的荧光探针被捕获在液滴的内表面处。此外，结果显示，在20％的二嵌段-叠氮化物14左右，荧光偏振达到平台。从这一浓度开始，微液滴表面似乎不被饱和，并且具有环张力的荧光炔烃探针可以完全与内表面处的所述叠氮化物组成部分反应。考虑到微液滴体积为 44pl并且32的浓度为250nm，粗略的计算表明一个液滴含有约11 阿
摩尔(attomol)的探针32。因此，使用14/008-f 20/80混合物稳定化的微液滴在它们的内表面处含有11阿摩尔的叠氮化物，对应于表面密度为1.8nmol/m2。
[0657]
第二个荧光偏振实验使用不同浓度的磺基cy5-bcn探针32进行。商品化表面活性剂(008-f)中5％浓度的krytox-peg
12-叠氮化物14维持恒定，并且水相装载有浓度不断提高的磺基cy5-bcn 32(0.01、0.1、 1和10μm，在pluronic 0.01％中)。结果描绘在图11中。也进行了只使用非功能化的表面活性剂008-f作为稳定剂的阴性对照，并且对于每种探针浓度来说荧光偏振保持恒定(186
±
15mp)。在10至100nm 之间没有观察到荧光偏振的改变，表明微液滴表面在该浓度范围下未被饱和。将荧光探针浓度提高到1μm导致荧光偏振减小。因此，微液滴界面显得在100nm至1μm的游离探针之间饱和。这对应于每个液滴的叠氮化物基团的量在4.4至44阿摩尔之间。令人满意的是，对于 5％的叠氮化物表面活性剂来说4.4-44阿摩尔的叠氮化物/液滴这一数字与上面为20％的叠氮化物表面活性剂获得的约11阿摩尔的叠氮化物 /液滴的结果相符。最后，在10μm下，阴性和阳性对照表现出相同的荧光偏振值，显示出位于微液滴内表面处的荧光团探针的量与所述液滴内部的游离荧光团探针相比可以忽略。
[0658]
2.4使用三嵌段-叠氮化物(二krytox-peg
12-叠氮化物23b)的spaac反应
[0659]
按照应用于二嵌段-叠氮化物14的相同条件，评估了三嵌段-叠氮化物氟表面活性剂在微液滴内表面处的spaac反应。为此，将二 krytox-peg
12-叠氮化物以2.5％用于novec 7500中，以首先分开地、然后合在一起包封所述两种荧光探针。所述两种荧光探针成功地与三嵌段-叠氮化物表面活性剂23b反应(磺基cy5-bcn 32图12a和 tamra-peg
6-bcn 30图12b)，并且通过共包封所述两种荧光探针也验证了微液滴表面的双功能化(图12c)。
[0660]
实施例3
[0661]
材料和方法
[0662]
1.乳液反转
[0663]
为了反转油包水乳液(w/o)，使用双重乳液来产生包围水性液滴的油囊，并使用电场打破这个囊。从根本上说，内部水性液滴与外部水相的电聚结导致所述油囊的去稳定，产生水包油液滴(o/w)，其外表面对应于它所来自于的水液滴的内表面。流动聚焦汇合被用于在第一个微芯片中产生w/o乳液。使用流动聚焦的双重乳液产生和电去稳定在第二个微芯片上进行(图13)。
[0664]
2.微芯片制造
[0665]
第二个微芯片的微流体通道用autocad(autodesk 2014)设计，以产生双重乳液并使用电极使它去稳定。屏蔽电极防止所述电场四处蔓延(图13)。图2中的l1(3mm)和l2(4mm)必须足够长，以分别防止由电场引起的w/o乳液在重新注射器中电聚结和扰乱双重乳液产生。
[0666]
通过经光刻掩模(selba sa)进行uv暴露(mjb3接触式掩模准直器；suss microtec)并随后显影(su-8显影器；microchem corp.)，在硅晶圆(siltronix)上制造su-8光刻胶(microchem corp.)的模具。向pdms基料(sylgard 184硅酮弹性体试剂盒；dow corningcorporation)添加固化剂至终浓度为10％(w/w)，混合并倾倒在所述模具上至5mm的深度。在脱气几分钟并在70℃下交联过夜后，将所述pdms从所述模具揭下，并用0.75mm直径的harris uni-core活检穿孔器(electron microscopy sciences)穿出输入和输出端
口。所述 pdms通过在氧等离子体(diener zepto)中温育3分钟进行活化，并结合到50mm x 75mm载玻片(fisher bioblock)。
[0667]
第一个微芯片被用于产生30pl的油包水乳液(w/o)液滴。使用商品化表面涂层剂(abcr，ab111155)使通道亲氟。通道的高度为 20μm，喷嘴尺寸为25μm，通道宽度为40μm。
[0668]
第二个微芯片被用于产生双重乳液并用电场使它去稳定。芯片在刚刚使用氧等离子体将pdms结合到载玻片之后，使得pdms仍然亲水时使用。
[0669]
通道的高度、重新注射通道的宽度和双重乳液产生通道的宽度分别为20μm、30μm和50μm。电极由盐溶液(nacl 180g/l，在去离子水中，sigma s3014)制成，并被模制在所述通道周围具有相同高度的平行通道中。使用函数发生器(agilent，33220a)和电压扩增器(trekmodel 623d)，以400v和10khz向电极施加正弦曲线电压波。
[0670]
3.微流体站装置
[0671]
如果没有提到，则所有光学材料都购自thorlab。光学装置包括安装在光学实验台上的eclipse ti倒置显微镜(nikon)。使用二向镜“d3”将640nm激光(obis，相干的)和532nm激光(mxl-iii-532) 光束合并，并使用二向镜“d2”将得到的光束与488nm激光(picarro) 合并。使用二向镜“d1”将得到的光束与375nm激光(las， newport-sprectraphysics)合并，使用镜子“m”导入显微镜物镜，并使用二向镜“d5”聚焦在所述装置的通道中间所述检测点处。发射的荧光被显微镜物镜收集，并通过第一个二向镜“d5”与所述激光光束分离开。分别使用二向镜“d6”、“d7”、“d8”和“d9”将蓝光、绿光、橙光和红光与其他光分辨开。发射的荧光通过光电倍增管(pmt，hamamatsu photonics kk)检测，其装备有用于蓝光的带通滤波器“f1”、用于绿光的“f2”、用于橙光的“f3”、用于红光的“f4”和用于红外光的“f5”。来自于pmt的输出信号使用执行在 labview 2013(fpga模块，national instruments corporation)中编写的程序的pci-7831r rio多功能fpga卡(national instrumentscorporation)来分析。所述系统的数据获取速率是166khz。整个过程通过使用二向镜“d0”将一部分发射的光重新导向ccd相机(guppy， allied vision technologies)来监测，所述相机装备有长通滤波器“f0”来消除所述激光的潜在损伤性的反射(图16)。
[0672]
4.实验装置和材料
[0673]
流速通过注射泵(harvard apparatus phd 2000)来控制。w/o乳液使用在磷酸盐缓冲盐水(pbs)(sigma p-3619)中含有500nm荧光链亲合素(lifetechnologies,s11223)的水相来生产。使用400μl/h的水相流速和400μl/h的含氟油相(3m novec 7500)流速来产生30pl 的液滴。乳液被收集在装有油的eppendorf管中，并用pdms塞封闭以防止由于接触空气而聚结。对于对照实验来说，在油相中使用5％w/w 的非功能化的表面活性剂(008-氟表面活性剂，ran biotechnologies)。对于蛋白质捕获来说，将特定表面活性剂(krytox-peg-生物素)用生物素功能化以特异性结合到链亲合素，并以5％w/w的油相使用。
[0674]
w/o乳液以堆积方式(由于油与水之间的密度差异)重新注射(入口1，图14)在第二个微芯片中。水液滴(50μl/h)被油(50μl/h)隔开(入口2，图14)。使用流速为200μl/h的由pbs中的2.5μm dye647 (dyomics 647-00)和triton x-100 1％w/w(sigma x-100)制成的外部水性液流，产生双重乳液(入口3，图14)。通过插入在图14中的 a(300vpp，10khz)和b(0v)入口中的接头，跨过电极施加ac电场。
[0675]
结果
[0676]
1.蛋白质捕获
[0677]
在使用非功能化的表面活性剂的对照实验中，在整个液滴中来自于链亲合素的荧光是均匀的(图16)。在生物素化的表面活性剂存在下，链亲合素荧光位于所述液滴的内表面处，表明链亲合素优选地位于所述水液滴的内表面处(图16)。
[0678]
2.相反转
[0679]
在使用非功能化的表面活性剂的对照实验中，在所述油液滴之间的链亲合素荧光比在所述油液滴上的荧光更高，其中在所述液滴上平均值为0.2v，表明链亲合素不位于所述油液滴的外表面中(图17)。在使用功能化的表面活性剂的实验中，在所述油液滴上的链亲合素荧光(平均值为0.55v)比它们之间的荧光更高(图17)，表明在相反转后链亲合素仍结合到生物素化的表面活性剂。对于数据分析来说，未经反转的液滴凭借尺寸被清除，因为它们比反转的液滴更大。
[0680]
通过将所述油液滴上链亲合素荧光的平均值作图，阴性和阳性体可以在柱状图上区分开(图18)。中心在0.22v左右的第一个体是阴性对照，而中心在0.55v左右的体是阳性。这种反转方法允许快速清晰地分离阳性和阴性液滴。
[0681]
实施例4
[0682]
材料和方法
[0683]
1.乳液反转
[0684]
为了反转油包水乳液(w/o)，使用双重乳液来产生包围水性液滴的油囊，并使用施加在外部水相上的电压来打破这个油囊。从根本上说，内部水性液滴与外部水相的电聚结导致所述油囊的去稳定，产生水包油液滴(o/w)，其外表面对应于它所来自于的水液滴的内表面。流动聚焦汇合被用于在第一个微芯片中产生w/o乳液。使用流动聚焦的双重乳液产生在第二个微芯片上进行，并且电去稳定在其上施加有电压的电穿孔杯上进行。
[0685]
2.微芯片制造
[0686]
第二个微芯片的微流体通道用autocad(autodesk 2014)设计，以产生双重乳液，并将它在具有延迟线的芯片上温育，以使它去稳定。
[0687]
通过经光刻掩模(selba sa)进行uv暴露(mjb3接触式掩模准直器；suss microtec)并随后显影(su-8显影器；microchem corp.)，在硅晶圆(siltronix)上制造su-8光刻胶(microchem corp.)的模具。向pdms基料(sylgard 184硅酮弹性体试剂盒；dow corningcorporation)添加固化剂至终浓度为10％(w/w)，混合并倾倒在所述模具上至5mm的深度。在脱气几分钟并在70℃下交联过夜后，将所述pdms从所述模具揭下，并用0.75mm直径的harris uni-core活检穿孔器(electron microscopy sciences)穿出输入和输出端口。所述 pdms通过在氧等离子体(diener zepto)中温育3分钟进行活化，并结合到50mm x 75mm载玻片(fisher bioblock)。
[0688]
第一个微芯片被用于产生30pl的油包水乳液(w/o)液滴。使用商品化表面涂层剂(abcr，ab111155)使通道亲氟。通道的高度为 20μm，喷嘴尺寸为25μm，通道宽度为40μm。
[0689]
第二个微芯片被用于产生双重乳液并使它去稳定。芯片在刚刚使用氧等离子体将pdms结合到载玻片之后，使得pdms仍然亲水时使用。
[0690]
通道的高度、重新注射通道的宽度和双重乳液产生通道的宽度分别为40μm、30μm
和50μm。
[0691]
3.微流体站装置
[0692]
参见实施例3。
[0693]
4.实验装置和材料
[0694]
流速通过注射泵(harvard apparatus phd 2000)来控制。w/o乳液使用由pbs缓冲液(sigma p-3619)构成的水相来生产。使用400μl/h 的水相流速和400μl/h的含氟油相(3m novec 7500)流速来产生30pl 的液滴。乳液被收集在装有油的eppendorf管中，并用pdms塞封闭以防止由于接触空气而聚结。在油相中使用5％w/w的非功能化的表面活性剂(008-氟表面活性剂，ran biotechnologies)。
[0695]
w/o乳液以堆积方式(由于油与水之间的密度差异)重新注射在第二个微芯片中。水液滴(50μl/h)被油(50μl/h)隔开(图19)。使用流速为200μl/h的由水中的triton x-100 1％w/w(sigma x-100) 制成的外部水性液流，产生双重乳液。将双重乳液转移到1mm电穿孔杯中(图20)，在其上施加10v、25v和50v电压，持续时间为100ms。
[0696]
结果
[0697]
对于持续时间为100ms的低于25v的施加电压来说，所述双重乳液仍然完整，没有观察到反转。对于持续时间为100ms的50v的施加电压来说，观察到反转，并获得简单的o/w乳液(图21)。
[0698]
实施例5
[0699]
材料和方法
[0700]
1.乳液反转
[0701]
为了反转油包水乳液(w/o)，使用双重乳液来产生包围水性液滴的油囊，并且我们观察到，当在芯片上在室温温育时，该囊自己破裂。从根本上说，内部水性液滴与外部水相的聚结导致所述油囊的去稳定，产生水包油液滴(o/w)，其外表面对应于它所来自于的水液滴的内表面。流动聚焦汇合被用于在第一个微芯片中产生w/o乳液。使用流动聚焦的双重乳液产生和自发去稳定在第二个微芯片上进行。
[0702]
2.微芯片制造
[0703]
第二个微芯片的微流体通道用autocad(autodesk 2014)设计，以产生双重乳液，并将它在具有延迟线的芯片上温育以使它去稳定。
[0704]
通过经光刻掩模(selba sa)进行uv暴露(mjb3接触式掩模准直器；suss microtec)并随后显影(su-8显影器；microchem corp.)，在硅晶圆(siltronix)上制造su-8光刻胶(microchem corp.)的模具。向pdms基料(sylgard 184硅酮弹性体试剂盒；dow corningcorporation)添加固化剂至终浓度为10％(w/w)，混合并倾倒在所述模具上至5mm的深度。在脱气几分钟并在70℃下交联过夜后，将所述pdms从所述模具揭下，并用0.75mm直径的harris uni-core活检穿孔器(electron microscopy sciences)穿出输入和输出端口。所述 pdms通过在氧等离子体(diener zepto)中温育3分钟进行活化，并结合到50mm x 75mm载玻片(fisher bioblock)。
[0705]
第一个微芯片被用于产生30pl的油包水乳液(w/o)液滴。使用商品化表面涂层剂(abcr，ab111155)使通道亲氟。通道的高度为 20μm，喷嘴尺寸为25μm，通道宽度为40μm。
[0706]
第二个微芯片被用于产生双重乳液并使它去稳定。芯片在刚刚使用氧等离子体将
pdms结合到载玻片之后，使得pdms仍然亲水时使用。
[0707]
通道的高度、重新注射通道的宽度和双重乳液产生通道的宽度分别为40μm、30μm和50μm。使用10分钟的延迟线来观察芯片上的自发去稳定。
[0708]
3.微流体站装置
[0709]
参见实施例3。
[0710]
4.实验装置和材料
[0711]
a.相反转
[0712]
流速通过注射泵(harvard apparatus phd 2000)来控制。w/o乳液使用由pbs缓冲液(sigma p-3619)构成的水相来生产。使用400μl/h 的水相流速和400μl/h的含氟油相(3m novec 7500)流速来产生30pl 的液滴。乳液被收集在装有油的eppendorf管中，并用pdms塞封闭以防止由于接触空气而聚结。在油相中使用5％w/w的非功能化的表面活性剂(008-氟表面活性剂，ran biotechnologies)。
[0713]
w/o乳液以堆积方式(由于油与水之间的密度差异)重新注射(入口1，图23)在第二个微芯片中。水液滴(50μl/h)被油(50μl/h)隔开(入口2，图23)。使用流速为200μl/h的由水中的triton x-100 1％ w/w(sigma x-100)制成的外部水性液流，产生双重乳液(入口3，图 23)，并将它在芯片上、在延迟线中温育10分钟(图22和23).
[0714]
b.蛋白质捕获
[0715]
使用一步抗体生物素化试剂盒(miltenyi biotec，130-093-385)，将fitc偶联的山羊抗小鼠igg抗体(lifetechnologies,62-6511)生物素化。将100nm的该抗体与1um的alexafluor532链亲合素 (lifetechnologies,s11223)在磷酸盐缓冲盐水(sigma p-3619)中在室温下预混合45min。使用该预混合的水相生产w/o乳液。使用 400μl/h的水相流速和400μl/h的含氟油相(3m novec 7500)流速来产生30pl的液滴。
[0716]
对于对照实验来说，在油相中使用2.5％w/w的非功能化的表面活性剂(008-氟表面活性剂，ran biotechnologies)。对于蛋白质捕获来说，将特定表面活性剂(krytox-peg-生物素)用生物素功能化以特异性结合到链亲合素，并以2.5％w/w的油相使用。
[0717]
结果
[0718]
1.相反转
[0719]
在双重乳液产生后，观察到相反转自发发生(图24)。在表面活性剂存在下，内部水相、油相和外部水相之间的界面恰巧不稳定。然而，对于所有液滴来说，没有在同样时间内发生反转，这是由表面活性剂迁移时间造成的。对于数据分析来说，没有反转的液滴凭借尺寸被清除，因为它们比反转的液滴更大。
[0720]
2.蛋白质捕获
[0721]
在非功能化的表面活性剂存在下，在共聚焦图像中来自于igg的绿荧光位于所述液滴的体积中。相反，在生物素-表面活性剂存在下，来自于igg的绿荧光位于所述液滴的表面上，表明所述表面活性剂捕获具有链亲合素的igg(图25)。
[0722]
在生物素-表面活性剂和自发反转存在下，在相反转后，来自于igg 的绿荧光保留在所述液滴的表面处，表明在相反转后捕获仍保持(图 26)。
[0723]
实施例6：多叠氮化物表面活性剂的合成
[0724]
带有两个或四个叠氮化物组成部分的多叠氮化物表面活性剂按照图27中报道的
合成策略来合成。该合成的关键中间体在于通过还原性叠氮化物二聚化制备含有两个叠氮化物组成部分的二烷基胺peg连接物38。对于二叠氮化物表面活性剂44来说，将该中间体偶联到包含羧酸组成部分和n-boc保护的基团的第三个peg链41。在n-boc裂解后，将所述羟基头部偶联到krytox-cocl 5，得到二叠氮化物氟表面活性剂44。通过用两个二烷基胺38取代三聚氯氰，随后引入乙二胺，然后与 krytox-cocl 5进行偶联反应，也获得了四叠氮化物表面活性剂47。
[0725]
2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇33(sayyadi,n.； connallyc,r.e.；try,a.chemmun.,2016,52,1154-1157)和1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯39(garofalo,a.；parat,a.； bordeianu,c.；ghobril,c.；kueny-stotz,m.；walter,a.；jouhannaud, j.；begin-colina,s.；felder-flesch,d.new j.chem.,2014,38, 5226-5239)按照文献中描述的程序来合成。
[0726]
34,3,6,9,15,18,21-六氧杂-12-氮杂二十三烷-1,23-二醇
[0727][0728]
向33(1eq.，1.14g，5.20mmol)在二噁烷(10.4ml)中的溶液添加pd/c(5％。0.28g，0.26mmol)。将所述混合物在大气压的h2下搅拌12小时。将所述反应混合物在dcm(150ml)中稀释并通过硅藻土垫过滤。所述粗品不需纯化用于下一步骤中。
[0729]
35，双(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
[0730]c21h43
no
10 mw＝469.57g/mol
[0731][0732]
向34(1eq.，1.3g，3.52mmol)和tea(3eq.，1.47ml，10.60 mmol)在dcm(23.2ml)中的溶液添加boc2o(1.1eq.，0.845g，3.87 mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌过夜。添加50ml nah2po4水溶液(1m)，并将所述混合物用dcm(3
×
50ml)萃取。将粗品通过硅胶快速谱进行纯化(etoac 5min，然后在30分钟内从dcm到 dcm/meoh 9/1)，得到作为微黄油状物的35(1.32g，2.82mmol， 80％)。
[0733]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ3.73-3.71(m,4h),3.66
–
3.56(m, 24h),3.45-3.42(m,4h),1.44(s,9h)。oh信号丢失。
[0734]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ154.9,79.0,72.1,70.1
–
69.8,69.2
ꢀ–
69.0,60.9,47.3
–
47.1,27.9(3c)。
[0735]
36,12-(叔丁氧基羰基)-3,6,9,15,18,21-六氧杂-12-氮杂二十三烷-1,23-二基双(4-甲基苯磺酸酯)
[0736]c35h55
no
14s2 mw＝777.94g/mol
[0737][0738]
在氩气下向二聚体35(1eq.，734mg，1.56mmol)在dcm(14.5 ml)中的溶液添加tea
(10eq.，2.19ml，15.60mmol)和dmap(0.2 eq.，38.2mg，0.31mmol)。将所述反应混合物在0℃搅拌5分钟，并添加对甲苯磺酰氯(4eq.，1.19g，6.25mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌2小时。添加100ml dcm，并将混合物用nahco3水溶液(3 x 50ml)洗涤，用mgso4干燥并蒸发。将所述粗品通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内环己烷/etoac 1/1到etoac)，得到作为微黄油状物的36(1.11g，1.42mmol，91％)。
[0739]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ7.66(d,j＝8.1hz,4h),7.22(d, j＝8.1hz,4h),4.02(t,j＝4.5hz,4h),3.55(t,j＝4.5hz,4h),3.48
–
3.40 (m,20h),3.34
–
3.24(m,4h),2.31(s,6h),1.32(s,9h)。
[0740]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ155.1,144.6,132.8,129.6(4c), 127.7(4c),79.1,70.4
–
70.0,69.4,69.1,68.3,47.4,28.2(3c),21.3。
[0741]
37，双(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
[0742]c21h41
n7o
8 mw＝519.60g/mol
[0743][0744]
向36(1eq.，973mg，1.25mmol)在dmf(8ml)中的溶液添加nan3(4eq.，325mg，5.00mmol)，并将所述混合物在80℃搅拌过夜。在浓缩后，添加100ml dcm，并将所述混合物通过硅藻土垫过滤，并用盐水(3x50ml)洗涤。将有机层用mgso4干燥并蒸发，得到作为黄油状物的37(1.05g，2.02mmol，86％)。
[0745]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ3.83
–
3.49(m,24h),3.51
–
3.30 (m,8h),1.44(s,9h)。
[0746]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ155.1,79.1,71.4
–
69.1,50.5,47.7, 47.4,28.2。
[0747]
38,双(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)胺
[0748][0749]
在氩气下向37(1eq.，1g，1.92mmol)在dcm(20ml)中的溶液添加二噁烷中的4m hcl溶液(15eq.，7.22ml，28.9mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌过夜。在浓缩后，将所述粗品通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从dcm到dcm/meoh/nh4oh 9/0.9/0.1)，得到作为黄油状物的38(605mg，1.44mmol，75％)。
[0750]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ3.72
–
3.54(m,24h),3.39(t,j ＝4.9hz,4h),2.81(t,j＝5.3hz,4h)。nh信号丢失。
[0751]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ70.1,69.8,65.8,50.6,46.8。
[0752]
40，2,2-二甲基-4-氧-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂二十烷-20-酸叔丁酯
[0753]c20h39
no
8 mw＝421.53g/mol
[0754][0755]
向39(1eq.，1.4g，4.03mmol)在meoh(70ml)中的溶液添加pd/c(1％，42mg，0.04mmol)。将所述反应混合物在大气压的 h2下在室温搅拌12小时。在通过硅藻土垫过滤后，将粗品溶解在dcm (30ml)中。添加et3n(2eq.，1.12ml，8.06mmol)和boc2o(1.2 eq.，
1.06g，4.84mmol)，并将所述混合物在室温搅拌过夜。在浓缩后，添加30ml水，并将所述混合物用dcm(3x 50ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并蒸发。将所述粗品通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从环己烷/etoac 1/1到etoac)，得到作为黄油状物的40(1.44g，3.42mmol，85％)。
[0756]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ5.04(bs,1h),3.70(t,j＝6.6hz, 2h),3.66
–
3.56(m,12h),3.53(t,j＝5.0hz,2h),3.35
–
3.25(m,2h), 2.50(t,j＝6.6hz,2h),1.44(s,18h)。
[0757]
41,2,2-二甲基-4-氧-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂二十烷-20-酸
[0758]c16h31
no
8 mw＝365.42g/mol
[0759][0760]
向40(1eq.，1.18g，2.80mmol)在meoh(10ml)和h2o(10 ml)中的溶液添加lioh(5eq.，0.342g，14.00mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌过夜。添加50ml水，并将所述混合物用dcm(3x 50ml)萃取。将水相用柠檬酸水溶液(0.1m，50ml)酸化，并用dcm (3x75ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并浓缩，得到作为无油状物的41(964mg，2.64mmol，94％)。
[0761]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ5.24(bs,1h),3.78(t,j＝6.0hz, 2h),3.73
–
3.54(m,14h),3.40
–
3.19(m,2h),2.61(t,j＝5.6hz,2h), 1.44(s,9h)。co2h信号丢失。
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ174.7, 156.1,79.1,70.4,70.4
–
70.0,66.4,40.2,34.7,28.3。
[0762]
42，(1-叠氮基-12-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-13
‑ꢀ
氧-3,6,9,16,19,22,25-七氧杂-12-氮杂二十七烷-27-基)氨基甲酸叔丁酯
[0763]c32h62
n8o
13 mw＝766.89g/mol
[0764][0765]
向41(1.05eq.，0.875g，2.4mmol)在dcm(10ml)中的溶液添加hobt(1.1eq.，0.339g，2.51mmol)和edc(1.1eq.，0.39g， 2.51mmol)。将所述混合物在室温搅拌15分钟。然后添加38(1eq.， 1.04g，2.28mmol)和tea(3eq.，0.951ml，6.84mmol)在dcm(10 ml)中的溶液，并将所述反应混合物在室温搅拌过夜。在浓缩后，添加100ml水，并将所述混合物用dcm(3x100ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并蒸发。将所述粗品通过硅胶快速谱进行纯化 (在35分钟内从dcm到dcm/meoh 9/1)，得到作为微黄油状物的42(1.43g,1.87mmol，82％)。
[0766]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ5.04(bs,1h),3.71(t,j＝6.9hz, 2h),3.64
–
3.43(m,42h),3.32(t,j＝4.7hz,4h),3.28
–
3.19(m,2h), 2.63(t,j＝6.9hz,2h),1.38(s,9h)。
13
c nmr(cdcl3,100mhz) δ171.1,155.8,78.7,70.6
–
70.0,69.9,69.3,69.1,67.3,50.5,48.6,
46.1, 40.2,33.4,28.3。
[0767]
43,1-氨基-n,n-双(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
[0768]c27h54
n8o
11 mw＝666.77g/mol
[0769][0770]
向42(1eq.，1.10g，1.43mmol)在dcm(20ml)中的溶液添加二噁烷中的4m hcl溶液(15eq.，5.38ml，21.5mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌5小时。在浓缩后，将所述粗品通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从dcm到dcm/meoh/nh4oh 9/0.9/0.1)，得到作为微黄油状物的43(853mg，1.28mmol，89％)。
[0771]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ3.73(t,j＝6.9hz,2h),3.68
–
3.49 (m,40h),3.47(t,j＝5.2hz,2h),3.35(t,j＝4.9hz,4h),2.89
–
2.76 (m,2h),2.66(t,j＝6.9hz,2h)。nh2信号丢失。
[0772]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ171.1,73.2,70.5
–
70.0,69.8,69.2, 69.1,67.3,50.4,48.6,46.0,41.6,33.3。
[0773]
44,krytox-peg
12-二n3[0774][0775]
将krytox157fsh-cocl 5(1eq.，3.00g，0.46mmol)溶解在novec7100(10ml)和dcm(5ml)的混合物中。添加43(1.2eq.， 0.37g，0.55mmol)和tea(3eq.，0.14g，0.192ml，1.38mmol)在 dcm(5ml)中的溶液。将得到的混合物在室温搅拌48小时。将在蒸发掉溶剂后获得的粗品溶解在hfe7500(75ml)中。将得到的溶液转移到分液漏斗中，用dcm/h2o 1/1混合物(2x 200ml)、然后用dcm (100ml)洗涤。将含氟相真空浓缩，得到作为粘性微黄油状物的 krytox-peg
12-二n
3 44。
[0776]
45,n2,n2,n4,n
4-四(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-6-氯
ꢀ‑
1,3,5-三嗪-2,4-二胺
[0777]c35h64
cln
17o12 mw＝950.45g/mol
[0789][0790]
将krytox157fsh-cocl 5(1eq.，1.75g，0.27mmol)溶解在 novec7100(8ml)和dcm(4ml)的混合物中。添加46(1.5eq.， 392mg，0.40mmol)和tea(3eq.，0.112ml，0.81mmol)在dcm (4ml)中的溶液，然后添加hobt(1eq.，36.4mg，0.27mmol)。将得到的混合物在氩气下在室温搅拌48小时。在蒸发掉溶剂后，将获得的粗品溶解在hfe7500(75ml)中。将得到的溶液转移到分液漏斗中，并用dcm/h2o 1/1混合物(2x 200ml)、然后用dcm(100ml) 洗涤。将含氟相在真空中浓缩，得到作为粘性微黄油状物的 krytox-peg
16-四n
3 47。
[0791]
实施例7：偶联试剂的合成
[0792]
合成偶联试剂以确保在将要接枝在所述微液滴内表面处并允许捕获相应靶标的生物分子(寡核苷酸和抗体)上引入具有环张力的炔烃组成部分。按照图28中描述的合成策略合成了含有1或4个bcn组成部分和能够通过赖氨酸残基与氨基-寡核苷酸和抗体反应的活性酯的偶联试剂。为了制备单bcn偶联试剂53，首先合成包含胺和甲基酯的 peg衍生物50，并偶联到采取其硝基苯基碳酸酯活化形式的bcn 29。在所述甲基酯皂化后，将羧酸化合物51活化。四bcn偶联试剂58也通过将三聚氯氰用22b双取代，然后引入丙酸甲酯来获得。然后将所述n-boc组成部分去保护，并将得到的游离胺偶联到预先活化的bcn 衍生物29。将所述甲基酯67皂化，然后活化所述羧酸组成部分，得到所述四bcn偶联试剂58。
[0793]
49，1-叠氮基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸甲酯
[0794]c16h31
n3o
8 mw＝393.44g/mol
[0795][0796]
在0℃下向17-叠氮基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-醇48(1eq.， 3.40g，11.10mmol)和丙烯酸甲酯(1.5eq.，1.49ml，16.60mmol) 在thf(30ml)中的溶液添加tbuok(0.1eq.，135mg，1.20mmol)。将所述反应在室温搅拌5小时。在浓缩后，添加h2o(100ml)并将所述混合物用etoac(150ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并蒸发。将所述粗品通过硅胶快速谱进行纯化(在35分钟内从环己烷到etoac)，得到作为微黄油状物的49(1.80g，4.58mmol，41％)。
[0797]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ3.74(t,j＝6.4hz,2h),3.70
–
3.58 (m,25h),3.38(t,j＝4.7hz,2h),2.59(t,j＝6.4hz,2h)。
[0798]
50，1-氨基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸甲酯
[0799]c16h33
no
8 mw＝393.44g/mol
[0800][0801]
向49(1eq.，600mg，1.53mmol)在meoh(30ml)中的溶液添加pd/c(1％，16.2mg，0.0153mmol)，并将所述混合物在室温和大气压的h2下搅拌14小时。将所述混合物通过硅藻土过滤，浓缩，并通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从dcm到 dcm/meoh/nh4oh 9/0.9/0.1)，得到作为微黄油状物的50(455mg， 1.24mmol，81％)。
[0802]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ3.75(t,j＝6.5hz,2h),3.68(s, 3h),3.67
–
3.59(m,20h),3.50(t,j＝5.2hz,2h),2.85(t,j＝5.2hz, 2h),2.60(t,j＝6.5hz,2h)。nh2信号丢失。
[0803]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ171.8,73.4,70.5
–
70.2,66.5,51.5, 41.7,34.8。
[0804]
51，1-((1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)-3-氧-2,7,10,13,16,19,22-七氧杂-4-氮杂二十五烷-25-酸甲酯
[0805]c27h45
no
10 mw＝543.65g/mol
[0806][0807]
向(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯基)碳酸酯29 (1eq.，250mg，0.79mmol)在0.5ml dmf中的溶液添加50(1.1eq.， 320mg，0.87mmol)和tea(3eq.，0.331ml，2.38mmol)在0.5mldmf中的溶液。将所述反应混合物在室温搅拌过夜。在蒸发后，添加 20ml nahpo4水溶液(1m)，并将所述混合物用etoac(3x 40ml) 萃取。将有机层用mgso4干燥并浓缩。将所述粗品通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从dcm到dcm/meoh 85/15)，得到作为无油状物的51(360mg，0.66mmol，84％)。
[0808]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ5.24(bs,1h),4.15(d,j＝8.0hz, 2h),3.75(t,j＝6.5hz,2h),3.69(s,3h),3.67
–
3.60(m,20h),3.55 (t,j＝5.0hz,2h),3.42
–
3.30(m,2h),2.60(t,j＝6.5hz,2h),2.35
ꢀ–
2.15(m,6h),1.62
–
1.51(m,2h),1.44
–
1.29(m,1h),0.94(t,j ＝9.8hz,2h)。
[0809]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ171.6,156.6,98.5,70.4,
–
70.2, 70.1,69.9,66.4,62.2,51.4,40.6,34.6,28.9,21.2,19.9,17.7。
[0810]
52,1-((1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)-3-氧-2,7,10,13,16,19,22-七氧杂-4-氮杂二十五烷-25-酸
[0811]c26h43
no
10 mw＝529.63g/mol
[0812][0813]
向51(1eq.，915mg，1.68mmol)在10ml meoh/h2o 1/1中的溶液添加lioh(5eq.，
201mg，8.42mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌过夜。在meoh蒸发后，通过添加50ml nah2po4水溶液(1m) 将所述水性层酸化，并用dcm(4x 50ml)萃取。将合并的有机层用 mgso4干燥并浓缩，得到作为微黄油状物的52(815mg，1.54mmol， 91％)。
[0814]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ5.35(bs,1h),4.14(d,j＝8.0hz, 2h),3.77(t,j＝6.0hz,2h),3.71
–
3.58(m,20h),3.56(t,j＝5.0hz, 2h),3.41
–
3.30(m,2h),2.60(t,j＝6.0hz,2h),2.38
–
2.13(m,6h), 1.66
–
1.50(m,2h),1.41
–
1.28(m,1h),0.94(t,j＝9.7hz,2h)。 co2h信号丢失。
[0815]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ173.8,156.9,98.8,70.2,70.7
–
70.2, 66.6,62.7,40.8,35.0,29.1,21.4,20.1,17.8。
[0816]
53，1-((1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)-3-氧-2,7,10,13,16,19,22-七氧杂-4-氮杂二十五烷-25-酸全氟代苯基酯
[0817]c32h42
f5no
10 mw＝695.68g/mol
[0818][0819]
向52(1eq.，800mg，1.51mmol)和五氟苯酚(1.2eq.，333mg， 1.81mmol)在dcm(20ml)中的溶液添加dcc(1.1eq.，342mg， 1.66mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌4小时。在浓缩后，将所述粗品溶解在dcm(75ml)中，通过硅藻土垫过滤，并用nahco3水溶液洗涤(2x 75ml)。将有机层用mgso4干燥并通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从环己烷/etoac 1/1到etoac，然后在10 分钟内etoac/meoh 95/5)，得到作为微黄油状物的53(875mg， 1.26mmol，83％)。
[0820]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ5.24(bs,1h),4.14(d,j＝8.0hz, 2h),3.87(t,j＝6.2hz,2h),3.69
–
3.57(m,20h),3.55(t,j＝5.0hz, 2h),3.42
–
3.28(m,2h),2.94(t,j＝6.2hz,2h),2.35
–
2.11(m,6h), 1.67
–
1.50(m,2h),1.41
–
1.29(m,1h),0.93(t,j＝9.7hz,2h)。
[0821]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ167.5,156.8,98.8,70.7
–
70.1,66.0, 62.7,40.8,34.4,29.1,21.4,20.1,17.8。
[0822]
54，((6-氯-1,3,5-三嗪-2,4-二基)双(4,34-二氧代-7,10,13,16,22,25,28,31
‑ꢀ
八氧杂-3,19,35-三氮杂三十七烷-19,1,37-三基)四氨基甲酸四叔丁酯
[0823]c75h140n13o28 mw＝1707.46g/mol
[0824][0825]
向20b(2.3eq.，615mg，0.77mmol)在乙腈(3ml)和diea (10eq.，0.554ml，3.35mmol)中的溶液添加三聚氯氰(1eq.，61.8mg，0.33mmol)，并将所述反应在室温搅拌5小时。在浓缩后，添加40mlnahpo
4 1m水溶液，并将混合物用dcm(3x 50ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并浓缩。将所述粗品通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从dcm到dcm/meoh 90/10)，得到作为透明黄油状物的54(380mg，0.22mmol，66％)。
[0826]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ6.96(bs,4h),5.32(bs,4h),3.80
ꢀ–
3.68(m,16h),3.61(dd,j＝17.7,9.8hz,56h),3.39
–
3.29(m,j＝ 5.1hz,8h),3.27
–
3.16(m,8h),2.45(t,j＝5.7hz,8h),1.42(s,36h)。
[0827]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ172.1,168.8,164.5,156.3,78.9, 70.5
–
70.1,69.1,68.8,67.1,48.1,47.7,40.3,39.6,36.8,28.4(12c)。
[0828]
55，3-((4,6-双(双(2,2-二甲基-4,9-二氧代-3,12,15,18,21-五氧杂-5,8-二氮杂二十三烷-23-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)丙酸甲酯
[0829]c79h148n14o30 mw＝1774.12g/mol
[0830][0831]
向54(1eq.，375mg，0.22mmol)和diea(10eq.，0.363ml， 2.20mmol)在乙腈(7ml)中的溶液添加3-氨基丙酸甲酯盐酸盐(8eq.， 245mg，1.76mmol)。将所述反应混合物在80℃搅
拌48小时。在浓缩后，添加70ml nah2po4水溶液(1m)，并将所述混合物用dcm(3x 75ml)萃取。将粗品通过硅胶快速谱进行纯化(在30分钟内从dcm 到dcm/meoh 9/1)，得到作为微黄油状物的55(330mg，0.19mmol， 85％)。
[0832]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ6.98(bs,4h),5.34(bs,4h),3.85
ꢀ–
3.47(m,77h),3.39
–
3.27(m,8h),3.28
–
3.14(m,8h),2.60(t, j＝6.2hz,2h),2.46(t,j＝5.7hz,8h),1.43(s,36h)。nh信号丢失。
[0833]
13
c nmr(cdcl3,100mhz)δ172.7,172.0,156.3,78.9,70.4
–ꢀ
70.1,69.4,69.2,67.1,51.5,47.6,40.3,39.6,36.8,36.3,34.3,28.4(12c)。
[0834]
56，3-((4,6-双(双(1-((1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)-3,8-二氧代
ꢀ‑
2,11,14,17,20-五氧杂-4,7-二氮杂二十二烷-22-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基) 氨基)丙酸甲酯
[0835]c103h164n14o30 mw＝2078.51g/mol
[0836][0837]
向55(1eq.，280mg，0.16mmol)在dcm/meoh 1/1(7.5ml) 中的溶液添加二噁烷中的4m hcl溶液(60eq.，2.37ml，9.47mmol)。将反应混合物搅拌5小时并浓缩。将所述粗品溶解在dmf(5ml)中，然后添加tea(10eq.，159mg，0.219ml，1.58mmol)和(1r,8s,9s)
‑ꢀ
双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯基)碳酸酯29(4eq.，199mg，0.63 mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌15小时。在浓缩后，添加50ml 水并将所述混合物用dcm(3x 50ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并浓缩。将所述粗品通过硅胶快速谱进行纯化(在35min内从 dcm到dcm/meoh 9/1)，得到作为微黄油状物的56(230mg，0.11 mmol，70％)。
[0838]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ7.01(bs,4h),5.60(bs,4h),5.33 (bs,1h),4.12(d,j＝7.9hz,8h),3.78
–
3.47(m,77h),3.42
–
3.31 (m,8h),3.33
–
3.20(m,8h),2.60(t,j＝6.2hz,2h),2.46(t,j＝ 5.5hz,8h),2.36
–
2.13(m,24h),1.56(d,j＝11.4hz,8h),1.32(dd, j＝18.6,10.3hz,4h),0.92(t,j＝9.6hz,8h)。
[0839]
57,3-((4,6-双(双(1-((1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)-3,8-二氧代
ꢀ‑
2,11,14,17,20-五氧杂-4,7-二氮杂二十二烷-22-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基) 氨基)丙酸
[0840]c102h162n14o30 mw＝2064.49g/mol
[0841][0842]
向56(1eq.，230mg，0.11mmol)在h2o/meoh 1/1(2ml)中的溶液添加lioh(5eq.，13mg，0.55mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌5小时。在meoh蒸发后，通过添加30ml nahpo
4 1m水溶液将水相酸化，并用dcm(3x 50ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并浓缩。将所述粗品通过硅胶快速谱进行纯化(在35分钟内从 dcm到dcm/meoh 85/15)，得到作为微黄油状物的57(125mg， 0.06mmol，55％)。
[0843]1h nmr(400mhz,d
6-dmso)δ7.87(s,4h),7.07(s,4h),6.69 (s,1h),4.03(d,j＝8.0hz,8h),3.54(dt,j＝11.1,7.3hz,74h),3.12
ꢀ–
3.04(m,8h),3.04
–
2.94(m,8h),2.49
–
2.41(m,2h),2.30(t,j ＝6.4hz,8h),2.18(dd,j＝28.0,12.0hz,24h),1.52(d,j＝10.5hz, 8h),1.33
–
1.25(m,4h),0.87(d,j＝9.1hz,8h)。
[0844]
58,3-((4,6-双(双(1-((1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)-3,8-二氧代
ꢀ‑
2,11,14,17,20-五氧杂-4,7-二氮杂二十二烷-22-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基) 氨基)丙酸全氟代苯基酯
[0845]c108h161
f5n
14o30 mw＝2230.54g/mol
[0846][0847]
向57(1eq.，125mg，0.06mmol)和五氟苯酚(1.2eq.，13.4mg， 0.07mmol)在dcm(0.52ml)中的溶液添加dcc(1.1eq.，13.7mg， 0.07mmol)。将所述反应混合物在室温搅拌4小时。在浓缩后，添加 30ml dcm，并将所述混合物通过硅藻土垫过滤，得到作为微黄油状
物的58(111mg，0.05mmol，90％)。
[0848]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ7.00(bs,4h),5.58(bs,4h),5.49 (bs,1h),4.12(d,j＝7.9hz,8h),3.79
–
3.49(m,74h),3.43
–
3.32 (m,8h),3.33
–
3.22(m,8h),3.00(t,j＝6.3hz,2h),2.46(t,j＝ 5.4hz,8h),2.36
–
2.13(m,24h),1.65
–
1.49(m,8h),1.40
–
1.28 (m,4h),0.92(t,j＝9.6hz,8h)。
[0849]
实施例8：通过氨基修饰的寡核苷酸与实施例7中描述的偶联试剂的反应制备化学探针
[0850]
材料和方法：
[0851]
氨基修饰的寡核苷酸购自idt。寡核苷酸偶联后的纯化使用 sunfire
tm
c18 5μm 4.6
×
150mm柱(waters)，在shimadzu系统(泵：lc 20-ad，检测器：spd 20-a，自动进样器：sil 20-a)上进行。hplc 参数如下：流速1ml/min，流动相a是三乙基乙酸铵(teaa)水溶液(50mm)，流动相b是teaa的乙腈溶液(50mm)。检测在260 nm处进行。梯度a：从0至30min从15至40％的流动相b。梯度b：从0至30min从15至35％的流动相b。梯度c：从0至30min从15 至50％的流动相b。
[0852]
用于寡核苷酸偶联的通用程序：
[0853]
在2ml eppendorf管中，引入氨基修饰的寡核苷酸(1nmol/μl 水溶液，1eq.)、偶联试剂53或58在乙腈中的溶液(10eq.)和nahco
3 (1m水溶液，250eq.)。终体积用乙腈调整，以获得1/1的水/乙腈比例。将所述混合物在室温和氩气气氛下温育过夜，然后直接进样到 hplc中进行纯化。寡核苷酸偶联的详细情况以及在微流体实验期间使用的氨基修饰的寡核苷酸的序列和它们的互补序列概述在下表中。
[0854]
寡核苷酸偶联和序列的详情。5amc12：5’氨基修饰物c12，icy5：内部cy5
tm
，3cy5sp：引入在承载树脂上的3’cy5
tm
，5atto488n：5
’ꢀ
atto
tm 488(nhs酯)，3atto488n：3’atto
tm 488(nhs酯)。
[0855][0856]
实施例9：通过本发明的方法捕获寡核苷酸靶标(化学探针：与靶标互补的寡核苷酸)
[0857]
1.材料和方法
[0858]
参见实施例2。
[0859]
实验装置和材料：
[0860]
流速通过注射泵(harvard apparatus phd 2000)来控制。使用 500μl/h的水相流速和500μl/h的含氟油相(3m novec 7500)流速来产生液滴(40-60pl)。乳液被收集在装有油的eppendorf管中，并用 pdms塞封闭以防止由于接触空气而聚结。对于通过spaac反应的生物分子接枝来说，在油相中使用2.5％w/w的叠氮化物表面活性剂 krytox-peg
12-二n
3 44和krytox-peg
16-四n
3 47。对于阴性对照实验来说，在油相中使用2.5％w/w的非功能化的表面活性剂(008-氟表面活性剂， ran biotechnologies)。对于水相来说，将基于bcn的寡核苷酸偶联物和它们的互补靶标溶解在cutsmart 1x(new england biolabs，参考号：b7204s)中。
[0861]
将w/o乳液重新注射在第二个芯片中并用含氟油(3m novec7500)隔开。使用200μl/h的novec 7500流速和100μl/h的乳液样品流速。
[0862]
共聚焦显微术：
[0863]
w/o乳液使用leica spe共聚焦显微镜进行分析(所使用的激光： 405nm(acms)，488nm(atto488衍生物)和635nm(磺基cy5 衍生物)，20x物镜，leica 11506513)。
[0864]
2.结果：
[0865]
在微液滴内表面处的寡核苷酸接枝。cy5-寡核苷酸在偶联到1或 4个bcn组成部分(59和63)后的接枝，使用krytox-peg
12-二n
3 44作为氟表面活性剂来确认(图30)。在两种情况下，在乳液重新注射期间获得的信号显示在所述液滴的前方和后方cy5荧光更高，表明所述寡核苷酸优选地位于水液滴的内表面处。这些结果得到共聚焦显微术的确认，其证实了cy5-寡核苷酸集中在微液滴内表面处。
[0866]
寡核苷酸接枝和互补寡核苷酸的捕获。为了模拟互补dna序列的捕获，通过将带有bcn组成部分的接枝寡核苷酸与互补的寡核苷酸序列共同包封，重复了所述实验(图31)。使用氟表面活性剂krytox-peg
12
‑ꢀ
二n
3 44，证实了单bcn和四bcn cy5-寡核苷酸偶联物(分别为59和63)的接枝和随后含有atto488荧光团的互补寡核苷酸的捕获。共聚焦显微术显示cy5和atto488荧光集中在微液滴内表面处，证实了所述bcn修饰的寡核苷酸被方便地接枝在内表面处，允许捕获互补寡核苷酸(图31a-b)。使用krytox-peg
16-四n
3 47作为氟表面活性剂、单bcn cy5-寡核苷酸61和互补的atto488-寡核苷酸62制备了第三种乳液。共聚焦显微术分析再次证实了成功的接枝和寡核苷酸捕获(图 31c)。最后，将事先偶联到bcn组成部分的寡聚dt 63接枝在微液滴内表面处，允许捕获atto488-多聚da寡核苷酸64(图31d)。这个结果显示出捕获在细胞内成熟过程后带有多聚da序列的总mrna的机会。
[0867]
阴性对照。为了证实所述反应的特异性，使用商品化的非功能化氟表面活性剂(008-f，ran biotechnologies)进行阴性对照。通过将单 bcn和四bcn cy5-寡核苷酸(分别为59和63)和相应的互补atto488
‑ꢀ
寡核苷酸(分别为60和62)共同包封来制备乳液。在两种情况下，cy5 和atto488荧光跨过所述水液滴均匀分布，证实了在没有叠氮化物氟表面活性剂的情况下spaac反应不能发生(图32a-b)。使用bcn-寡聚 dt 63和互补的atto-488多聚da 64获得了相同的结果(图32c)。
[0868]
实施例10：通过本发明的方法接枝抗体(曲妥珠单抗)
[0869]
1.化学探针的制备
[0870]
曲妥珠单抗通过其赖氨酸残基偶联到磺基cy5和bcn。磺基 cy5co2nhs购自interchim(参考号992779)。
[0871]
通用程序：在2ml eppendorf管中引入曲妥珠单抗(2.5mg/ml，在50mm ph 8硼酸盐缓冲液中，1eq.)、偶联试剂53的溶液(1.5mm，在dmso中，6eq.)和磺基cy5-co2nhs的溶液(1mm，在dmso 中，3eq.)。将所述混合物在室温温育过夜。然后将所述溶液按照供应商的推荐通过biospin p-30(biorad)进行纯化，获得曲妥珠单抗
ꢀ‑
cy5-bcn 66。
[0872]
2.根据本发明的化学探针的接枝
[0873]
材料和方法：参见实施例2.
[0874]
实验装置和材料：流速通过注射泵(harvard apparatus phd 2000) 来控制。使用500μl/h的水相流速和500μl/h的含氟油相(3m novec7500)流速来产生液滴(40-60pl)。乳液被收集在装有油的eppendorf 管中，并用pdms塞封闭以防止由于接触空气而聚结。对于通过spaac 反应的抗体接枝来说，在油相中使用2.5％w/w的叠氮化物表面活性剂 krytox-peg
12-二n
3 44。对于阴性对照实验来说，在油相中使用2.5％w/w 的非功能化的表面活性剂(008-氟表面活性剂，ran biotechnologies)。对于水相来说，将曲妥珠单抗-cy5-bcn 66和acms溶解在cutsmart 1x(new england biolabs，参考号：b7204s)中。
[0875]
共聚焦显微术：w/o乳液使用leica spe共聚焦显微镜进行分析 (所使用的激光：405nm(acms)和635nm(磺基cy5衍生物)， 20x物镜，leica 11506513)。
[0876]
结果：曲妥珠单抗-cy5-bcn 66的接枝使用krytox-peg
12-二n
3 44作为氟表面活性剂来确认(图33)。通过共聚焦显微术进行的液滴分析显示曲妥珠单抗-cy5集中在微液滴的内表面处，而对照荧光团 (acms)跨过所述液滴均匀分布(图33a)。这个结果证实了所述抗体在微液滴表面处的成功接枝。使用商品化的非功能化氟表面活性剂 (008-f，ran biotechnologies)进行阴性对照。在这种情况下，共聚焦显微术揭示出，如同对照荧光团(acms)，曲妥珠单抗-cy5-bcn 67不被接枝在微液滴表面处，证实了所述反应只在使用叠氮化物氟表面活性剂时才能发生(图33b)。
[0877]
实施例11：标记的rna的捕获和通过液滴反转进行它们的纯化
[0878]
在这个实验中，制备并纯化了荧光标记的970-nt长的gapdhmrna片段，然后i)将它在大大过量的非特异性rna存在下在稳定化缓冲液中稀释，ii)将所述溶液分散在油包水液滴中，在所述液滴中 iii)rna被捕获在液滴内表面处，最后iv)从所述反应混合物纯化靶 rna。
[0879]
序列
[0880]
[0881]
[0882][0883]
*所述dna通过包含在从哺乳动物hela细胞提取的总rna级分中含有的gapdh mrna的基因特异性反转录获得。将cdna克隆在puc18 载体中并通过sanger测序验证它的序列(gatc biotech)。
[0884]
**t7启动子被下划线并用大写字母示出。
[0885]
dna寡核苷酸5按照实施例8中描述的程序，通过其5’末端胺官能团用偶联试剂53修饰。
[0886]
微流体芯片制备和操作
[0887]
微流体装置使用先前在(mazutis等，2009.anal chem 81: 4813-4821)中所描述的经典的复制成型工艺来获得。简单来说，在autocad(autodesk 2014)上设计装置，打印负光掩模(selba s.a.)，并将其用于通过标准的光蚀刻方法制备模具。使用su8-2025光刻胶 (microchem corp.)在硅晶圆(siltronix)上制造40μm深的通道图案。然后使用常规的软蚀刻方法(xia和whitesides 1998.annu rev matersci 28:153-184)在聚二甲基硅氧烷(pdms，silgard 184，dow-corning) 中制造微流体装置。通过将所述微流体芯片加热至90℃并注入熔融的 51in/32.5bi/16.5sn低温焊料(indium corporation,singapore)，将造型的电极用金属填充(siegel等，2007.adv mater 19:727-733)。最后，用金属丝短片(radiospares)制造带有焊料的电接头。微流体装置的主要尺寸和深度提供在相关的图上和它们的说明中。
[0888]
水相被装载在i.d.0.75mm ptfe管路(thermo scientifc)中，油被装载在2ml micrew管(thermo scientific)中。使用装备有允许以流速受控模式运行的flowells(7μl/min流量表)的7-bar mfcs
tm
压力驱动的流动控制器(fluigent)，将液体以恒定且高度受控的流速注入到微流体装置中。
[0889]
光学装置、数据获取和控制系统
[0890]
光学装置是基于安装在减震平台(thorlabs b75150ae)上的倒置显微镜(nikon eclipse ti-s)。将375nm激光(crystalaserdl375-020-o)和488nm激光(crystalaser dl488-050-o)的光束使用二向镜(semrock di02-r405-25x36)合并，使用一对透镜(semrocklj1878l2-a和lj1567l1-a)塑形为线状并导入到显微镜物镜(nikonsuper plan fluor 20x elwd或nikon super plan fluor 40x elwd)中，以聚焦在通道中间检测点处。发射的荧光由同一物镜收集并通过多边缘二向镜(semrock di01-r405/488/561/635-25x36)与激光光束分开。通过第三个二向镜(semrock lm01-480-25)将蓝(7-氨基香豆素
ꢀ‑
4-甲磺酸)荧光与绿(atto488-rna)和橙(tamra)荧光分解开。然后通过另外的二向镜(semrock ff562-di03-25x36)将绿荧光与橙荧光分解开。最后，通过装备有带通滤波器(semrockff01-445/45-25、ff01-600/37-25和ff03-525/50-25，分别用于蓝光、绿光和橙光检测)的三个光电倍增管(hamamatsu h10722-20)测量荧光。来自于pmt的信号获取使用智能数据获取(daq)模块来进行，所述模块的特点是由内部开发的固件和软件驱动的可用户编程的 fpga芯片(national instruments pci-7851r)。为了监测所述实验，我
们使用了另外的二向镜(semrock ff665-di02-25x36)将光分向 ccd相机(allied vision technologies guppy f-033)。长通滤光片 (semrock blp01-664r-25)防止潜在损伤性的激光反射进入所述相机。
[0891]
标记的靶rna的制备
[0892]
对模板dna 1进行pcr扩增：将10ng 1混合在含有0.2μm 2、 0.2μm 3、0.2mm每种dntp(thermo scientific)、1μl phire dna聚合酶(thermo scientific)和供应的缓冲液的扩增混合物中(总体积＝ 50μl)。然后使用98℃下30sec的初始变性，随后是98℃下5sec、 55℃下30sec和72℃下90sec的25个循环，最后是72℃下120sec的延伸步骤，来扩增dna 1。然后使用wizard sv凝胶和pcr clean-up 系统(promega)，遵照供应商的说明书纯化所述dna，并洗脱在无 dnase/无rnase的去离子水中。然后通过测量溶液的od
260nm (nanodrop)对纯化的dna进行定量。
[0893]
然后在atto488-utp存在下，使用试剂盒atto488 rna标记试剂盒(jena bioscience)，按照供应商的推荐转录2500ng扩增并纯化的模板dna 1。正确的转录通过琼脂糖凝胶电泳来评估(数据未示出)，并在通过苯酚抽提清除蛋白质后将预期大小的rna凝胶纯化。为此，将100μl反应混合物与100μl载样缓冲液(甘油20％，tbe 1x，尿素8m，溴酚蓝)混合，然后载样到1％琼脂糖凝胶的tbe上，在130v 下在tbe缓冲液中进行35min的迁移。在迁移后，在uv照射下鉴定含有rna的条带，将其从凝胶切下，并置于一定长度的透析袋(截留值＝6000-8000，spectrapore)中，装入无核酸酶的水，并用推荐的夹子封闭。然后通过将所述拼合物浸泡在tbe溶液中，在95v dc场中经历60min，将标记的rna从所述凝胶洗脱。然后将含有洗脱的rna 的水相在70％乙醇、300mm乙酸钠中和glycoblue载体(invitrogen) 存在下沉淀。离心后，将沉淀物用70％乙醇清洗，然后重悬浮在15％ dmso中。最后，通过测量构成rna 4的溶液的所述溶液的od
260nm (nanodrop)，对所述rna进行定量。
[0894]
rna包封和捕获
[0895]
实验程序
[0896]
将25nm标记的rna 4的溶液与200nm含有bcn的捕获dna 5 在稳定化缓冲液kp(25mm mes ph 6，2mm edta，100mm nacl 和0.4mg/ml bsa)中的溶液混合。向所述混合物进一步增补4mg/ml 竞争性酵母总rna(ambion)和5μm 7-氨基香豆素-4-甲磺酸(用作液滴示踪剂)。将所述混合物装入一定长度的ptfe管路(i.d.0.75mm 管路；thermo scientifc)中，并将所述管路的一端连接到fluigent输注装置，并将所述管路的另一端连接到液滴发生器(图34)。将由增补有2.5％ krytox-peg
16-四n
3 47表面活性剂的novec 7500构成的油相输注到所述装置的第二入口中，并用于通过以1500nl/min输注水相并以 1900nl/min输注油相，以每秒3500个液滴的速率产生40pl的液滴。将液滴通过一定长度的管路收集在用pdms塞封闭的0.2ml pcr管中，共收集20min。然后将所述乳液在85℃下温育5min，随后在50 ℃下温育5min，最后一步在25℃下温育5min。
[0897]
结果
[0898]
在25℃下短暂温育20min后，将所述乳液在共聚焦系统(zeisslsm 780)上成像。在图35上，绿环的形成证实了所述rna捕获在液滴的内表面处，而香豆素染料(蓝)保持扩散在所述液滴中。
[0899]
通过液滴反转进行的rna纯化
[0900]
实验程序
[0901]
将展现出被捕获的rna的油包水(w/o)液滴重新注射到相反转装置中(图36)并以350nl/min输注，以便以每秒165个液滴的速率重新注射。通过以400nl/min输注无表面活性剂的novec-7500油液流将w/o液滴分隔开，并通过用以1300nl/min输注的水相流(0.1％ tween 20，10mm hepes ph7.4和5μm tamra)夹挤得到的液流，产生双重(水包油包水，w/o/w)乳液。使用这些设置，每个40pl w/o 液滴被单个地转变成100pl(40pl w/o液滴+60pl油)，每个w/o/w 液滴具有不超过1个w/o液滴，其中90％左右的所述o/w液滴被占据。
[0902]
然后，使用连接到高压放大器(trek model 623b)的函数发生器向一对电极施加正方形ac场(2500v，30hz)，当w/o/w液滴在所述电极对之间通过时，被转变(反转)成水包油(o/w)液滴。液滴被收集在0.5ml管中的水下。
[0903]
结果
[0904]
使用这个程序，高达90％的所述o/w液滴被占据，并且高达95％的这些被占据的液滴被成功转变成o/w液滴。此外，尽管最初包含在所述w/o中的香豆素被反转过程清除，被捕获的绿荧光的rna仍固定化在所述液滴的外表面处(图37)。

技术特征：

1.一种功能化的表面活性剂，其包含式(ib)的组成部分或由式(ib)的组成部分构成：其中：-a和b是独立地选自1至5的整数，-每个lipo是亲脂尾部，其独立地选自任选地被一个或多个杂原子中断并任选地被选自c
1-c3烷基、卤素如f、cl或br、-oh、-ome和-cf3的一个或多个基团取代的饱和或不饱和烃链，全氟聚醚链，全氟化碳链及其组合，-hydro是亲水头部，其包含独立地选自二吗啉磷酸酯基团、聚醚、聚醚胺、聚甘油及其组合的组成部分，-每个funct是功能性组成部分，其包含选自以下的基团：生物素、链亲合素、亲和素、以及能够通过点击化学或通过生物偶联反应产生共价键的化学反应性基团例如叠氮基或炔基，并且-一方面lipo和hydro，另一方面hydro和funct，直接连接或通过接头基团或连接物连接。2.权利要求1的功能化的表面活性剂，其中：-每个lipo包含下述组成部分(l1)或由下述组成部分(l1)构成：其中n是25至45、优选地35至40的整数，并且-hydro包含一个或多个聚乙二醇链，其包含2至30个、优选地2至10个单体。3.权利要求1-2任一项的功能化的表面活性剂，其包含：-一个或两个lipo，其包含式(l1)的组成部分或由式(l1)的组成部分构成：其中n是25至45的整数，以及-hydro，其带有至少一个式(h2)的组成部分
其中d是1至12的整数。4.权利要求3的功能化的表面活性剂，其具有以下各式之一：-其中e是1至12的整数，并且x1和y1独立地选自nh、ch2和o；-其中y2和y3独立地选自nh、ch2或o，并且x2、x3和x4独立地选自ch和n，以及-其中οx2、x3和x4独立地选自ch和n，οy8是ch或n，οy4、y5、y6和y7独立地选自nh、o和ch2，并且οe1和e2是独立地选自1至12的整数，其中l1和h2如权利要求3中所定义。5.权利要求3或4的功能化的表面活性剂，其选自：
其中n是25至45、优选地35至40的整数，并且d是1至12、优选地2至6的整数。6.权利要求1-2任一项的功能化的表面活性剂，其是式(ic)的表面活性剂：其中lipo、hydro和funct如权利要求1-2任一项中所定义，并且a是1、2或3。7.权利要求6的功能化的表面活性剂，其是式(ii)的二嵌段表面活性剂：其中：
‑
n是25至45、优选地35至40的整数，-p和q是独立地选自1至10、优选地2至8的整数，-y1和y2选自-o-、-nh2、-c(＝o)-、oc(＝o)、(c＝o)o、nhc(＝o)、c(＝o)nh、nhc(＝o)nh、nhc(＝o)o和oc(＝o)nh，并且-funct包含选自生物素、叠氮基和炔基例如具有环张力的炔基的组成部分。8.权利要求7的功能化的表面活性剂，其选自：(i)其中n＝35-40，p＝5并且q＝4，(ii)其中n＝35-40，p＝q＝5(iii)其中n＝35-40，p＝q＝5，和(iv)其中n＝35-40，p＝5，q＝4。9.权利要求6的功能化的表面活性剂，其是式(iiia)的表面活性剂：其是式(iiia)的表面活性剂：其中-p和q是独立地选自1至10、优选地2至8的整数，-krytox是其中n为25至45，优选地n＝35-40，
‑
funct包含选自生物素、叠氮基、炔基例如具有环张力的炔基的组成部分。10.权利要求9的功能化的表面活性剂，其选自：(i)其中n＝35-40并且p＝6、5或4，和(ii)其中n＝35-40，并且p＝6、5或4。11.一种在用于捕获分子靶标的方法中使用的试剂盒，所述试剂盒包含：-权利要求1至10任一项中所定义的功能化的表面活性剂；和-化学探针，其包含至少(i)一个能够特异性结合到所述分子靶标的捕获组成部分，和至少(ii)一个能够直接或间接地结合到所述功能化的表面活性剂的结合结构域。12.权利要求11的试剂盒，其中所述化学探针的捕获组成部分选自所述分子靶标的抗体、镜像异构适体、肽适体、适体、配体或底物，能够杂交所述分子靶标的核酸，以及能够结合所述分子靶标的受体片段。13.权利要求11或12的试剂盒，其中：-所述表面活性剂的功能化的亲水头部包含叠氮基并且所述化学探针的结合结构域包含具有环张力的环炔基，或者反之亦然，或者-所述表面活性剂的功能化的亲水头部包含亲和素或链亲合素基团并且所述化学探针的结合结构域包含生物素，或者反之亦然。14.权利要求11至13任一项的试剂盒，其还包含：-能够结合所述化学探针和功能化的表面活性剂两者，由此在所述两个实体之间充当桥的结合中间体；和/或-非功能化的表面活性剂；和/或-水相；和/或-油相；和/或-为使用这种试剂盒提供指导的小册子，和/或-微流体芯片，其优选包含：o用于产生油包水乳液液滴或重新注射油包水乳液的模块，o与所述用于产生油包水乳液液滴或重新注射油包水乳液的模块流体连通并在其下游
的用于产生双重乳液的模块，以及o与所述用于产生双重乳液的模块流体连通并在其下游的相反转模块。15.权利要求11至14任一项中所定义的试剂盒在用于捕获分子靶标的方法中的用途，所述方法包括：a)提供油包水乳液液滴，所述乳液液滴在所述液滴的界面处包含来自所述试剂盒的功能化的表面活性剂；b)将所述功能化的表面活性剂与存在于或添加到所述液滴的水相中的来自所述试剂盒的化学探针接触；以及c)将所述功能化的表面活性剂与存在于或添加到所述液滴的水相中的所述分子靶标接触，由此通过(i)所述化学探针与所述功能化的表面活性剂的直接或间接结合和(ii)所述化学探针与所述分子靶标的特异性结合，将所述分子靶标捕获在所述乳液液滴的内界面处，并且其中步骤b)和c)同时或以任何次序顺序进行。

技术总结

本发明涉及用于捕获分子靶标的液滴内表面工程。具体地，本发明涉及一种用于捕获存在于油包水乳液的水相中的分子靶标的方法，所述方法基于使用结合系统，所述结合系统包含(a)在亲水头部基团上带有功能性组成部分的表面活性剂，和(b)充当所述功能化的表面活性剂与所述分子靶标之间的分子订书钉的化学探针，所述化学探针包含至少两个不同结构域，即(i)至少一个捕获组成部分，其能够特异性结合所述分子靶标，和(ii)至少一个结合结构域，其能够通过共价或非共价相互作用直接地或通过结合中间体与所述表面活性剂的功能基团相互作用。间体与所述表面活性剂的功能基团相互作用。间体与所述表面活性剂的功能基团相互作用。

技术研发人员：

阿兰

受保护的技术使用者：

法国国家科学研究中心 化学前沿国际研究中心

技术研发日：

2017.04.04

技术公布日：

2022/11/22